Введение к работе
Актуальность
Согласно данным ВОЗ, смертность от сердечно-сосудистых заболеваний занимает первое место в мире. Факторы, которые приводят к нарушению работы сердца, многочисленны, но все они, так или иначе, влияют на сократительную функцию кардиомиоцита. Нарушение сократительной функции кардиомиоцита может происходить из-за изменения состава белков сократительного аппарата или вследствие разобщения процессов сопряжения возбуждения с сокращением.
Как известно, генерация силы в мышце осуществляется за счет энергии гидролиза АТФ поперечными мостиками, образованными головками миозиновых молекул, прикрепленными к нитям актина. В сердце млекопитающих имеется два типа тяжелых цепей миозина (ТЦМ): аир [Hoh et al.,1977]. Изоформа миозина VI является гомодимером а-тяжелых цепей, а изоформа миозина V3 - гомодимером р-тяжелых цепей. По аминокислотной последовательности VI и V3 изомиозины идентичны на 93 % [Alpert et al., 2002]. Разница в аминокислотных последовательностях между а- и р-ТЦМ определяет различие их кинетических и механических свойств [Alpert et ai., 2002; Krenz et al., 2007].
В рамках интактного сердца имеется заметное различие в экспрессии изоформ миозина VI и V3 в кардиомиоцитах из разных слоев стенки желудочка [Eisenberg et al., 1985; Litten et al., 1985; Carnes et al., 2004; Reiser et al., 2001]. Экспрессия этих изоформ миозинов зависит от вида животного, его возраста и гормонального статуса [Lompre et al., 1979]. Изменения в экспрессии изоформ происходят также при Патологиях сердца [Lompre et al., 1979; van der Velden et al., 1999; Miyata et al., 2000].
Изоформы сердечного миозина отличаются по своим гидролитическим и механическим характеристикам [Sata et al., 1993; Harris et al., 1994; VanBuren et al., 1995; Noguchi et al., 2003; Malmqvist et al., 2004]. На уровне взаимодействия одиночных молекул миозина и актина обнаружено, что изомиозины VI и V3 отличаются только длительностью единичных перемещений нитей актина [Sugiura et al.,1998; Palmiter et al., 1999].
Наличие изоформ сердечного миозина является приспособлением для оптимизации сократительной функции сердца. Левый желудочек сердца взрослого человека содержит около 7 % а-тяжелых цепей миозина [Miyata et al., 2000]. При ишемической и дилатационной кардиомиопатаи а-изоформа не обнаруживается [Reiser et al., 2001], что снижает сократимость, но повышает экономичность сокращения [AlpertNR, 1972].
В первой половине 90-х годов были обнаружены мутантные формы (3-цепи миозина (сейчас их известно более ста), приводящие к выраженным клиническим симптомам гипертрофической либо дилатационной кардиомиопатаи, которые могут приводить к внезапной смерти [Schmitt et al., 2006].
Различие в соотношениях изоформ VI и V3 в кардиомиоците, прежде всего, прямо проявляется в различных скоростных характеристиках развития напряжения. Кроме того, очень важен вклад, который разные соотношения изомиозинов вносят в механическую функцию в миокарде через кооперативное влияние прикрепленных поперечных мостиков на сродство тропонина С к кальцию (через механизм мостико-тропониновой кооперативности). Это кооперативное взаимодействие регуляторных и сократительных белков является ключевым механизмом, объясняющим целый ряд феноменов биомеханики активного миокарда, связанных с влиянием механических условий сокращений на активацию сердечной мышцы [Izakov et al., 1991].
Влияние изоформ сердечного миозина на кальциевую регуляцию сокращения сердечной мышцы изучалось в экспериментах на скинированных кардиомиоцитах и препаратах сердечной мышцы [Fitzsimons et al 1998; Metzger et al, 1999; Rundel et al. 2004, 2005; Krenz et al., 2007; Stelzer et al. 2007, 2008]. В настоящем имеется только одна работа по изучению вклада изоформ сердечного миозина в кальциевую регуляцию сокращений миокарда методом искусственной подвижной системы [Noguchi et al., 2003]. Имеющаяся на сегодня информация о вкладе изоформ сердечного миозина в кальциевую регуляцию сокращения сердечной мышцы являются неполной и противоречивой.
Использование метода искусственной подвижной системы позволяет изучать непосредственно взаимодействие регуляторных и сократительных белков на уровне
тонкого филамента, что дает возможность избежать артефактов, связанных с пассивньїмі механическими свойствами целой мышцы, либо кардиомиоцита. В рамках этого метод, можно задавать различные концентрации свободного кальция и регистрировать связі-«рСа-скорость», «рСа-сила», «сила-скорость» на уровне взаимодействующих белков.
Цель работы
Провести систематическое исследование функциональных характеристик изоформ сердечного миозина кролика и оценить их вклад в кальциевую регуляции: сокращений сердечной мышцы.
Задачи исследования
-
Исследовать функциональные свойства изоформ сердечного миозина кролика VI и V3, а именно: актин-активируемую Mg^-АТФ-азную активность, силогенерирующие и кинетические характеристики.
-
В искусственной подвижной системе с регулируемым тонким филаментом исследовать зависимости «рСа-скорость», «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина VI и V3.
-
Исследовать связь «сила-скорость» для изоформ сердечного миозина VI и V3 при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция в растворе методом искусственной подвижной системы с регулируемым тонким филаментом.
-
Получить и проанализировать зависимость «сила-мощность» для изоформ сердечного миозина VI и V3 при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция в растворе.
-
Проанализировать вклад изоформ сердечного миозина VI и V3 в кальциевую регуляцию сокращений сердечной мышцы.
Научная новизна
Впервые систематически исследованы функциональные характеристики изоформ VI и V3 сердечного миозина кролика, используя метод искусственной подвижной системы. Получена и проаналюирована связь «рСа-скорость» для шоформ сердечного миозина VI и V3. Показано, что кальциевая чувствительность и коэффициент Хилла зависимости «рСа-скорость» для изоформ VI и V3 сердечного миозина не отличаются.
Впервые изучена связь «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина VI и V3. Показано, что при низкой концентрации каждой из изоформ как коэффициент ксоперативности, так и кальциевая чувствительность выше для V3, чем для VI, что может иметь адаптивное значение при патологиях, связанных со снижением концентрации миозина.
Впервые на уровне взаимодействующих ансамблей молекул сократительных белков показано, что основные характеристики зависимостей «сила-скорость» и «сила-мощность» сокращения кардиомиоцита и сердечной мышцы в целом определяются свойствами изоформ миозина.
Научная и практическая значимость
Получены новые данные о роли изоформ сердечного миозина в кальциевой регуляции сокращения сердечной мышцы. С помощью метода искусственной подвижной системы показано, что механические свойства сокращения кардиомиоцита и сердечной мышцы в целом определяются составом тяжелых цепей изоформ сердечного миозина. Эти новые данные необходимы для понимания работы сердечной мышцы в норме и ее нарушениях при патологиях сердца, приводящих к изменению состава тяжелых цепей миозина.
Внедрение
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре экспериментальной физики физико-технического факультета Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н.Ельцина; на кафедре нормальной физиологии ГОУ ВПО «Уральской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России».
Положения, выносимые на защиту
1. Значения коэффициента кооперативное Хилла зависимости «рСа-сила» для изоформ сердечного миозина VI и V3 в искусственной подвижной системе при высокой концентрации миозина не отличаются, кальциевая чувствительность выше для изоформы V3; при низкой концентрации каждой из изоформ как коэффициент кооперативное, так и кальциевая чувствительность выше для V3, чем для VI.
-
Зависимость «сила-скорость» для изоформ VI и V3 в искусственной подвижной системе при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция соответствует гиперболическому уравнению Хилла в области малых нагрузок и отклоняется от него в области больших нагрузок; зависимости «сила-скорость» для изоформ VI и V3 отличаются при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция; изоформный состав миозина определяет форму связи «сила-скорость» в мышечных препаратах.
-
Максимум развиваемой мощности изоформы VI выше, чем изоформы V3 и сдвинут в сторону меньших нагрузок при насыщающей и ненасыщающей концентрациях кальция, что может иметь адаптивное значение для поддержания мощности на заданном уровне; мощность, развиваемая каждой из изоформ миозина, не зависит от концентрации свободного кальция во всем диапазоне нагрузок.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на международных конференциях «Biological motility: Basic research and practice» (r. Пушино,
-
г.); «Biological motility: Achievements and Perspectives» (г. Пушино, 2008 г.); «Biological motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (г. Пушино, 2010 г.); на Международном форуме по нанотехнологиям (г. Москва, 2008 г.); на XXXTV и XXXVI «European Muscle Congress» (г. Дебрецен, Венгрия, 2005 г.; Стокгольм, Швеция,
-
г.); Joint British-Russian Young Scientists Workshop (Екатеринбург, 2007 г.).
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК - 7 публикаций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы (188 источников). Диссертация изложена на 151 странице, содержит 20 рисунков.
Работа была выполнена при поддержке фантов РФФИ, Программы фундаментальных исследований Президиума РАН, гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущей школы РФ, HHMI и ИНТАС.
Автор приносит благодарности д.ф.-м. н. Кацнельсону Л.Б. за консультации при построении связей «рСа-скорость», «рСа-сила», «сила-скорость» и обсуждению полученных результатов; Щепкину Д.В. за помощь в проведении экспериментов;
к.б.н. Машанову Г.И. за любезно предоставленную программу записи и обработки видеоизображения; Бершицкому Б.Ю. за техническую поддержку экспериментов.
