Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Функциональная значимость сигнальных молекул 9
1.2. Влияние гормонов на иммунологическую реактивность 30
Глава 2. Материал и методы исследования 41
2.1. База исследования 41
2.2. Описание гормонов, используемых в работе 42
2.3. Статистическая обработка результатов исследования 50
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 51
3.1. Разработка метода выявления влияния гормона на функциональную активность рецепторов фенотипов лимфоцитов 51
3.2. Влияние гормонов на реакцию фенотипирования лимфоцитов...56
3.3. Влияние гормонов на содержание фенотипов клеток в зависимости от пола обследуемых людей 77
3.4. Влияние уровня фоновой активности иммунитета на результаты фенотипирования лимфоцитов 85
Заключение 93
Выводы 103
Список литературы
- Функциональная значимость сигнальных молекул
- Влияние гормонов на иммунологическую реактивность
- База исследования
- Разработка метода выявления влияния гормона на функциональную активность рецепторов фенотипов лимфоцитов
Введение к работе
Актуальность исследования. Эндокринная система и система иммунной защиты настолько тесно функционально связаны друг с другом, что представляются во многих отношениях единым комплексом, обеспечивающим защиту организма от чрезвычайных воздействий [5, 101, 114, 128]. Эволюция рецепторов идет по пути конкретизации специфичности, хотя целые группы гормонов пользуются одним и тем же внеклеточным рецептором [38, 39, 86]. Так рецептор соматотропного гормона входит в то же семейство рецепторов, что и рецепторы пролактина, ИЛ-2,3,4,6,7, а также эритропоэтина, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. Рецептор андрогенов принадлежит к семейству лиганд-чувствительных рецепторов транскрипции, в которые входят рецепторы ретиноидов и тиреоидных гормонов. Резкое увеличение содержания гормона может приводить к срыву специфичности, когда гормон связывается не только со своим специфическим рецептором, но и с рецептором, близким по структуре [36, 39,49].
Одним из механизмов регуляции активности каталитических, пластических, метаболических процессов, процессов пролиферации и дифференцировки гормонами, является изменение чувствительности клетки к регулирующим факторам. Механизм регуляции этих состояний может быть осуществлен на пререцепторном уровне, путем блокады рецептора или внутриклеточно. Это разделение схематично и, более того, не совсем верно, ибо многие гормоны могут влиять на свободные рецепторы, на рецепторы в составе клеточной мембраны и даже внутриклеточно [13, 25, 38, 55]. В соответствии с вышесказанным представляло интерес изучение влияния гормонов на иммунное взаимодействие моноклональных антител и соответствующего рецептора (антигена).
Гормональное влияние на иммунные процессы распространяется на все этапы развития иммунной реакции на антиген, в том числе и на клеточные, и
5 гуморальные. Но вопросы взаимодействия гормонов и иммунокомпетентных клеток практически не решены, известны лищь последствия этого взаимодействия. Трудности изучения данных процессов объясняются наличием клеточной кооперации, множественности механизмов запуска иммунного ответа, преемственности последующего этапа от предыдущего и взаимодействием по типу обратной связи [71, 74, 75, 86, 98]. Изолировать эти процессы в современных условиях не представляется возможным. Однако развитие реакции от момента презентации антигена все-таки в основном зависит от исходного состояния и содержания основных иммунокомпетентных клеток в организме.
Изучение влияния биологически активного вещества на состояние клеточных рецепторов, предопределяющих этап развития иммунной реакции, обеспечивает возможность изучения непосредственного влияния гормона на рецепторную активность клетки.
Цель исследования: определить влияние гормонов на взаимодействие антител и антигенов поверхности лимфоцита, применив способ фенотипирования лимфоцитов моноклональными антителами, в процессе активизации, пролиферации и дифференцировки лимфоцитов.
Задачи исследования:
Модифицировать метод фенотипирования лимфоцитов моноклональными антителами для изучения влияния биологически активных веществ (гормонов) на рецепторную активность иммунокомпетентных клеток.
Изучить влияние кортизола, тироксина, окситоцина и прогестерона, эстрадиола, тестостерона на содержание сигнальных молекул (CD) на мембране Т-лимфоцитов.
Изучить влияние кортизола, тироксина, окситоцина и прогестерона, эстрадиола, тестостерона на содержание сигнальных молекул (CD) на мембране В-лимфоцитов.
Установить взаимосвязь влияния гормонов на рецепторную активность клеток от исходного иммунного фона и пола обследуемых людей.
Положения, выносимые на защиту:
Введение используемых в работе гормонов в реактивную смесь иммунопероксидазной реакции фенотипирования лимфоцитов до моноклональных антител, обуславливает неспецифическое снижение активности (содержания) рецепторов Т- и В-лимфоцитов.
Неспецифическая ингибиция гормоном активности взаимодействия рецептора лимфоцита и соответствующих антител зависит от исходного уровня содержания лимфоцитов, их активированных форм (который выше у лиц мужского пола), составляя практически постоянную часть.
Выявлено специфическое стимулирующее влияние гормонов на эффективность взаимодействия рецепторов лимфоцитов и антител к ним. Активность взаимодействия антигенов HLA DR II выше под влиянием кортизола, эстрадиола и тестостерона. Взаимодействие антител с CD23 повышают прогестерон, окситоцин, эстрадиол и тестостерон. Гормон щитовидной железы тироксин оказывает стимулирующее влияние только на реакцию с CD22.
Научная новизна исследования. Впервые установлено, что введение в стандартную иммунопероксидазную реакцию фенотипирования лимфоцитов дополнительного объема раствора гормона (кортизола, тироксина, прогестерона, окситоцина, эстрадиола, тестостерона) в дозе, соответствующей верхней границы нормы у человека, вызывает неспецифическое снижение эффективности взаимодействия антиген-антитело специфическую
7 стимуляцию, характерную для конкретного гормона. Установлено, что кортизол, эстрадиол и тестостерон повышают эффективность реакции идентификции молекулы HLA DR класса II, тироксин стимулирует взаимодействие с CD22, прогестерон, окситоцин, эстрадиол и тестостерон повышают активность реакции с CD23.
Научно-практическая значимость исследования.
Разработан метод выявления влияния гормонов или других биологически активных веществ в условиях in vitro на взаимодействие антигена и антитела. Получены новые данные о влиянии гормонов эстрадиола, тестостерона, прогестерона, окситоцина, тироксина, кортизола на результаты иммунопероксидазной реакции в условиях in vitro.
Материалы диссертации рекомендуются для использования в учебном процессе на кафедрах физиологии, клинической иммунологии и биохимии высших учебных заведений, а также в научно-экспериментальных исследованиях в области иммунологии.
Диссертационное исследование выполнено в соответствии с комплексным планом НИР Института физиологии природных адаптации УрО РАН (номер государственной регистрации 0120.0601941).
Работа поддержана грантом научных проектов молодых ученых и аспирантов УрО РАН «Иммуномодулирующее влияние гормонов на содержание фенотипов лимфоцитов» (постановление Президиума УрО РАН №1-6 от 15.01.2009).
Апробация работы и публикации. Материалы и основные положения работы докладывались и обсуждались на заседаниях Ученого Совета Института физиологии природных адаптации УрО РАН (Архангельск, 2007-2009); заседании проблемной комиссии по медико-биологическим наукам Поморского государственного университета имени М.В. Ломоносова (Архангельск, 2010); международной конференции «World immune regulation meeting -II» (Davos, Switzerland, 2008); IV Сибирском
8 физиологическом съезде (Барнаул, 2008); «Днях иммунологии» (Санкт-Петербург, 2008); II Съезде физиологов СНГ (Кишинев, Молдова, 2008); симпозиуме с международным участием «Проблемы адаптации человека к экологическим и социальным условиям Севера» (Сыктывкар, 2008); Первом Тихоокеанском симпозиуме «Живое и неживое: вещественные и энергетические взаимодействия» (Владивосток, 2008); конференции в рамках III международного полярного года (Санкт-Петербург, 2008); X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии, посвященный 100-летию со дня рождения академика АМН А. Д. Адо» (Казань, 2009); VTI конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной, клинической иммунологии и аллергологии» (Архангельск, 2009); IV съезде физиологов Урала (Екатеринбург, 2009), XTV Всероссийском Конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2009), Архангельском отделении физиологического общества имени И.П. Павлова (Архангельск, 2010).
По материалам работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 6 в рецензируемых журналах и 1 в составе монографии.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение), заключения, выводов. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 30 рисунками. Список литературы включает 237 источников, из них 100 отечественных и 137 зарубежных источника.
Функциональная значимость сигнальных молекул
Структурной единицей иммунной системы является лимфоцит; популяция лимфоцитов функционально неоднородна. Эта разновидность является отражением различных этапов созревания и дифференцировки данных клеток, общее содержание которых составляет 19-37% (1,2 - 3x109 кл/л). Выявление на поверхности лимфоцита дифференцирующих маркеров осуществляется посредством моноклональных антител. Подобное фенотипирование клеток позволяет проследить основные этапы пролиферации клеток и их дифференцировку. Метод получения моноклональных антител, синтезируемых гибридомами, разработан и предожен в 1975 году Дж. Келером и С. Мильстейном. Получаемые антитела обладают высокой специфичностью [60, 86, 100, 157].
В процессах созревания и дифференцировки лимфоцитов идет изменение рецепторного аппарата. Наличие на поверхности лимфоцита соответствующих молекул, дифференцирующих маркеров (Claster Differention - CD) позволяет различать фенотипы лимфоцитов.
Антиген CD3 представлен на функционально активных Т-лимфоцитах; в ассоциации с Т-клеточным рецептором участвует в передаче сигнала в цитоплазму, в регуляции синтеза и секреции IL-2, пролиферации и запрограммированной клеточной гибели клеток [75, 94, 133, 126], при одновременной экспрессии с CD4+ Т-лимфоцит активизирует В-клетки [75, 189].
Принимает участие в распознавании антигена, ассоциированного с детерминантами главного комплекса гистосовместимости класса II на антигенпредставляющих клетках [28].
Антиген CD3 является составной частью антигенспецифического Т-клеточного рецептора (TcR-CD3), запускающего процессы антигензависимой активации Т-клетки. Эти функции, ассоциированные с TCR, необходимы для экспрессии TCR на мембране и проведения сигнала внутрь Т-лимфоцита. В цитоплазматических доменах содержат ITAM и связывают тирозинкиназы [83].
Кластер CD3 состоит из нескольких важных мембранных молекул, тесно связанных с Т-клеточными рецепторами. Эти молекулы, особенно их дзета-СО и эта (ті) цепи, необходимы для передачи сигнала после установления контакта с молекулой МНС. Молекулы МНС непосредственно отвечают за активацию Т-лимфоцитов [12].
Молекула CD4 экспрессирует Т-клетки (хелперы-индукторы), составляющие 45 % лимфоцитов периферической крови; в периферической крови до 5 % клеток несут одновременно маркеры CD4 и CD8, слабая экспрессия молекулы CD4 наблюдается на клетках макрофагально-моноцитарного ряда [28].
С участием этого рецептора связывают секрецию IL-2, активацию антителозависимой и перфоринзависимой цитотоксичности [28, 94, 131, 194, 198].
Антеген CD4 выполняет функцию корецептора для связи TCR Т-лимфоцитов с МНС-П, связывает Lck в цитоплазме активированного Т-лимфоцита. Рецептор для ВИЧ-1 и ВИЧ-2 [12, 83].
Молекулы CD4 и CD8, распознающие структурные детерминанты антигенов МНС, обеспечивают процесс иммунологического ограничения, а, кроме того, способны самостоятельно, без участия TcR-CD3, передавать активирующий клетку сигнал. Таким образом, контролируя экспрессию антигенов CD4 и CD8, Т-лимфоцит регулирует процессы своей активации и эффекторные функции. И, наконец, несмотря на известные ограничения антигены CD3, CD4 и CD8 остаются широко используемыми маркерами для количественной оценки популяционного состава лимфоцитов.
Т-хелперы узнают детерминантные группы антигена на мембране макрофага и активируют при помощи медиаторов В-лимфоциты и эффекторные субпопуляции Т-лимфоцитов. Функция Т-хелперов состоит в выработке цитокинов и костимуляции В-лимфоцитов путем контактных
взаимодействий и действия цитокинов, а также стимуляции Т-киллеров вырабатываемым ими IL-2. Известно две разновидности Т-хелперов - ТЫ и Th2, отличающихся разным набором продуцируемых ими цитокинов. Thl-клетки вырабатывают IL-2 и интерферон-у; Тп2-клетки продуцируют IL-4, IL-5. ТЫ-клетки ответственны за стимуляцию клеточного, a Th2 - гуморального иммунитета. Между этими субпопуляциями Т-хелперов существуют антагонистические отношения [160, 180, 189]. Дифференцировка Т-хелперов в сочетании с оценкой клинического состояния свидетельствует о недостаточности иммунной системы у данного пациента [44].
Основную роль в поддержании и контроле протективного иммунного ответа играют CD 4+ Т-клетки памяти [179,218].
Установлена роль CD4+ Т-клеток в становлении опосредуемой CD 8+ Т-клетками защиты при повторном инфицировании. CD4+ Т-клетки, по-видимому, играют роль в программировании CD8+ Т-клеток памяти и, как установлено авторами публикации, участвуют в длительном поддержании пула и функциональной активности этих клеток. Как полагают, CD4+ Т-клетки поддерживают способность CD8+ Т-клеток памяти отвечать на IL-7 и IL-15. Установили также, что программирование эффекторного потенциала Т-клеток и становление Т-клеточной памяти, по крайней мере, частично, не перекрывающиеся процессы [183].
Хорошо известна физиологическая значимость Т-лимфоцитов фенотипа CD4, экспрессирующих такие маркеры как CD25, низкий уровень антигена CD45RB и высокий уровень CD38 и Mel-14. Они играют существенную роль в поддержании толерантности к собственным тканеспецифическим антигенам. [82].
CD4+ Т-клеточный ответ на вирусные белки является важным механизмом защиты микроорганизма, поскольку CD4+ -клетки Т-хелперы (Th) стимулируют продукцию антител В-лимфоцитами и активируют CD8+ Т-клетки, специфичные для вирусинфицированных клеток. Для активации Th необходимо образование комплекса TCR с вирусным антигенным пептидом,
представленным молекулами МНС II класса на поверхностной мембране антигенпрезентирующих клеток. К последним относятся дендритные клетки, В-лимфоциты и активированные макрофаги. Пролиферация CD4+-лимфоцитов сопровождается выработкой цитокинов, участвующих в формировании антигенспецифического клеточного (ТЫ) и гуморального (Th2) иммунного ответа [47].
Маркер CD5 определяется на поверхности всех Т-лимфоцитов и на незначительном количестве В-клеток: экспрессия рецептора на В-клетках с возрастом снижается до 5 % от всей популяции антителобразующих клеток. В норме их уровень составляет 60-80% от общего числа лимфоцитов [28, 77, 94]. Является рецептором для мусора [83]
Антиген CD5 представляет собой трансмембранный гликопротеин с мол. массой 67 кД, экспрессируемый Т-лимфоцитами и клетками В-1-фенотипа.
Молекула CD5 пространственно и функционально ассоциирована с BCR, её внутриклеточный домен подвергается тирозинспецифическому фосфорилированию при активации последнего. Показана способность антигена ингибировать процесс BCR-зависимой пролиферации путем сопряжения BCR с негативным регулятором передачи сигнала — тирозинспецифической фосфатазой SHP-1.
Влияние гормонов на иммунологическую реактивность
Иммунные реакции с самых ранних этапов своего развития тесно связаны с эндокринной системой. Гормоны оказывают либо стимулирующий, либо депрессивный эффект на иммунную систему, на фагоцитоз, пролиферацию, процессы дифференцировки иммунокомпетентных клеток, формирование клеточно-опосредованной цитотоксичности, антителообразование и апоптоз.
Фагоцитоз, являясь инициацией иммунной реакции, обеспечивает в дальнейшем интенсивность и степень выраженности ее развития [173]. В то же время исследований, посвященных изучению влияния гормонов на фагоцитоз очень мало. Известно, что глюкокортикоиды снижают экспрессию молекул адгезии, тем самым, снижая хемотаксис и в целом клиренсную функцию клеток системы мононуклеарных фагоцитов. После обработки глюкокортикоидами образование нейтрофилами супероксида снижается [129].
Антивоспалительный эффект кортикостероидов хорошо известен, что привлекло внимание к изучению механизма формирования очага воспаления, его клеточного состава и состояния лизосомного состояния фагоцитарной системы [72, 73, 84]. Действие глюкокортикоидов на клетки моноцитарной фагоцитарной системы впервые было исследовано Thompson и van Furth (1970). Ими было установлено, что под влиянием глюкокортикоидов резко уменьшается количество моноцитов в кровяном русле и в очаге воспаления. Это снижение не связано с изменением проницаемости сосудов, что могло бы сказаться на миграции гранулоцитов в очаг воспаления, но никак не на моноцитарной инфильтрации тканей, которая развивается значительно позже [223].
Введение животным кортизола препятствует накоплению макрофагов в кровяном русле и в очаге воспаления. Это происходит, главным образом, за счет уменьшения притока мононуклеаров из кровяного русла.
Механизм влияния кортикостероидов на миграцию моноцитов пока не ясен. Разрушения клеток при этом не происходит. Допускают, что быстрое исчезновение моноцитов крови объясняется нарушением освобождения их из костного мозга, и перераспределением между органами и тканями. Глюкокортикоиды не снижают содержание тканевых макрофагов, а уменьшают их поступление в очаг воспаления, что связывают с резким падением числа моноцитов в кровеносном русле [71].
Известно, что гидрокортизон обладает свойством подавлять иммунный ответ на этапе презентации антигена. Установлено снижение в 2 раза уровня клиренса крови от туши макрофагами на фоне предварительного введения инсулина и гидрокортизона [20]. Продолжительное применение кортикостероидов угнетает миграцию фагоцитов и их адгезивность [48].
Введение глюкокортикоидов заметно не влияет на способность клеток к фагоцитозу, но изменяет способность макрофагов к перевариванию объектов фагоцитоза. Вместе с тем, при взаимодействии определенных видов микробов, особенно обладающих аналогом лизосом с набором собственных гидролитических ферментов, все решается соотношением функциональной активности фагоцитов и ферментной активности живого объекта фагоцитоза. При этом изменение активности лизосомальных ферментов в пределах одной макрофагальной линии наиболее выражены при взаимодействии с живым объектом фагоцитоза и мало изменяются при фагоцитозе убитых микроорганизмов.
Кортикостероиды резко снижают антителозависимую цитотоксичность макрофагов, как in vivo так и in vitro [133]. Особенно значительно угнетает цитотоксичность макрофагов ацетат кортизона, который вызывает длительное повышение содержания кортизона в крови [158]. Кортикостероиды регулируют освобождение ферментов из лизосом. Ещё de Duve (1969), изучая влияние корткостероидов на лизосомы печени крыс in vitro, обнаружили задержку поступления р-глицерофосфата в гранулы. В то же время было установлено, что предварительное введение крысам кортизона препятствует выходу катепсина D из больших гранул [229].
Известно, что увеличение содержания в клетке жира и гликогена могут служить чувствительным показателем некробиотических процессов. Влияние кортизола на макрофаги связано с угнетением обмена в макрофагах с накоплением нейтральных липидов и углеводов.
Кроме того, глюкокортикоиды, снижая секрецию провоспалительных цитокинов, опосредованно подавляют дифференцировку моноцитов, экспрессию молекул МНС класса II [76]. Однако, показано, что кортизол в физиологических концентрациях даже необходим для формирования индуктивной фазы, презентации антигена и дальнейшего антителообразования [109, 123].
Эстрогены повышают функциональную активность фагоцитов, усиливая экспрессию молекул адгезии [6, 91, 92]. Влияние эстрогенов на макрофаги и другие антигенпрезентирующие клетки выражено незначительно, но в то же время отмечается повышение фагоцитарной активности и ингибирование макрофагального IL-1. Таким образом, макрофаги можно рассматривать как мишень прямого и непрямого действия половых гормонов [152].
Эстриол угнетает фагоцитарную активность нейтрофилов вне зависимости от дозы. Под действием супернатантов лимфоцитов, предварительно проинкубированных с эстриолом, процент фагоцитирующих нейтрофилов также снижается.
Совместная инкубация интактных нейтрофилов с клетками мононуклеаров, предварительно проинкубированных с эстриолом, оказывает стимулирующее воздействие на фагоцитарную активность нейтрофилов. По-видимому данный эффект связан с контактными взаимодействиями нейтрофилов и клеток мононуклеаров, которые и обеспечивают усиление фагоцитарной активности нейтрофилов [95].
Таким образом, эстриол угнетает фагоцитоз в культуре фракционированных нейтрофилов как самостоятельно, так и опосредованно через усиление выброса противовоспалительного цитокина IL-10. Однако при совместном культивировании мононуклеаров и интактных нейтрофилов гормон способствует повышению фагоцитарной активности последних, предположительно за счет контактных взаимодействий [50].
База исследования
Работа выполнена в лаборатории регуляторных механизмов иммунитета Института физиологии природных адаптации Уро РАН.
В настоящей работе представлены результаты исследования иммунного гомеостаза 300 человек в возрасте от 40 до 57 лет, проживающих на территории Архангельской области, из них 177 женщин и 123 мужчины.
Изучено влияние гормонов эстрадиола, тестостерона, прогестерона, окситоцина кортизола, тироксина на взаимодействие антител и антигенов поверхности лимфоцита в условиях in vitro. Комплекс иммунологического исследования включал: - определение содержания в периферической крови лимфоцитов фенотипов CD3+ (зрелые активированные Т-клетки), CD4+ (Т-хелперы, индукторы), CD5+ (общая популяция Т-лимфоцитов), CD8+ (цитотоксические Т-лимфоциты), CD 10+ (общий лимфоцитарный антиген), CD 16+ (экспрессируется на нормальных киллерах, моноцитах, макрофагах и нейтрофилах), CD23+ (низкоаффинный рецептор Ig Е, экспрессируется на зрелых В-лимфоцитах CD 25+ (активированные Т-лимфоциты с рецептором к интерлейкину-2), CD 71+ (Т-клетки с рецептором к трансферрину), CD95+ (является маркером для фактора некроза опухоли альфа, метит клетку к апоптозу), HLA DR+ (экспрессируется на антигенпредставляющих клетках); - исследование нейтрофильных лейкоцитов, в частности, выявление их фагоцитирующей способности; - исследование содержания эозинофильных лейкоцитов, моноцитов; - изучение концентраций следующих цитокинов: IL-6, интерлейкина-10 (IL-10), фактора некроза опухоли-альфа (TNF-a); - определение содержания сывороточных иммуноглобулинов (Ig) А, М, G,E.
Полученные результаты систематизировались в базу данных с последующей статистической обработкой.
В работе использованы гормоны эстрадиол (DRG Эстрадиол EIA-2693), тестостерон (Testosterone EIA-1559), прогестерон (DRG Прогестерон EIA-1561), окситоцин (Correlate-EIA. Кат. № 900-153), тироксин (Т4, свободный (EIA-2386), кортизол (DRG Кортизол EIA-1887).
Эстрадиол представляет собой С18-стероидный гормон с фенольным кольцом (кольцом А). Молекулярная масса этого стероида равна 272 Да. Эстрадиол является наиболее сильнодействующим природным эстрогеном и продуцируется в основном яичниками и плацентой, а также, в меньших количествах, корой надпочечников и мужскими яичками.
Содержание эстрадиола в периферической крови определяют для выявления причин нарушения менструального цикла, при бесплодии, недостаточности функции половых желез, при подозрении на гормон-зависимые опухоли. Снижение содержания эстрадиола в крови устанавливают при синдроме Тернера, первичном и вторичном гипогонадизме, гермафродитизме, климактерическом и постклимактерическом состояниях. Повышение уровня эстрадиола в сыворотке крови наблюдается при феминизации у детей, эстрогенпродуцирующих опухолях (гонад и коры надпочечников), гинекомастии, циррозе печени, гипертиреозе.
В течение беременности определение уровня эстрадиола в сыворотке крови позволяет контролировать состояние фетоплацентарной системы. Снижение уровня эстрадиола при динамическом исследовании является достоверным показателем нарушения состояния плода, требует проведения срочного родоразрешения.
У женщин эстрадиол синтезируется и секретируется граафовым пузырьком яичников. Он стимулирует развитие первой фазы овариального цикла, вызывая увеличение мышечного белка матки и гиперплазию эндометрия. На гипофизарном уровне он также действует на секрецию лютеонизирующего и фолликулостимулирующего гормонов. В течение первой фазы цикла нарастающее увеличение концентрации эстрадиола приводит к массивной секреции лютеонизирующего гормона, который "запускает" овуляцию. При беременности концентрация эстрадиола увеличивается. Анализ эстрадиола в плазме крови является основным параметром в слежении за индукцией овуляции и гиперстимуляцией яичников. Увеличение скорости синтеза эстрадиола и его концентрация в конце стимуляции отражает число и качество созревающих фолликулов. Показания к определению эстрадиола.
Разработка метода выявления влияния гормона на функциональную активность рецепторов фенотипов лимфоцитов
Исследование проводилось с ноября 2007 по август 2009 гг. Кровь для исследования брали из локтевой вены в объеме 10 мл в 9-10 часов утра, натощак. Сыворотку отделяли от эритроцитов центрифугированием, а затем замораживали. - Были изучены общее содержание лейкоцитов в венозной крови и лейкограмма с последующей оценкой концентраций лимфоцитов фенотипов CD3+, CD4+, CD5+, CD8+, CD10+, CD16+, CD22+, CD23+, CD25+, CD71+, CD95+,HLADR+. - Общее количество лейкоцитов определяли в камере Горяева. Для этого брали в пробирку с 400 мкл 3% уксусной кислоты, подкрашенной синькой (к 3 мл ледяной уксусной кислоты добавляли 97 мл воды в краску). В пробирку с кислотой пипеткой закапывали 20 мкл крови с гепарином. Полученную смесь взбалтывали перед просмотром под микроскопом и исследовали в камере Горяева на малом увеличении без иммурсионного масла [37]. - Для выявления поглотительной способности нейтрофилов использовали следующую методику: смесь 100 мкл латекса и 100 мкл крови с гепарином перемешивали и ставили в термостат на 30 мин. (при температуре аппарата 37 С). Затем из пробирки отсасывали надосадочную жидкость, о оставшую взвесь перемешивали и делали из нее мазок. Предметные стекла с мазками высушивали при комнатной температуре, фиксировали в смеси Никифорова 20 мин и окрашивали по Романовскому-Гимзе 40 мин. Отмытые и высушенные предметные стекла микроскопировали при увеличении объектива х90 и окуляра 7. Полученные результаты оценивались с помощью фагоцитарного показателя (процента фагоцитирующих клеток из числа сосчитанных нейтрофилов), и фагоцитарного числа (количество поглощенных одним активным нейтрофилом частиц). - Содержание лимфоцитов изучали в мазках крови, которые вначале 20 мин. фиксировали в смеси Никифорова (50% спирта и 50% эфира), а затем 40 мин. окрашивали по Романовскому-Гимзе. Приготовленные мазки рассматривались под микроскопом при иммерсионном увеличении объектива х90 и окуляра х10 с подсчетом 100 клеток на клавишных лабораторных счетчиках. Состав лейкоцитарной формулы выражался в процентах. - Для получения лимфоцитарной взвеси венозную кровь, взятую в асептических условиях в пробирку с гепарином в количестве 5-10 мл из расчета 20 ед. на 1 мл крови, выдерживали при комнатной температуре в течение 1,5 часа для оседания эритроцитов, после чего плазму с элементами белой крови отсасывали в стерильную пробирку и центрифугировали 5 минут при 1000 оборотах в минуту. Надосадочную жидкость удаляли и вместо нее наливали физиологический раствор в том же объеме. После смывания клеток со дна и стенок пробирок проводили дважды дополнительное центрифугирование отмытых форм. Осадок клеток ресуспензировали и подученную клеточную взвесь использовали для постановки непрямой иммунопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител на препаратах лимфоцитов типа «высушенной капли».
После выделения в градиенте фикол-верографин 0,5 млн. лейкоцитов наносили каплю на предметное стекло. Каплю жидкости высушивали при комнатной температуре. На высушенную каплю наносили 20 мкл 0,3% раствора перекиси водорода на 10 минут для блокады эндогенной пероксидазы. Каплю промывали 5 раз в 100 мкл физиологического раствора, наносили 20 мкл хорошо перемешанного раствора моноклональных антител, инкубировали в течение часа при комнатной температуре под чашкой Петри на влажной бумаге. Препараты промывали 5 раз в 100 мкл физиологического раствора, затем наносили 20 мкл хорошо перемешанного пероксидазного конъюгата, также инкубировали в течение часа при комнатной температуре под чашкой Петри на влажной бумаге. Минут за 10 до окончания инкубации готовили раствор хромогена: в 10 мл физиологического раствора растворяли 1 таблетку хромогена и после ее полного растворения добавляли 100 мкл аптечного 3% перекиси водорода. Препараты промывали 5 раз 100 мкл физиологического раствора. Наносили 200 мкл раствора хромогена и инкубировали от 1 до 10 мин. под визуальным контролем до появления окрашивания. Затем препараты также промывали 5 раз 100 мкл физиологического раствора. Ядра клеток докрашивали раствором бриллиантового зеленого. После высушивания образцов добавляли 20 мкл 50% глицерина и считали число клеток с коричневой зерноватостью при объективе микроскопа х90 окуляре х10.
Изучали следующие фенотипы лимфоцитов, отражающих процессы пролиферации (CD10+), активизации (CD25+, CD38+, CD71+, HLA DR+), дифференцировки (CD4+, CD8+, CD 16+), апоптоза (CD95+), антителообразования (CD22+) и экспрессии низкоаффинного рецептора к Ig Е (CD23+).
В процессе фенотипирования лимфоцитов параллельно с обычной схемой постановки иммунопероксидазной реакции проводили реакцию с предварительной обработкой клеточной смеси гормоном. Использовали 2 схемы контроля с добавлением гормона в реактивную клеточную смесь после моноклональных антител и индикаторной ферментной системы, и в условиях реакции без моноклональных антител, но в присутствии индикаторной смеси. В дальнейшем реакцию продолжали и оценивали стандартным способом.
Для разработки метода оценки влияния гормонов на реакцию фенотипирования гормоны в объеме 0,02 мл, в дозах, предусмотренных
условиями опыта (кортизол - 996,14 нмоль/л, L-тироксин -0,09268 нмоль/л, прогестерон - 127,2 нмоль/л, окситоцин - 0,9929 нмоль/л, тестостерон - 55,48 нмоль/л, эстрадиол - 7,342 нмоль/л). Длительность контакта моноклональных антител с лимфоцитами и продолжительность иммунопероксидазной реакции были одинаковыми при фенотипировании лимфоцитов в обычных условиях и при контакте с гормонами.
Также использовали реакцию гемагглютинации для определения группы крови АВО. Определение производится в нативной крови, взятой в консервант, в крови, взятой без консерванта, в том числе взятой из пальца. Используется метод прямой гемагглютинации на плоскости: на пластине или планшете. Определение группы крови производится в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25С. 1. Нанесите на планшет или пластину индивидуальными пипетками Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями. 2. Рядом с каплями антител нанесите по одной маленькой капле исследуемой крови (0,01-0,03 мл). 3. Смешайте кровь с реагентом. 4. Наблюдайте ход реакции с Цоликлонами визуально при легком покачивании пластины или планшета в течение трех минут. Аггтлютиницая эритроцитов с Цоликлонами обычно наступает в первые 3-6 секунд, на наблюдение следует вести три минуты ввиду позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.
