Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Функциональная активность эндокринной системы в равные периоды репродуктивного цикла и ее влияние на лактацию крупного рогатого скота 12
2.1.1. Гормоны щитовидной железы 13
2.1.2. Инсулин 18
2.1.3. Кортивол
2.2. Влияние условий кормления на уровень гормонов в крови крупного рогатого скота 24
2.2.1. Гормоны щитовидной железы 25
2.2.2. Инсулин 27
2.2.3. Кортивол 29
2.3. Состояние метаболизма глюкозы у лактирующих коров 31
2.4. Уровень гормонов в молоке и их роль для новорожденного 35
2.4.1. Тиреоидные гормоны в молоке 37
2.4.2. Инсулин 37
2.4.3. Кортизол 39
2.5. Гормональный статус телят в молозивный период 42
3. Собственные исследования
3.1. Материалы и методы исследований 47
3.1.1. Определение концентрации гормонов 52
3.1.2. Определение концентрации глюкозы и НЗЖК 55
3.2. Ревультаты собственных исследований и их обсуждение
3.2.1. Содержание гормонов в крови крупного рогатого скота и молоке 57
3.2.1.1. Инсулин 57
3.2.1.2. Кортиеол 54
3.2.1.3. Тиреоидине гормоны 59
3.2.1.4. Глюкоза 75
3.2.1.5. НЭЖК 79
3.2.2. Содержание гормонов в крови и молоке лактирующих коров на 3-м и 4-м месяцах лактации в зависимости от условий кормления 83
3.2.2.1. Инсулин 83
3.2.2.2. Тиреоидине гормоны 85
3.2.2.3. Кортивол 92
3.2.2.4. Глюкоза 95
3.2.2.5. НЭЖК 99
3.2.3. Связь молочной продуктивности с уровнем гормонов и метаболитов в крови 101
4. Заключение 105
5. Выводы 120
6. Практические предложения 122
7. Список литературы
- Гормоны щитовидной железы
- Состояние метаболизма глюкозы у лактирующих коров
- Определение концентрации гормонов
- Связь молочной продуктивности с уровнем гормонов и метаболитов в крови
Введение к работе
Эндокринная система занимает одно из центральных мест в специализированном управлении различными процессами жизнедеятельности на уровне целого организма. Эндокринные железы с помощью выделеня гормонов непосредственно, а также при участии нервной, иммунной и тканевых контролирующих систем влияют на метаболизм в организме животных (47, 59). При этом гормоны оказывают существенное, порой решающее, влияние на все фундаментальные жизненные процессы: они определяют уровень синтеза белка и ДНК в клетках, размеры клеток и их митотическую активность, а следовательно, рост тканей, развитие организма, формирование пола, адаптацию и поддержание метаболического гоме-остаза, поведение и другие (69).
Трудно определить в организме такие физиолого-биохимичес-кие процессы, которые не находились бы под регулирующим влиянием гормонов. В то же время ни один из гормонов, как правило, полностью не обеспечивает регуляцию отдельных функций. Для этого необходимо одновременное действие ряда гормонов в определенной последовательности и взаимодействии.
К комплексу гормонов, ответственных за индукцию и поддержание синтеза молока, относятся эстрогены и прогестерон, гормоны щитовидной железы и кортикостероиды, а так же пролактин, инсулин и гормон роста (55). Взаимодействие этих гормонов способствует осуществлению лактации. Исключение только одного из нескольких гормональных компонентов может привести к заметным нарушениям всего процесса лактации (230).
Гормоны оказывают влияние на метаболизм в организме посредством активации ферментных систем, повышения проницаемости клеточных мембран и ускорения синтетических процессов в торных клетках молочной железы. Избыток или недостаток соответствующих гормонов уменьшает или даже прекращает лактацию. Следовательно, эндокринная система в организме животного функционирует как высокоинтегированная система, обеспечивающая адаптацию метаболизма к конкретным условиям внешней среды. Поэтому, в целях дальнейшего познания природы высокой молочной продуктивности коров, необходимо исследовать механизмы гормональной регуляции обмена веществ в условиях комплексной оценки функционального состояния ряда эндокринных желез.
Выполненная работа является фрагментом плановых исследований лаборатории эндокринной регуляции обмена веществ и продуктивности сельскохозяйственных животных в комплексе с рядом лабораторий института.
АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ.
Метаболизм, рост, дифференцировка, репродукция, гомеостаз и адаптация - все эти основополагающие признаки живого организма регулируются гормонами. Гормоны служат каналами, связывающими центральную нервную систему с периферическими органами. Поэтому нормальное развитие эндокринной системы является необходимой предпосылкой для полноценного роста и развития организма, его физиологического здоровья (40).
В настоящее время накоплена определенная научная информация о гормональной регуляции процессов метаболизма и биосинтеза компонентов молока у коров. Однако, механизмы, контролирующие синтез и секрецию гормонов, реализацию их влияния в тканях и органах "мишенях" остаются недостаточно изученными.
Воспроизводительная функция животных претерпевает в течение их жизни ряд сложных изменений, сопровождающихся опреде - 7 ленным уровнем обмена веществ и изменениями физиологических и биохимических показателей внутренней среды организма (118).
В ряде исследований показано изменение концентрации отдельных гормонов по стадиям лактации (47, 77, 78, 95 , 225, 251). Однако, имеется мало информации об одновременной оценке равных классов гормонов-белковых, тиреоидных и стероидных, что не позволяет достаточно объективно описать механизмы гормональной регуляции обмена веществ у лактирующих животных.
Анализ результатов ранее проведенных исследований убедительно свидетельствует о том, что эндокринная система играет ведущую роль в системе гомеоретического контроля в организме животных, которая обеспечивает регуляцию распределения и использования субстратов для обеспечения основных физиологических функций организма и , в том числе, процессов молокообразо-зания. В свою очередь, функциональное состояние эндокринных желез зависит от количества и соотношения ряда метаболитов, поступающих из желудочно-кишечного тракта в кровь, в результате переваривания питательных веществ корма. Показано, что поступление из желудочно-кишечного тракта в кровь аминокислот и глюкозы в определенной мере зависит от распадаемости протеина и крахмала в преджелудках жвачных животных. Необходимо выяснить, как влияют эти факторы питания на гормональный статус лактирующих коров.
Ферментативная активность в отдельных тканях и органах находится под контролем тех или иных гормонов, и может изменяться в течение коротких промежутков времени в зависимости от уровня в крови этих гормонов или изменения рецепторной активности тканей.В различные периоды репродуктивного цикла имеют место "приоритетные" направления использования питательных ве - 8 ществ. Так, известно, что в период доминанты лактации, то есть в течение первых одного-трех месяцев после отела, у животных питательные вещества из крови поступают прежде всего в молочную железу даже за счет мобилизации из других тканей. Для познания механизмов гормональной регуляции интенсивности и направленности метаболических потоков у лактирующих коров мы исследовали взаимосвязи между концентрацией гормонов и уровнем субстратов в крови. Для реализации этой задачи проводили определение содержания метаболитов углеводного и липидного обменов в крови коров.
Одним из важных открытий в последнее десятилетие стало установление выделения с молоком гормонов как стероидной, так и белковой природы.
Установлено (100),что концентрация большинства гормонов в крови животных существенно изменяется в течение суток. Поэтому для объективной оценки функционального состояния эндокринной железы необходимо многократное взятие проб крови в течение суток с последующим анализом в них содержания гормона. В процессе поступления гормонов из крови в секреторные клетки молочной железы и последующего выделения их с молоком, по-видимому, происходит сглаживание пиков секреции гормонов. Следовательно, концентрация гормонов в молоке может более полно отражать среднесуточную активность эндокринных желез. Предполагается, что одновременная оценка функционального состояния эндокринных желез по концентрации гормонов в крови и в молоке позволит получить более объективную информацию о механизмах гормональной регуляции обмена веществ и процессов биосинтеза компонентов молока.
Результаты отечественных и зарубежных исследований свиде - 9 тельствуют, что наиболее критическими для телят являются первые дни жизни, когда происходит становление основных физиологических функций организма (140). Новорожденные должны адаптироваться к факторам окружающей среды и, в том числе, к новым условиям питания. После рождения у животных изменяются источники обеспечения организма энергией - от преимущественно углеводного обеспечения во внутриутробный период до использования молозива с большим содержанием жира и относительно низким уровнем углеводов (155, 199, 203, 239).
Употребление молозива оказывает многочисленные эффекты на обмен веществ и гормональный статус новорожденных (8). Компоненты молозиЕа, поступающие в организм новорожденных телят, ЕЛИЯЮТ на процессы синтеза белка (183) и изменяют активность гормонов соматотропиновой оси (208). Результаты приведенных сведений явились обоснованием актуальности и значимости данной проблемы и целесообразности проведения работ в этом направлении.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Цель исследований - комплексное изучение уровня инсулина, тиреоидных гормоноЕ и кортизола в крови в связи с формированием и развитием лактационной доминанты у коров-первотелок и становлением эндокринной системы у новорожденных телят.
Задачи исследований:
-определить концентрацию гормонов в крови и молоке короЕ перед отелом и на разных стадиях лактации;
-изучить связь между концентрацией в крови и молоке гормонов различной химической структуры - белковой (инсулин), стероидной (кортизол) и производные аминокислот (тироксин);
- влияние разных условий питания на гормональный статус короЕ-первотелок в период пика лактации;
-исследовать функциональную активность щитовидной железы, коры надпочечников, поджелудочной железы у телят в первые 10 дней жизни и связь содержания гормонов в крови телят с уровнем гормоноЕ в крови и молоке матерей.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА.
Получены новые данные о функциональном состоянии эндокринной системы на важнейших стадиях репродуктивного цикла у лактирующих коров (перед отелом и в первую половину лактации).
Впервые определены параметры содержания в молоке новотельных коров гормонов белковой (инсулин) и стероидной (корти-зол) структуры, а также тиреоидных гормонов и изучено их влияние на гормональный статус новорожденных телят.
Установлена связь между уровнем гормонов в молоке и их содержанием в крови, которая может быть использована для более объективной оценки функциональной активности эндокринных желез.
Уточнено влияние отдельных факторов питания на гормональный статус лактирующих коров.
Полученный экспериментальный материал дополняет имеющиеся в литературе данные о механизмах гормональной регуляции метаболизма и биосинтеза компонентов молока у коров в начале и на пике лактации.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ.
Материалы исследований можно использовать для разработки способа оценки состояния эндокринной системы по интенсивности выделения гормонов с молоком.
Данные о содержании гормонов в крови телят могут служить одним из показателей физиологического состояния этих животных.
Основные положения диссертации рекомендуется использовать в курсе физиологии сельскохозяйственных животных высших учебных заведений.
АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ. Материалы диссертационной работы доложены на:
- Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке" (1-5 ноября 1999). БГСХА. (Брянск, 1999)
- Третьей Международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (5-8 сентября, 2000). ВНИИФЕЙП с.-х. животных. (Боровск, 2000).
- Заседании отделов питания и регуляции метаболизма и продуктивности ВНИИФБиП с. животных (Боровск, 2000).
ПУБЛИКАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
- Содержание белковых, тиреоидных и стероидных гормонов в крови нетелей в последний месяц стельности и уровень их в крови и молоке в первые 10 дней лактации;
-Состояние активности эндокринных желез (коры надпочечников, щитовидной железы и инсулярного аппарата) в зависимости от условий кормления лактирующих коров;
-Связи между концентрацией гормонов в плазме крови коров, в молоке и уровнем гормонов в крови телят в молозивныи период выращивания.
Гормоны щитовидной железы
Проблема повышения продуктивности крупного рогатого скота включает в себя широкий круг вопросов, как чисто биологического характера, так и технологического и организационно-хозяйственного, которые в современном молочном скотоводстве тесно связаны. Например, создание высокоудойных стад животных, превышающих в 7-8 раз по продуктивности низкопродуктивных (129), было достигнуто путем целенаправленного систематического отбора и подбора, постоянного улучшения условий кормления, содержания и эксплуатации животных. Все эти факторы воздействуют на организм животного, в частности на нейроэндокринную систему.
"Взаимосвязь между факторами питания и эндокринной системой вполне естественна, поскольку гормоны участвуют в адаптации животных к различному уровню и характеру кормления, регулируют обмен питательных веществ, которые, в свою очередь, могут влиять на синтез и секрецию гормонов. При недостатке отдельных аминокислот нарушается синтез пептидных, белковых, а также стероидных гормонов, который осуществляется с участием ферментов, являющихся белками" (137).
Если потребности молочных коров в питательных веществах к концу беременности возрастают, что связано с ускоренным ростом плода, то после отела, когда корова начинает лактировать, потребности организма увеличиваются в несколько раз. Неудивительно, что кормление и содержание животных в течение 2-3 месяцев после отела определяют уровень последующей лактации (44).
В начале лактации у животных отмечается дефицит энергии, поскольку затраты на синтез компонентов молока возрастают быстрее, чем поступление питательных веществ с кормом. Многочисленные исследования позволили выявить пик кривой лактации между 5-й и 7-й неделями лактации, тогда как максимальное потребление корма наблюдается только на IS-16-й неделях лактации (52, 76, 167, 178, 219).
"Синтез молока, несмотря на отрицательный баланс энергии, происходит на высоком уровне, при этом используются резервы тела. Кратковременно отрицательный энергетический баланс компенсируется использованием жировых резервов, белков (мышцы) и минеральных веществ (кости). Одновременно подавляются некоторые анаболические процессы, например, синтез запасного жира и отложение фосфата кальция в костях. При этом значительно возрастает синтезирующая способность молочной железы" (270). Поддержание баланса питательных веществ в фазу дефицита энергии предъявляет высокие требования к регуляторным системам в организме жвачных с возможными отрицательными последствиями на количество молока, содержание жира, здоровье, воспроизводительную функцию и длительность эксплуатации коровы (25, 77, 250).
Недостаточная обеспеченность животных энергией в начале лактации приводит к относительно более раннему наступлению пика удоев и более скорому спаду лактационной кривой. В этих условиях, естественно, максимальные удои не достигают величины, наблюдаемой при авансированном кормлении. Оптимальный уровень кормления в первые три месяца после отела оказывает большое влияние на лактацию в целом. Коровы в этих условиях значительно дольше сохраняют способность направлять питательные вещества корма на образование молока, а не на отложение в теле. Не дополучение питательных веществ с кормом после отела, даже в течение нескольких дней, ведет к значительному уменьшению продуктивности за лактацию. Строгие опыты и производственные испытания показали, что недобор из-за плохого кормления 1 кг молока в период максимальных удоев влечет за собой недополучение 150-200 кг молока от коровы в целом за лактацию (76).
После пика лактации с началом падения удоя организм животного переходит к положительному энергетическому балансу; возобновляется синтезирующая активность тканей, таких как жировая и восстанавливаются тканевые резервы (270).
Влияние кормовых факторов на эндокринную систему определяется как общим количеством питательных веществ в рационе, так и их качеством. Высокий уровень кормления способствует повышению активности щитовидной железы и, наоборот, продолжительное голодание и недокорм снижают ее активность (137).
Поддерживающее кормление коров за 70 дней до отела приводило к снижению в плазме крови уровня тироксина и трийодтиро-нина. В начале лактации эта разница нивелировалась у всех животных, получавших разный уровень кормления (222). При низком содержании энергии в рационе у бычков снижался уровень тире-оидных гормонов, а с повышением энергии в рационе их концентрация в крови постепенно нормализовалась (171). В то же время в опытах, проведенных на коровах, у которых на 3-м месяце лактации резко снижали уровень кормления, концентрация тироксина увеличивалась на 26 %, а удой снижался на 20 %.
У плодов и телят, полученных от коров с неполноценным рационом кормления, наблюдали снижение синтеза тиреоидных гормонов, уменьшение диаметра фолликулов щитовидной железы, в которых происходило уменьшение количества ДНК в ядрах и РНК в цитоплазме (111).
Выращивание телок на высоком уровне кормления по сравнению с умеренным приводило к незначительному повышению активности щитовидной железы (71). При скармливании жвачным животным рационов с разным уровнем клетчатки существенных различий в уровнях тироксина и трииодтиронина между опытными группами не обнаружено (227).
Существенное влияние на функцию щитовидной железы оказывает голодание. Длительное голодание нетелей, в течение 21 дня, при свободном доступе к воде приводило к снижению концентрации тироксина в первые сутки, а затем к увеличению и сохранению ее на высоком уровне весь период голодания. Возобновление кормления снижало концентрацию тироксина в крови нетелей (116). В то же время другие исследователи в опытах на голодающих бычках и дойных коровах отметили, что голодание приводит к быстрому и значительному уменьшению секреции тире-оидных гормонов (261, 266).
Для нормального образования тиреоидных гормонов необходимо регулярное поступление с кормом йода и некоторых аминокислот (тирозина и фенилаланина). Высокое содержание в рационе кальция, калия и фтора, а также дефицит витаминов А и Е снижают активность щитовидной железы. Для синтеза тиреоидных гормонов требуется также и медь (139).
Состояние метаболизма глюкозы у лактирующих коров
Глюкоза является основным углеводом крови всех животных. У моногастричных она служит главным энергетическим субстратом организма. Энергия высвобождается при ее расщеплении по дихотомическому (включающему в себя гликолиз с последующим аэробным окислением в цикле Кребса) или апотомическому (пентозофос-фатному, или пентозному) пути. Выделяемая при этом энергия аккумулируется в макроэргических связях: при дихотомическом расщеплении - АТФ, при апотомическом - НАДФН2.
У жвачных метаболизм глюкозы имеет ряд особенностей. Основная часть углеводов корма у них подвергается брожению в преджелудках. Образующиеся при этом ЛЖК всасываются в кровь из рубца и используются в энергетическом обмене, обеспечивая около 70 % потребности организма жвачных животных в энергии. Вследствие этого из ЖКТ в организм жвачных поступает незначительное количество углеводов. Основным источником глюкозы у них является глюконеогенез из пропионата, лактата и глюкоген-ных аминокислот. Подсчитано, что из 2 молей пропионовой кислоты может образоваться 1 моль глюкозы, или 1 г пропионата соответствует 1.23 г глюкозы (54).
Глюкоза расходуется в организме жвачных животных экономно. Установлено, что в печени у них гексокиназа и глюкокиназа имеют низкую активность. Вследствии этого гликолиз идет с малой интенсивностью (158). У жвачных животных в адипоцитах печени снижена также активность АТФ-цитратлиазы и НАДФ-малатде-гидрогеназы. Поэтому глюкоза не расходуется как источник углерода для синтеза жирных кислот (159). Основным предшественником жирных кислот у жвачных является ацетат, и синтезируются эти кислоты в жировой ткани (209).
Поскольку величина синтеза глюкозы из пропионата регулируется поступлением субстрата из преджелудков, то она может зависеть от факторов кормления, влияющих на интенсивность брожения в рубце. Например, исследуя динамику концентрации глюкозы в крови крупного рогатого скота в течение года, большинство авторов отмечают, что наименьшие значения этого показателя приходятся на летний период (91, 108, 195, 196). Причина этого- сдвиги в процессах рубцового пищеварения, вызванные изменением структуры рациона.
У коров, получавших высокий уровень концентратов в рационах, повышается образование пропионовой кислоты в преджелудках (53) и последующее образование из нее глюкозы в печени (48).
Одним из важнейших потребителей глюкозы в организме коровы является молочная железа. В период лактации она поглощает от 60 до 85 % глюкозы, синтезируемой в печени. Глюкоза используется молочной железой преимущественно (73 %) для биосинтеза компонентов молока, 23 % ее направляется на пентозофосфатный путь, а 4 % метаболизируется в цикле Кребса (257).
"В молочной железе жвачных при участии глюкозы синтезируются глицерин-составная часть триацилглицеролов; галактоза, образующая затем с глюкозой дисахарид лактозу; а также некоторые заменимые аминокислоты" (34). Для образования 1 кг молока молочная железа поглощает в среднем 58 г глюкозы (54), а по другим данным-от 50 до 100 г (05).
Лактоза, синтезируемая исключительно из глюкозы, способствует сохранению на постоянном уровне осмотического давления молока. При поступлении лактозы в емкостную систему вымени в ней возрастает осмотическое давление; за счет этого увеличивается поступление туда же воды, что в значительной мере определяет величину удоя (249).
В литературе имеется много данных об изменениях уровня глюкозы в крови лактирующих коров. В ходе лактации базальный уровень сахара в крови коров может снижаться (18). Особенно зто выражено в первые дни после отела (23, 254), что, возможно, вызвано усиленным поглощением глюкозы молочной железой (222). С этим положением согласуются данные о падении уровня гликемии у коров после доения (101). Известно, что молочная железа наиболее интенсивно поглощает глюкозу из крови через 2 часа после доения (68).
По данным артерио-венозной разницы, поглощение глюкозы из крови молочной железы изменяется в зависимости от стадии лактации, достигая наименьшего уровня в сухостойный период. По-видимому, глюкоза в этот период используется только на энергетику органа (82).
При недостаточном поступлении глюкозы и других субстратов в кровь молочная железа у коров может конкурировать за эти субстраты с другими органами и тканями. Перераспределение субстратных потоков, вызванное необходимостью удовлетворить наиболее важную функцию организма (в данном случае-лактацию), определяется механизмами гомеоретического контроля (164, 1Q0). У высокопродуктивных коров это достигается в результате усиления кровотока в вымени, уменьшения поглощения субстратов вневыменными тканями, мобилизации резервов тела на биосинтез компонентов молока.
Широко распространено мнение, что в связи с большим расходом глюкозы молочной железой у высокопродуктивных лактирую-щих коров содержание ее в крови меньше, чем у низкопродуктивных С108» 205). Возможно, в этом же причина более низкого уровня глюкозы у коров молочной продуктивности, по сравнению с мясными (136). Наиболее низкая концентрация глюкозы в крови наблюдается у первотелок вследствии дополнительного расхода ее на обеспечение роста (173). Однако некоторые авторы приводят данные о положительной корреляции между уровнем гликемии у коров и их молочной продуктивностью (91, 109).
Определение концентрации гормонов
Создание Ялоу и Берсоном (Yalow, Berson, I960) радиоиммунологического метода явилось революционным этапом в развитии исследований в области эндокринологии, а в дальнейшем для анализа лекарственных веществ и других биологически активных веществ (131). Несомненным достоинством этого метода является его специфичность, воспроизводимость и чувствительность, позволяющая анализировать содержание гормонов в биологических жидкостях без предварительной их экстракции.
Радиоиммунологический анализ гормонов основан на способности определяемого гормона (антигена) взаимодействовать со специфическими антителами. В присутствии меченого гормона происходит конкуренция между определяемым и меченым гормонами за связь с антителами, которые содержатся в инкубационной среде в количестве, недостаточном для полного связывания обоих гормонов . При этом необходимо, чтобы связывающая способность молекул определяемого и меченого гормонов не различалась. Чем больше добавлено немеченого гормона, тем меньше радиоактивных молекул меченого гормона будет связано с антителами, то есть больше радиоактивных молекул будет находиться в свободной форме. Когда в пробе содержится постоянное количество антител и молекул радиоактивного гормона, доля связанных молекул радиоактивного гормона будет обратно пропорциональна добавленному количеству немеченого гормона. Для любого данного количества гормонов можно определить процентную долю свободного и связанного с антителами гормона.
Абсолютное количество определяемого гормона вычисляют путем сравнения процентной доли свободной или связанной радиоактивности образцов с графиком стандарта, для построения которого используют разные разведения известного количества высокоо-чищеиного гормона-стандарта.
Подробно принципы радиоиммунологических методов и техника определения гормонов описаны в ряде методических указаний (21, 22, 70, 94).
Для определения видонеспецифичееких гормонов (инсулина, тироксина, трииодтиронина, кортизола) в плазме крови коров и телят и молоке коров применяли готовые коммерческие наборы, которые производят для анализа гормонов у человека. Использовали следующие наборы реактивов производства института биоорганической химии национальной Академии наук Беларуси: "РИА-ИНС-ПГ-Л25" - для определения иммунореактивного инсулина, "РИА-кортизол-ПГ" - для определения концентрации кортизола, "РИА-Т4-ПГ" - для определения тироксина, "РИА-ТЗ-ПГ" - для определения трииодтиронина . К каждому набору прилагается подробное описание методики анализа, поэтому, по-видимому, нет необходимости детально описывать технику проведения анализа гормонов.
В цельном молоке и сыворотке крови коров определяли концентрацию кортизола и тиреоидных гормонов иммуноферментным методом.
Принципиальное отличие иммуноферментного метода от радиоиммунологического заключается в том, что вместо радиоактивного изотопа к гормону или антителу присоединяют подходящий для условий работы высокоактивный фермент (в данном случае - пе-роксидаэа хрена), для которого есть чувствительные методы определения его в биологическом материале. Полагают, что использование нерадиоактивных индикаторов (ферментов) в будущем приведет к полной замене РИА-методов иммунсферментными.
Принцип иммуноферментного метода определения тиреоидных гормонов основан на конкуренции между адсорбированным на поверхности лунок планшета гормоном и свободным (в калибровочной пробе или анализируемом образце) гормоном за активные центры связывания аффинных антител к гормону, меченых пероксидазой. В результате иммуноспецифической реакции, между антителами к тире оидным гормонам и самим тироксином или трийодтиронином адсорбированном на полистироле на поверхности лунок планшета образуется комплекс антитело - гормон. Аналогичный комплекс антиген - антитело, но не связанный с поверхностью планшета образуется между антителами и свободным гормоном анализируемого или стандартного образца. Комплекс антиген-антитело, не связанный с поверхностью планшета, удаляют путем промывки. В последующем измеряют пероксидаэную активность, строят калибровочный график и по нему рассчитывают концентрацию гормона в образце.
Принцип метода определения кортизола аналогичен методу определения тиреоидных гормонов. Единственным отличием является то, что антитела метят биотином, количество которого определяют с помощью его реакции конъюгатом етрептавидин-перокси-даза.
В этих тест-системах интенсивность пероксидазной активности оценивается по цветной окраске, которая образуется при взаимодействии пероксидазы с субстратом. В качестве последнего используют 3,3 , 5,5 -тетраметилбензидин. Интенсивность образующейся окраски обратно пропорциональна содержанию гормона в анализируемом образце. Реакцию останавливают добавлением серной кислоты, вызывающей смену окраски с синей на ярко желтую. Результаты реакции оценивают на спектрофотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм.
Связь молочной продуктивности с уровнем гормонов и метаболитов в крови
Известно, что молочная продуктивность обусловливается согласованной работой всего организма, в основе которой лежат непрерывные процессы обмена веществ. В регуляции обмена веществ важную роль играет система желез внутренней секреции. Гормоны коры надпочечников, щитовидной и поджелудочной желез, выделяемые в кровь, влияют как на направление, так и на интенсивность обмена веществ в организме, что в конечном счете находит свое отражение в уровне продуктивности животного.
В нашем опыте показана связь функционального состояния выше перечнеленых желез с молочной продуктивностью у коров в разные периоды лактации.
В первые дни после отела не установлено достоверной зависимости между базальным уровнем инсулина в крови и удоем коров. На 2-й и 5-й дни после отела значения коэффициентов корреляции составили Г-+0.25 и г-+0.11. На 55-е сутки лактации свявь между этими показателями приобретает высокодоетоверный характер, коэффициент корреляции составляет Г-+0.86 (р 0.001). К концу опытного периода корреляционная зависимость по прежнему носит положительный характер с некоторым ослаблением связи О-+0.36). Следовательно, в условиях наших исследований молочная продуктивность с достаточной степенью достоверности связана с уровнем функциональной активности бетта-клеток инсулярно-го аппарата поджелудочной железы. Ряд исследователей установили аналогичную зависимость (73, 97, 123, 254).
Корреляционный анализ выявил слабую отрицательную связь на 2-й день после отела между суточным удоем и уровнем корти-зола в крови. Эта тенденция прослеживается во все периоды взятия крови, то есть до кормления, через 1 час и через 3 часа после приема корма. Так, например, через час после кормления коэффициент корреляции составляет г—0.24. В дальнейшем эта зависимость сохраняется до конца опытного периода. На 4-м месяце лактации значения коэффициента корреляции составляет -0.25. Полагают, что продуктивность коров находится в обратной зависимости от концентрации кортизола в крови (5, 7, 9, 31, 104, 125, 143, 179, 185, 189, 243, 259).
На 2-й и 5-й дни лактации наблюдали положительную корреляцию между удоем и концентрацией тироксина в крови коров во все периоды взятия крови, а именно до кормления Г-+0.36; г -+0.22, через 1 час после кормления Г-+0.85 (р 0.01); Г-+0.26, через 3 часа после приема корма Г-+0.67 (Р 0.05); Г-+0.40, соответственно.
Между уровнем трийодтиронина в крови до кормления, через 1 час, через 3 часа после приема корма и удоем на 2-й день после отела так же прослеживается положительная корреляция, Г-+0.35 (р 0.05), Г-+0.57 (p 0.01), Г-+0.24, соответственно. К 5-му дню она ослабевает и приближается к значениям близким к нулю.
Корреляционный анализ наших данных показал наличие отрицательной связи между тироксином в крови и удоем на 4-м месяце лактации (г—0.41). Найдена достоверная отрицательная корреляция между удоем и уровнем трийодтиронина в крови на 3-м месяце лактации (г—0.69, р 0.1), на 4-м месяце эта связь теряется. На основании этого можно заключить, что характер связи между тиреоидными гормонами и продуктивностью первотелок зависит от стадии лактации и отражает напряженность энергетического обмена.
Многочисленные экспериментальные данные, по вопросу связи уровня тиреоидных гормонов в крови с продуктивностью, больше поставили вопросов, чем дали ответов. Ряд исследователей так же выявили наличие прямой СЕЯЗИ между выше указанными показателями (7, 9, 64, 97). Другие же авторы не установили такой зависимости между содержанием тиреоидных гормонов и удоем (271), а в некоторых работах найдена отрицательная корреляционная зависимость между этими показателями (12, 30, 43, 51, 120, І43, 152, 166, 205, 259, 263, 217).
Уровень глюкозы так же связан с энергетическим статусом животного. Ее концентрация снижается при отрицательном энергетическом балансе (205, 259), что, возможно, является объяснением наблюдаемой нами на 5-й день лактации высокодостоверной отрицательной корреляции между надоями и уровнем глюкозы в крови (г—0.94; р 0.001). На 55-й день после отела связь между этими показателями ослабевает и коэффициент корреляции составляет г—0.31.
В разгар лактации (3-й месяц после отела) коэффициенты корреляции между удоем и уровнем глюкозы в артериальной крови приобретают положительное значение. До кормления и через 3 часа после приема корма Г-+0.44 и Г-+0.43, соответственно. На 4-й месяц лактации эта связь значительно ослабевает (до приема корма Г-+0.04, через 3 часа после кормления Г-+0.2). Это , возможно, объясняется тем, что в этот период у стельных животных лактационная доминанта ослабевает в следствии развития плода.
Известно, что синтез компонентов молока происходит за счет абсорбции метаболитов из притекающей крови. На основании этого можно предположить наличие положительной связи между молочной продуктивностью и концентрацией предшественников молока в крови. Корреляционный анализ подтвердил наличие такой связи для некоторых метаболитов. Была установлена положительная корреляция между удоем и уровнем НЭЖК в крови (г-+0.22). Отсутствие выраженной зависимости между концентрацией глюкозы в артериальной крови и уровнем молочной продуктивности свидетельствуют о наличии транспортной системы поступления глюкозы в секреторные клетки молочной железы.
