Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Актуальность вопроса интенсификации воспроизводства стада . 10
1.2 Отбор коров - доноров эмбрионов. 13
1.3 Фолликулогенез у крупного рогатого скота . 14
1.4 Реакция суперовуляции у крупного рогатого скота. 17
1.5 Основные факторы, влияющие на реакцию суперовуляции. 25
1.6 Стимуляция и синхронизация половых циклов. 31
1.7 Заключение обзора литературы. 32
2. Материалы и методы исследования. 36
3. Собственные исследования . 42
3.1 Влияние физиологического состояния органов репродуктивной системы коров на реакцию суперовуляцией и эмбриопродуктивность . 42
3.2 Влияние высокоочищенного фолликулостимулирующего гормона на реакцию суперовуляции у коров и эмбриопродуктивность доноров . 49
3.3 Влияние предварительной стимуляции первого пула фолликулов перед гормональной обработкой ФСГ-СУПЕР на суперовуляцию и результаты извлечения эмбрионов. 52
3.4 Результат использования препарата ФСГ-СУПЕР для стимуляции реакции суперовуляции в разных дозах и схемах введения. 54
3.5 Влияние дозы гонадотропина ФСГ - СУПЕР на вариабельность реакции суперовуляции и качество извлекаемых эмбрионов. 64
4. Обсуждение. 72
5. Заключение. 83
6. Выводы. 88
7. Практические предложения. 90
Список литературы. 91
Приложение 1. 106
Приложение 2. 112
- Актуальность вопроса интенсификации воспроизводства стада
- Фолликулогенез у крупного рогатого скота
- Влияние физиологического состояния органов репродуктивной системы коров на реакцию суперовуляцией и эмбриопродуктивность
- Влияние высокоочищенного фолликулостимулирующего гормона на реакцию суперовуляции у коров и эмбриопродуктивность доноров
Введение к работе
Диссертация является итогом научно - исследовательских работ по возможности использования в качестве доноров высокопродуктивных коров в течение сервис-периода.
Актуальность работы.
Выдающимся достижением зоотехнической науки середины XX века было широкое внедрение искусственного осеменения млекопитающих с использованием замороженной спермы (40). Впоследствии этот метод позволил наиболее эффективно использовать выдающихся быков-производителей при выполнении селекционных программ в скотоводстве (10, 38, 66, 72, 93).
В последние десятилетия прошедшего века, наряду с искусственным осеменением, в мировой практике разведения крупного рогатого скота стали применять трансплантацию эмбрионов как один из перспективных методов интенсификации племенной работы путем ускоренного размножения наиболее ценных животных по материнской линии (8, 63, 76). С середины 80-х годов интенсивно создавались пункты трансплантации, но внедрение метода, несмотря на кажущуюся простоту и заманчивость рекламируемых результатов, было сопряжено со многими трудностями.
Во-первых, повсеместное использование импортных производителей и отсутствие спроса на быков отечественной селекции, а также массовые закупки импортного скота явились причиной невостребованности использования метода трансплантации в селекционных программах по дальнейшему развитию отечественного скотоводства.
Во-вторых, результаты эмбриопересадок в производственных условиях не могли удовлетворить практиков. Если в научно-производственных опытах приживляемость эмбрионов составляла 50-65%, то на практике результаты были гораздо ниже. (72). Увеличение спроса на эмбрионы крупного рогатого скота отечественной селекции сегодня предполагает эффективное использование генофонда племенных заводов, то есть использование выдающихся животных в качестве доноров эмбрионов и накопление банков эмбрионов. Однако использование выдающихся животных отечественной селекции в племенных хозяйствах сегодня в программах трансплантации эмбрионов и создание банков эмбрионов незначительно. Вследствие этого система МОЭТ (множественная овуляция и эмбриопересадки), которая широко и с большим успехом применяется в селекционных программах всего мира, в нашей стране распространения не получила. С самого начала внедрение метода трансплантации эмбрионов, как за рубежом, так и в нашей стране было ориентировано на создание крупных центров и пунктов по трансплантации эмбрионов с собственными донорскими стадами коров, направленное на их многоразовое использование. Однако существующие методы и средства для вызывания суперовуляции у коров-доноров сегодня не позволяют долгосрочное их использование ввиду малой продуктивной жизни и, как следствие, потери при выбраковке по экономическим причинам.
Результаты работы центров и пунктов показали, что многоразовое использование доноров имеет как позитивные, так и негативные стороны (72). Одной из существенных причин низкой эффективности эмбриопродуктивности доноров является непредсказуемость ответа организма на гонадотропные гормоны реакцией суперовуляции - одного из важнейших звеньев технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. При многоразовом использовании коров в качестве доноров возможен индивидуальный подход к обработкам гормональными средствами для повышения эффективности результатов трансплантации. Основанием для многоразового использования коров-доноров является получение не менее 3-х качественных эмбрионов при реакции суперовуляции. Эти результаты в дальнейшем гарантируют положительную реакцию суперовуляции и получение качественных эмбрионов не менее чем у 80 % отобранных коров в доноры эмбрионов (56).
Однако практика многоразового использования коров в качестве доноров показала, что большинство животных реагируют на гормональные обработки без снижения количества и качества эмбрионов не более 3-5-ти раз. Далее доноров эмбрионов необходимо снова вводить в нормальный воспроизводственный цикл, но на практике, вследствие снижения молочной продуктивности, их выбраковывают по причине экономического характера (62).
Кроме того, использование в качестве доноров ограниченного поголовья коров ведёт к сужению и обеднению генофонда. Это явилось причиной децентрализации донорских стад и поисков путей более широкого использования элитного поголовья племенных хозяйств в качестве доноров эмбрионов, но уже без вывода доноров из воспроизводительного цикла стада.
Исходя из выше изложенного, научные исследования, направленные на решение проблем, связанных с отбором и подготовкой коров к гормональной стимуляции для повышения их эмбриопродуктивности, изучение факторов, оказывающих влияние на процессы фолликулогенеза, способы регулирования функций яичников для повышения эмбриопродуктивности, являются актуальными.
Цель и задачи исследований.
Цель: повышение эффективности использования высокопродуктивных коров в качестве разовых доноров эмбрионов в племенных хозяйствах без снижения дальнейшей воспроизводительной функции.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить влияние физиологического состояния репродуктивной системы у коров в послеродовой период на реакцию суперовуляции и эмбриопродуктивность. 2. Выявить влияние степени очистки фолликулостимулирующего
гормона на реакцию суперовуляции и качество эмбрионов у
высокопродуктивных коров-доноров.
3. Установить влияние различных доз и схем введения препарата ФСГ СУПЕР на реакцию суперовуляции.
4. Изучить влияние уровня суперовуляции на качество и приживляемость эмбрионов.
Научная новизна;
Определены возможности использования коров в качестве разовых доноров эмбрионов в высокопродуктивных стадах на протяжении сервис-периода. Установлено положительное влияние высокоочищенного фолликулостимулирующего гормона на развитие доминантных фолликулов, овуляцию и эмбриопродуктивность животных. Повышение содержания лютеинизирующего гормона в препаратах ФСГ при обработке на суперовуляцию способствует лютеинизации доминантных фолликулов без овуляции. Стимуляция первого пула фолликулов перед гормональной обработкой коров на суперовуляцию увеличивает число доминантных фолликулов, выживаемость эмбрионов и повышает эмбриопродуктивность доноров.
Практическая значимость.
Повышение эффективности метода трансплантации эмбрионов в племенных хозяйствах при использовании высокопродуктивных коров в качестве одноразовых доноров эмбрионов в течении сервис-периода. Апробация работы. Результаты исследований были доложены на: международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных» (2007г.), международной научно-практической конференции «Современные методы репродукции сельскохозяйственных животных: становление и перспективы развития» (2008 г). Основные положения, выносимые на защиту.
- Результаты использования коров при разном физиологическом состоянии для гормональной стимуляции на реакцию суперовуляции и получение эмбрионов.
- Возможность использования коров селекционного ядра в качестве разовых доноров эмбрионов на протяжении сервис - периода.
Использование высокоочищенного фолликулостимулирующего гормона для стимуляции суперовуляции и повышения эмбриопродуктивности коров доноров эмбрионов.
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 114 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа содержит 20 таблиц и 19 рисунков, 2 приложения. Список литературы включает 147 источников, в том числе 52 на иностранных языках.
Публикации результатов исследований.
По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы, в т.ч. одна статья в журнале, рекомендованном бюллетенем ВАК.
Актуальность вопроса интенсификации воспроизводства стада
С внедрением в практику биотехнологических приемов разведения животных, в частности, у КРС - искусственного осеменения и метода трансплантации эмбрионов, резко повысилась гарантия получения потомства с ценными запрограммированными производственными признаками. Это стало возможным при повышении интенсивности разведения выдающихся особей с нужными генотипическими признаками, а также высокой достоверностью оценки этих признаков. Биотехнология сегодня понимается как целенаправленное вмешательство человека в сферу воспроизводства, направленное на получение наибольшего числа потомков от отдельно взятых особей. Кёниг И (24) называл размножение биотехнологическим способом планомерного вмешательства в физиологические процессы размножения, основывающийся на оптимальных зоотехнических предпосылках (селекции, кормлении, содержание, здоровье), с целью обеспечения повышения продуктивности и управления процессами воспроизведения животных, т. е. в нашем случае - использование генетического потенциала самца и самки путем повышения потомков.
Если искусственное осеменение позволяет наибольшего использовать в стадах самца, то цель метода трансплантации - максимальное использование самки, а именно, получение максимального количества потомков от одной женской особи (96, 98, 112, 135), при этом метод направлен на получение особей мужского пола.
Эффективность метода трансплантации определяется тем, на сколько успешно осуществляют операции по следующим технологическим звеньям: отбор коров - доноров и реципиентов; синхронизация охоты у коров - доноров и реципиентов: стимуляции суперовуляции у коров - доноров; осеменение коров - доноров при ответе суперовуляцией; извлечение у коров - доноров эмбрионов; оценка эмбрионов; хранение и криоконсервация эмбрионов; пересадка эмбрионов реципиентам. Использование биотехнологического метода разведения трансплантации эмбрионов в скотоводстве обусловлено следующим: 1. Относительно простой работой с крупным рогатым скотом при использовании метода нехирургического извлечения и пересадок эмбрионов; 2. Высокой племенной ценностью животного - донора, ввиду относительно малой производственной жизни и детерминацией на один отел в год; 3. Большим потенциалом возможного продуцирования яйцеклеток яичниками; 4. Высокой эффективностью пересадок эмбрионов реципиентам; 5. Коротким сроком проверки быков по качеству потомства.
Основным отрицательным моментом в скотоводстве является низкая воспроизводственная способность самки. Детерминация на один отел в год, одноплодность, длительный срок плодоношения, при норме выбраковки в среднем по стаду 25%, сдерживают темпы разведения. Многоплодные отелы встречаются лишь в 2-5% от общего числа, признак наследуется 2%-ми животных и носят скорей исключительный характер. В связи с этим возникла необходимость форсирования факта малоплодия в племенных стадах путем трансплантации эмбрионов. Суть метода заключается в том, чтобы получать от выдающихся коров большее число потомков путем пересадок эмбрионов этих животных менее ценным реципиентам.
Изучение вопросов фолликулогенеза, показало, что развитию одного доминантного фолликула сопутствует рост 20 фолликулов, что позволило разработать методы гормонального воздействия на яичники, создающие условия для роста, созревания и овуляции не единичных фолликулов. При естественном цикле в течение жизни самки развитие до стадии овуляторных доходят около 100 доминантных фолликулов, из которых 90% овулируют, т.е в среднем на один половой цикл приходится одна овуляция. Установлено, что потенциал яичников составляет от 70 до 200 тысяч ооцитов, способных при определенных условиях развиться до стадии доминантных с последующей их овуляцией. Это и явилось теоретической предпосылкой для разработки методов вызывания множественной овуляции у крупного рогатого скота (60, 73).
Межотельный период является интегральным показателем воспроизводительной способности коров. Он включает: сервис-период и период стельности. Сервис-период более точно и намного раньше, чем интервал между отелами выявляет потенциальные возможности воспроизводительной функции у коров. Он тесно связан с межотельным периодом (коэффициент корреляции составляет 0,9). Оптимальный сервис-период не должен превышать 80-ти дней. Однако, анализ сервис-периода, проведенный в ведущих племенных стадах черно-пестрой породы, выявил, что данный показатель воспроизводительной функции коров имеет высокий коэффициент изменчивости, который составил 61%.
Сервис-период в основном зависит от интервала между отелом и первым осеменением, и интервала между первым и последним, т.е. эффективным осеменением. Лучшие результаты осеменения высокопродуктивных коров, как правило, получают после 30-40 дней с момента отела. Это обусловлено тем, что первый половой цикл проявляется слабо, половая охота клинически плохо определяется или вовсе не обнаруживается (6).
Первое осеменение коров на втором месяце после отела не удлиняет сервис- и межотельный период. При оптимальном сервис-периоде до 80-ти дней после первого и второго осеменения средняя оплодотворяемость коров составляет 95-98%, а продолжительность межотельного периода не превышает одного года.
Фолликулогенез у крупного рогатого скота
Половой цикл - это чередование относительно длительной лютеальной фазы, в течение которой желтое тело вырабатывает прогестерон, и непродолжительной фолликулярной фазы, во время которой один или несколько зрелых фолликулов вырабатывают эстрогены. В течение полового цикла проходят 1-4 волны развития фолликулов. С их ростом и развитием изменяется динамика стероидогенеза яичников. Продолжительность полового цикла в норме у коров находится в пределах 18-24 дней, изменения длительности полового цикла, как правило, связаны с заболеваниями репродуктивных органов (30, 61, 66, 91, 94,136).
Исследования показывают, что функциональная деятельность яичника невозможна без определяющего влияния гонадотропных гормонов, хотя, по современным понятиям, она в значительной степени автономна, так как яичник имеет собственный, строго последовательный циклический ритм: созревание фолликула, овуляция и развитие желтого тела, его регрессия с последующим ростом фолликулов (53, 86,145).
Основные этапы фолликулогенеза и формирования гамет подразделяется на три периода: первый - охватывает рост фолликулов от стадии примордиальных до стадии крупных преполостных, когда происходит увеличение размеров ооцитов и активный синтез РНК; второй -рост фолликула от стадии крупного преполостного до предовуляторного, при этом ооцит достигает дефинитивных размеров; третий - заключительный, этап дифференцировки доминантного фолликула, предшествующий овуляции и формированию на его месте желтого тела, впоследствии преобразующегося в желтое тело беременности либо циклического, подвергающегося регрессии (49, 53,122,144).
Каждый растущий фолликул представляет собой постоянно меняющуюся структуру и среду. Отмечается способность рецепторов фолликулов на ранних стадиях захватывать большое количество ФСГ, в результате чего начинается синтез эстрогенов в фолликуле и его рост (55, 60). Синтез происходит по схеме: холестерины — прегнолон —» прогестины. У КРС прогестины под влиянием ЛГ частично преобразуются в андрогены. Также отмечалось, что размер фолликула положительно коррелирует с концентрацией эстрадиола и отрицательно - с андрогенами. Эстрогены усиливают деление клеток гранулезы, что повышает количество рецепторов к ФСГ в начале роста фолликула, а в конце - к ЛГ. Усиленное поглощение ФСГ и ЛГ стимулирует увеличение секреции эстрогенов.
Как показали исследования, рост примордиальных фолликулов происходит постоянно. Их число определяется, по всей вероятности, числом фолликулов, убывающим в результате атрезии и овуляции (55). При этом считается, что на начальных, стадиях рост фолликулов мало зависит от уровня гонадотропных гормонов, но, в дальнейшем, развитие идет непосредственно под влиянием гонадотропинов (58, 137).
Вступление фолликулов в завершающую фазу роста и дифференцировки происходит под влиянием синтезируемых доминантным фолликулом эстрогенов по системе обратной связи на выделение гонадотропинов гипофизом. Их подъем оказывает двойное воздействие на популяцию растущих фолликулов. Увеличение уровня ФСГ обусловливает рост пула фолликулов, из которых впоследствии формируются предовуляторные. Повышение предовуляторного уровня ЛГ стимулирует овуляцию, образование желтого тела и атрезию полостных фолликулов, за исключением предовуляторных (28,119,120,126).
Установлено, что у крупного рогатого скота на протяжении полового цикла рост волн (пула) фолликулов происходит примерно с 7-дневным интервалом. Каждый пул фолликулов состоит из одного большого «доминантного» (10,2-12,8 мм в диаметре) и 5-6-ти меньшего размера ( 5 мм), которые растут медленнее и постоянно подвергаются регрессии. Доминантные фолликулы первых волн также подвергаются атрезии, а доминирующий последней волны - овуляции. Развитие больших фолликулов также происходит периодически, вне зависимости от стадии цикла. Рост первого пула приходится на 2-3-ий дни полового цикла, второй пул следует на 8-10-ый дни и третий - на 16-18-ый дни цикла. В яичнике коров атрезии подвергаются 70 % примордиальных, 29 % преполостных фолликулов (115, 132,138).
Овуляция является заключительной стадией в половом цикле и ведет к образованию новой эндокринной железы яичника - желтого тела. После образования желтого тела и увеличения секреции прогестерона тормозится развитие оставшихся фолликулов пула, что приводит к их атрезии. Ингибирующее действие на развитие фолликулов при дефиците ФСГ оказывают ингибин и андрогены. Все эти факторы усиливают процесс атрезии фолликулов, снижая пролиферативное действие эстрадиола на клетки гранулезы. Андрогены совместно с маточным простагландином дестабилизируют мембрану лизосом, вызывая аутолитические процессы в оболочках фолликулов. Наибольший пик секреции прогестерона желтым телом приходится на 8-14-ый дни полового цикла. После 16-го дня происходит лизис желтого тела под действием маточного простагландина, что приводит к росту нового пула с доминантными фолликулами (95, 123, 124).
В последнее время все больше внимания уделяется исследованиям по межклеточному взаимодействию в процессе роста и овуляции фолликулов, при этом атрезия фолликулов рассматривается как явление физиологического апоптозиса.
Завадовский М.М. (20) показал, что повышение уровня гонадотропных гормонов в крови самок стимулирует созревание и множественную овуляцию дополнительных яйцеклеток и, в конечном итоге, многоплодие. Предложенная им для вызывания полиовуляции сыворотка жерёбых кобыл - ГСЖК нашла широкое применение в воспроизводстве сельскохозяйственных животных многих стран. Сегодня для вызывания множественной овуляции используют препараты как сывороточного, так и гипофизарного происхождения (99, 101, 111). При сравнительном исследовании эффективности разных типов сывороточных гормонов наиболее высокая вариабельность выявлена при использовании нативной СЖК. Количество реагирующих животных колебалось в довольно значительных пределах - от 40 до 90% (68, 73). Более стабильных результатов удалось достичь при использовании стандартизированных, очищенных препаратов гипофизарных и плацентарных гонадотропинов (2, 73). Однако в опытах Rommel Р. применение и таких гормональных препаратов полностью не решило проблему изменчивости реакции яичников коров. У 25-45% животных яичники не реагировали на гонадотропные гормоны. Остальные 75-55% реагировали, но при этом коэффициент вариабельности составил от 40 до 75%, т.е. вариабельность настолько велика, что планирование программы эмбриопересадок стало просто невозможным. На результат гормонального стимулирования множественной овуляции большое влияние оказывают доза препарата, качество, схема введения. Исследования Seidel G. и соавторов (142) показали, что повышение дозы гормона приводит к увеличению реакции яичников донора. Вместе с тем, чрезмерная реакция суперовуляции приводит к ухудшению результатов. В опытах Seidel G., (142) повышение количества овуляций уменьшало выход качественных эмбрионов. Он считает, что одной из причин снижения реакции яичников коров является несоответствие соотношений ФСГ и ЛГ в препарате гонадотропина. По его данным, в ГСЖК оптимальным соотношением ФСГ и ЛГ является 2:1. В опытах Сергеева Н.И и др. (74) удавалось получать реакции суперовуляции 7,4 желтых тел, 3,1 нормальных эмбриона на донора.
Фолликулогенез у крупного рогатого скота
Важным звеном в технологии трансплантации эмбрионов в скотоводстве является отбор коров в доноры эмбрионов. Первично в потенциальные доноры отбирают коров по селекционным признакам.
Для исследования влияния физиологического состояния репродуктивных органов на реакцию суперовуляции и эмбриопродуктивность были отобраны 35 высокопродуктивных коров черно-пёстрой породы. Животных отбирали на основании селекционных и клинических признаков. В практике наиболее высокоценные животные, как правило, в большей степени подвергаются стрессам, проявляющимся в нарушении обмена веществ, заболеваниях репродуктивных органов, конечностей. В опыте 16 коров (46%) не имели в анамнезе послеродовых осложнений, время после отела до момента использования для гормональной стимуляции суперовуляции не менее 60 дней. "Проблемных" по воспроизводству - 10 животных (28%) - использовали после 3-х безрезультатных осеменений, и на момент обработки от отела прошло не менее 80 дней. 9 коров (26%) после лечения послеотельных осложнений и признанные здоровыми. Всех животных согласно методике обрабатывали ФСГ-СУПЕР в дозе 50 ед. Арморо. После гормональной стимуляции и проявления охоты на 7-й день стимулированного цикла у всех животных было определено состояние яичников методом ректальной пальпации. Степень реакции определяли по наличию и числу жёлтых тел, также учитывали количество неовулировавших доминантных фолликулов и фолликулярных кист.
Как видно из данных таблицы 3, яичники положительно отреагировали на введение фолликулостимулирующего гормона развитием доминантных фолликулов и овуляцией, в среднем, у 74% коров. Коровы здоровые и "проблемные" отреагировали положительной реакцией суперовуляции примерно на одном уровне - 94 и 89% (разница недостоверна). Среди животных, имевших в анамнезе диагноз «послеотельные осложнения», суперовуляция была установлена только у 30%. При этом в этой группе у большинства коров в яичниках были фолликулярные кисты (рис.5-7), приложение 2. Несмотря на одинаковое число здоровых и проблемных коров с положительной реакцией суперовуляции, уровень реакции был разным. У здоровых коров было выявлено, в среднем, 12 желтых тел на животное, а у проблемных - 7. У коров, имевших нарушения репродуктивной функции в послеродовой период и положительно отреагировавших на обработку гонадотропином, был низкий уровень реакции суперовуляции. В среднем, на реагировавшую корову было получено по 3-5 овулировавших фолликула.
Исследования яичников здоровых животных визуальным методом после убоя показали, что методом ректальной пальпации не было установлено 25 -30% овулировавших фолликулов. У "проблемных" коров, при одинаковом уровне стимулированных фолликулов со здоровыми животными, было выявлено, что не все доминантные фолликулы овулировали, часть подверглась лютеинизации без овуляции, хотя при ректальных исследованиях яичников неовулировавшие фолликулы и фолликулярные кисты в большинстве случаев выявлены не были.
При исследовании яичников от животных из группы «с послеотельными осложнениями» было выявлено, что стимулированные доминантные фолликулы и при низком уровне ответа на гонадотропины в большинстве случаев лютеонизировались без овуляции или превращались в фолликулярные кисты. Это и явилось, по-видимому, одной из причин отсутствия эмбрионов при извлечении у реагировавших животных этой группы. На рисунке 5 показан яичник с 3-мя жёлтыми телами и 2-мя фолликулярными кистами, диаметр которых более 2,0 см.
В то же время, у некоторых животных с послеотельными осложнениями при исследовании матки после убоя животного были выявлены очаговые воспалительные процессы (скрытые эндометриты), которые не были определены при ректальном обследовании.
В группе здоровых коров реакцией суперовуляции отреагировали 15 животных из 16 (94%). В среднем, на корову было обнаружено по 12 желтых тел. Качественные эмбрионы были получены от 12-(80%)) коров из 15 отреагировавших суперовуляцией на гонадотропины. На каждое животное, в среднем, было получено по 6 качественных эмбрионов. Пригодные эмбрионы были получены у 47% коров, донорами стали 30%) животных (от которых было получено 3 и более пригодных к трансплантации эмбрионов).
В группе "проблемных" животных суперовуляцией отреагировали 8 коров (89%о), при среднем уровне реакции 7 желтых тел. Качественные эмбрионы при положительной реакции были получены у 7 (87,5%) коров, на каждое животное было извлечено по 2,4 качественных эмбриона, донорами стали 15%. У животных с послеотельными осложнениями эмбрионы при извлечении отсутствовали.
Влияние высокоочищенного фолликулостимулирующего гормона на реакцию суперовуляции у коров и эмбриопродуктивность доноров
Получение стабильных результатов при гормональных обработках на суперовуляцию у коров зависит не только от физиологического состояния репродуктивной системы, но и от качества используемых гормональных препаратов. Для вызывания суперовуляции у животных нами были использованы препараты фолликулостимулирующего гормона - FSG-p и ФСГ-СУПЕР, отличающиеся по содержанию ФСГ и ЛГ. Препарат ФСГ-СУПЕР - высокоочищенный фолликулостимулирующий гормон с соотношением ФСГ:ЛГ 1000 (производство г. Боровск) был применён в опытных группах. Контролем служил препарат FSG -р производства фирмы «Schering» при соотношении ФСГ:ЛГ 5:1. Результаты применения препаратов ФСГ-СУПЕР и FSG -р представлены в таблице 6. Животных обрабатывали ФСГ-СУПЕР в общей суммарной дозе 50 ед. Арморо. и FSG-p в общей дозе 50 мг по схеме двух кратного введения в течении 4-х дней. Как видно из данных таблицы 6 использование высокоочищенного препарата ФСГ - Супер было более эффективным по сравнению с наиболее используемым в практике трансплантации гонадотропным препаратом американского производства FSG-p.
Под воздействием ФСГ-СУПЕР увеличилось число коров, ответивших на обработки реакцией суперовуляции на 12%, повысился уровень реакции на 1,2 жёлтых тела, в среднем, на животное или на 11% при практически одинаковой вариабельности (3-22 в контроле и 3-24 стимулированных доминантных фолликулов при использовании ФСГ-СУПЕР).
Выход качественных эмбрионов оказался выше на 1,1 эмбриона (24%) на донора при использовании ФСГ-СУПЕР при статистически достоверной разнице, несмотря на большее число извлеченных эмбрионов и яйцеклеток при использовании FSG -р.
Анализ оплодотворяемости ооцитов и выживаемости эмбрионов (таб. 7) на седьмой день показал, что оплодотворяемость при использовании гонадотропина ФСГ-СУПЕР была выше на 27% по сравнению с FSG- р, а выживаемость эмбрионов - на 8,7%. При применении ФСГ-СУПЕР было установлено в яичниках при реакции полиовуляции уменьшение числа неовулировавших доминантных фолликулов и образования фолликулярных кист.
При дальнейшем исследовании препарата ФСГ-СУПЕР оказалось, что результаты по получению эмбрионов варьировали в зависимости от применения препарата разной степени очистки (табл. 7). Препараты отличались по степени очистки от ЛГ и субстратов исходного материала, при этом во второй группе применяли препарат содержаний ФСГ по отношению к ЛГ менее 200.
При использовании препаратов разной степени очистки достоверно получили различные результаты реакций суперовуляции и извлечении эмбрионов. При одинаковом числе отреагировавших животных на гормональные обработки при использовании препарата высокой степени очистки от ЛГ (ФСГ 1000) овулировавших фолликулов было 14,4, а второй - 9,4. Результат извлечения также был различным - 10,9 яйцеклеток и эмбрионов в первой группе и 4,8 - во второй на положительного по извлечению животного. За счёт повышения числа овулировавших фолликулов и эмбриональной выживаемости в первой группе было получено 6,5 качественных эмбрионов на донора против 2,4 - во второй при статистически достоверной разнице. При контрольном убое после извлечения было выяснено, что уменьшение количества эмбрионов у животных с реакцией суперовуляции при использовании препарата второй серии происходило, прежде всего, за счет увеличения числа неовулировавших доминантных фолликулов.
Для увеличения количества доминантных фолликулов при стимуляции полиовуляции была проведена микростимуляция первого пула фолликулов перед гормональной обработкой на суперовуляцию (табл. 8). Из представленных данных таблицы 8 видно, что стимуляция первого пула фолликулов не изменила число животных, ответивших на гормональную обработку, но увеличила рост, развитие и овуляцию доминантных фолликулов на статистически достоверную величину в сравнении использованием препарата в дозе 50 ед. Арморо согласно инструкции.
Несмотря на снижение оплодотворяемости, качественных эмбрионов, было получено на донора, в среднем, на 2 эмбриона больше при статистически достоверной разнице оплодотворяемости по сравнению с применением препарата по инструкции. Получение большего количества качественных эмбрионов, по-видимому, связано с дополнительной овуляцией фолликулов первого пула. Снижение оплодотворяемости ооцитов (статистически достоверно), по-видимому, происходило за счёт увеличения овуляции доминантных фолликулов первого пула на стадии атрезии и старения яйцеклеток в этих фолликулах.
Таким образом, при гормональных обработках коров на суперовуляцию с применением препарата ФСГ-СУПЕР реакцию давали от 90 до 95% животных. Однако при применении ФСГ-СУПЕР в дозе 60 ед. Арморо положительными по извлечению стали 70% реагировавших животных. В схеме с предварительной стимуляцией первого пула фолликулов и обработке в дозе 50 ед. Арморо - 91%; при использовании дозы 50 ед. Арморо согласно инструкции - 83%.
Часть животных, реагировавших суперовуляцией в группах И, III были обработаны повторно в дозе 40 ед. Арморо. Как видно из данных табл.10 и рис. 9 (группа IV), при повторной обработке ранее реагировавших коров суперовуляцией реагировали 73%, уровень реакции от 3 до 19 жёлтых тел на донора при статистически достоверной разнице. Положительных по извлечению было на одном уровне с коровами при первой обработке, получили 7,5 пригодных эмбрионов на донора (табл.11).
Причину несоответствия результатов извлечения после реакции суперовуляции с результатами ректального исследования, объясняет морфологическое исследование яичников реагировавших животных. Основными причинами ошибок была локализация желтых тел, наличие неовулировавших фолликулов и фолликулов, подвергшихся лютеонизации без овуляции. При ректальном исследовании также не были определены жёлтые тела и неовулировавшие доминантные фолликулы, расположенные глубоко в строме яичника (рис. 10, 11, 14, 15), находящиеся рядом друг с другом. Так, при визуальном исследовании яичника животного, реагировавшего суперовуляцией, установлено дополнительно около 30% желтых тел и неовулировавших фолликулов. Оказалось, что затруднительно определение в реакции количества фолликулов, подвергшихся лютеонизации без овуляции. Поэтому качественная оценка реакции суперовуляции (определение количества неовулировавших фолликулов, кист и желтых тел) методом ректальной пальпации не может быть точной и только позволяет определить степень реакции: отсутствие от 0-3, слабая 3-9, хорошая 10-15 и высокая 16 и более овуляций на животное.
