Введение к работе
Актуальность проблемы. Острые респираторные вирусные инфекции являются самыми массовыми заболеваниями. Они составляют около 90% всей инфекционной патологии и остаются одной из наиболее значимых медицинских и социально-экономических проблем. Наибольшее эпидемическое значение имеют вирусы гриппа А и В [Лобзин Ю.В. Жданов К.В., 2011]. Прогнозирование течения гриппа и раннее выявление его осложнений представляют множество диагностических трудностей. В структуре осложнений этой инфекции ведущее положение занимают острые вирусно-бактериальные пневмонии [Горбунов В.В. и др., 2011; Шувалова Е.П., 2005].
В патогенезе инфекционных заболеваний огромную роль играет состояние иммунологической реактивности больного [Ющук Н.Д., Вегенеров Ю. Я, 2009]. Характерным признаком инфекционных заболеваний является широкая вариабельность устойчивости к инфекции. В значительной степени она обусловлена полиморфизмом генов, детерминирующих элементы врожденного и адаптивного иммунитета [Цыган В.Н. с соавт., 2011]. Исследование этих генетических детерминант позволяет определять индивидуальный прогноз инфекционного заболевания, изучать его патогенез и потенциальные мишени для терапевтического вмешательства [DeVincenzo J. P., 2007].
Тяжелейшим осложнением гриппа является тромбоз и ассоциированная с ним тромбоэмболия легочной артерии. При гриппе типа A H1N1v частота ТЭЛА в группе пациентов с летальным исходом достигает 20% [Ларева Н.В., Лузина Е.В., Кузнецова И.А., 2010].
В настоящее время накоплены убедительные доказательства того,что в патогенезе тромбоза значимое влияние оказывает генетический полиморфизм протромбина, акцеллерина и ферментов, метаболизирующих гомоцистеин [Богданов И.Г. с соавт., 2007; Страмбовская Н.Н., 2007; D’Amato N. et al., 2010; Charafeddine K.M. et al., 2010]. Ключевую роль в развитии тромботических осложнений играет тканевой фактор [Osterud B., 2010]. Однако влияние полиморфизма гена этого белка на развитие тромбоза практически не изучено.
Исследование генетического полиморфизма молекул иммунного ответа и гемостаза при гриппе A H1N1v позволит углубить представления о патогенезе и разработать новые эффективные методы прогнозирования и ранней диагностики осложнений этого заболевания.
Целью работы явилось изучение роли генетического полиморфизма некоторых молекул иммунного ответа и гемостаза в норме и в патогенезе тяжелого течения гриппа А Н1N1v.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи.
1. Изучить распространенность генетических полиморфизмов CD14, TNF, IL4, FCGRIIA у здоровых лиц и больных гриппом A H1N1v.
2. Выявить ассоциацию носительства генетических полиморфизмов CD14, TNF, IL4 и FCGRIIA с тяжестью течения гриппа A H1N1v.
3. Исследовать полиморфные маркеры TF, MTHFR, FII и FV у больных с летальным исходом гриппа A H1N1v и проследить их связь с развитием ТЭЛА.
4. Оценить функциональную экспрессию TF моноцитами крови здоровых лиц у носителей различных аллельных вариантов D-1208I . Выяснить влияние полиморфного маркера D-1208I на уровень и прокоагулянтную активность микровезикулярной формы TF в плазме крови здоровых лиц.
5. Изучить воздействие мутации D-1208I на уровень экспрессии TF макрофагами легочной ткани у больных с летальным исходом гриппа А Н1N1v.
Научная новизна. Впервые установлено, что генотип CС полиморфизма CD14 C-159T ассоциирован с тяжелым и осложненным течением гриппа, а гаплотип [CD14 (159СС); FCGR2A (166Arg/Arg)] сопряжен с летальным исходом заболевания. Обнаружено, что G-аллель полиморфного маркера TNF у больных со средней и тяжелой степенью тяжести гриппа A H1N1v встречается чаще, чем у здоровых.
Впервые выявлено, что развитие ТЭЛА у больных гриппом А H1N1v ассоциируется с носительством Т-аллели MTHFR C-677T. У пациентов с летальным исходом гриппа А H1N1v, осложненного ТЭЛА, встречается только гомозиготное носительство полиморфизма тканевого фактора D-1208I (генотипы DD и II). Среди больных гриппом A H1N1v без тромботических осложнений и у здоровых лиц преобладает гетерозиготное носительство гена TF D-1208I. Макрофаги легочной ткани гетерозиготных больных с летальным исходом гриппа A H1N1v экспрессируют TF в меньшей степени.
Впервые установлено, что здоровые гетерозиготные носители полиморфизма D-1208I имеют сниженный уровень и моноцитарной экспрессии TF, по сравнению с гомозиготными. Носительство генотипа II этого полиморфизма сопровождается повышением уровня микровезикулярного TF в плазме крови здоровых лиц. Мутация D-1208I не сопряжена с изменением прокоагулянтной активности микровезикулярного TF.
Теоретическая и практическая значимость работы. В результате исследования получены ранее неизвестные сведения о генетических особенностях функционирования TF у здоровых лиц. Здоровые гетерозиготные носители имеют сниженную моноцитарную экспрессию TF по сранению с гомозиготными носителями.
Получены новые данные о патогенезе гриппа A H1N1v, демонстрирующие роль полиморфизмов генов CD14, TNF, IL4, FCGRIIA, TF, MTHFR, FII и FV в механизме развития заболевания. Носительство аллелей СD14, FCGRIIA, TF и MTHFR оказывает влияние на тяжесть течения гриппа A H1N1v. Выявленные факты позволяют разработать новые методы прогнозирования тяжести течения гриппа A H1N1v. Сведения о наличии полиморфизмов генов CD14, TNF, IL4, FCGRIIA, TF, MTHFR, FII и FV могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и совместно с другими факторами использоваться для определения риска развития тяжелых и осложненных форм гриппа A H1N1v.
Внедрение в практику. Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедры нормальной физиологии и в работу НИИ Медицинской экологии ЧГМА.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на девятой региональной межвузовской научно-практической конференции молодых ученых «Медицина завтрашнего дня» (Чита, 2010), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Итоги эпидемии гриппа A H1/N1» (Чита, 2010), на Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), на III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2011), на XIV Всероссийском форуме с международным участием им. Академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), на Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2012» (Москва, 2012), на 22nd International Congress on Thrombosis (Nice, France, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 7 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 216 работ, из них – 36 отечественных и 180 зарубежных авторов, иллюстрирована 21 таблицей, 20 рисунками.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Предрасположенность к тяжелому течению гриппа A H1N1v, осложненному пневмонией, детерминирована генетическим полиморфизмом CD14 C-159T, и FCGRIIA H-166R. Гаплотип [CD14 (159СС); FCGR2A (166RR)] сопряжен с тяжелым течением заболевания и летальными исходами. Полиморфные маркеры TNF G-308A и IL4 C-589T не оказывают значимого влияния на тяжесть течения гриппа A H1N1v. Однако G-аллель полиморфного маркера TNF у больных гриппом A H1N1v встречается чаще, чем у лиц контрольной группы.
2. Тромботические осложнения при летальных исходах гриппа А H1N1v, осложненного ТЭЛА, ассоциированы с полиморфизмом тканевого фактора D-1208I и MTHFR C-677T. У таких больных встречается только гомозиготное носительство полиморфизма тканевого фактора D-1208I (генотипы DD и II). Экспрессия TF макрофагами легких у носителей гетерозиготных и гомозиготных аллелей D-1208I существенно отличается. У гомозиготных носителей аллелей D-1208I экспрессия TF в два раза выше, чем у гетерозиготных. Носительство генотипа II этого полиморфизма сопровождается повышением уровня микровезикулярного TF в плазме крови. Мутация гена TF D-1208I не влияет на прокоагулянтную активность микровезикулярного TF. Здоровые гетерозиготные носители полиморфизма D-1208I имеют сниженный уровень моноцитарной экспрессии TF, по сравнению с гомозиготными.
