Введение к работе
Актуальность проблемы. Знания по физиологии взрослых сельскохозяйственных животных опираются на систематический экспериментально-физиологический анализ. Экспериментальный подход к изучению особенностей физиологии сельскохозяйственных животных в раннем онтогенезе продолжает еще в большей мере осуществляться лишь эпизодически и по частным поводам. Знания особенностей физиологии сельскохозяйственных животных в раннем онтогенезе весьма скудны. Почему и сейчас еще дает о себе знать необходимость эмпирического решения многих проблем, касающихся различных сторон развития организма всех видов сельскохозяйственных животных (Лысов В.Ф., 1977; Лысов В.Ф. и др., 2003).
Цикл индивидуального развития организма определяется наследственностью. Наследственные возможности в полной мере реализуются лишь в том случае, если на каждом этапе развития организму будут обеспечены те условия среды, которые для него специфичны и обязательны (Максимов В.И., 1974). В зависимости от степени отклонений условий среды от требующихся в фазе новорожденности имеет место либо адаптация организма, либо возникновение разнообразных форм патологии.
Крупным достижением ветеринарной науки явилось введение в практику различных средств и приемов, рассчитанных на восстановление нарушенного хода физиологических процессов при болезни животных. Однако использование всех этих средств и приемов не всегда приводит к эффективному результату, и успех или неуспех коррекции зависит в значительной степени от состояния местной и общей реактивности организма. Местная и общая реактивность организма изменяется в ходе онтогенеза, формирования структур и функций (Карпунь И.М., 1989).
В общей структуре отклонений от физиологического состояния у животных значимое место занимают функциональные нарушения в системе пищеварения у молодняка. По данным департамента ветеринарии МСХ РФ на их долю приходится более 50% случаев отклонений от физиологического состояния, нередко приводящие к гибели животного (Мосийко В.И. и др., 1989; Кондрахин И.П., 2003).
Функциональные нарушения пищеварения молодняка крупного рогатого скота в первые дни жизни широко распространены и являются одной из основных проблем ветеринарной практики, нанося значительный экономический ущерб (Урбан В.П. и др., 1984). Изучение этих состояний, разработка новых способов их коррекции и профилактики является неотложной проблемой ветеринарии, т.к. удельный вес функциональных нарушений пищеварения в заболеваемости молодняка составляет 40-60%, а падеж – 15-70% от общего числа новорожденных (Кибкало Л.И. и др., 2006; Мищенко В.А. и др., 2001). Это связано, прежде всего, с нарушением технологии содержания и кормления животных, несовершенством естественной защиты организма к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды (Зароза В.Г., 1985; Митюшин, В.В., 1988), а также с отсутствием разработанных подходов к коррекции нарушений первичного гемостаза у новорожденных телят (Волков Г.К., 2003), дисфункции которого часто приводят к внутрисосудистой активации тромбоцитов, агрегации, микротромбозам во внутренних органах. Ущерб от функциональных нарушений пищеварения складывается из падежа, затрат на лечебные мероприятия, снижения продуктивных качеств и племенной ценности животных. Функциональные нарушения пищеварения имеют сложную этиологию, что создает трудности в коррекции и профилактике. Это вызывает необходимость поиска и разработки новых средств и схем коррекции, способных повысить эффективность ветеринарных мероприятий (Жолондзь Я.З., 1984; Немченко М.И. и др., 1991). Особое значение в связи с высокой частотой возникновения у новорожденных телят функциональных нарушений пищеварения и для снижения причиняемого ущерба приобретает профилактика (Евдокимов С. М., 1997; Немченко, М.И., 1988; Субботин В.В. и др., 1998).
В настоящее время становится ясно, что функциональные нарушения пищеварения проявляются не только функциональным расстройством пищеварения, но и ведут к ряду общих изменений в организме: к дисфункциям тромбоцитов, обуславливающим нарушение реологии крови, возникновению гипоксии и нарушениям сердечной недостаточности, снижению резистентности к респираторным болезням, интоксикации, нарушению обмена веществ и др. (Зинкевич, А.М., 1985; В.М. Подкопаев В.М. и др.,1985; Кондрахин, И.П., 2003; Конопаткин, А.А.,1984).
Повышение склонности к агрегации кровяных пластинок у новорожденных телят ухудшает микроциркуляцию тканей и способствует тромбообразованию. В тоже время, характер возникающих сдвигов в первичном звене гемостаза и тонкие механизмы их реализации у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения изучены недостаточно. При этом патогенез тромбоцитопатии остается не раскрыт и не разработаны патогенетически обоснованные подходы ее коррекции.
Остается невыясненным влияние различных индукторов и их сочетаний на агрегационные функции кровяных пластинок, имеющее место в реальных условиях кровотока, не оценена морфологически степень активации тромбоцитов в просвете сосудов у новорожденных телят с риском развития и возникшими функциональными нарушениями пищеварения, не выяснено у них состояние ПОЛ тромбоцитов и активность антиокислительных ферментов кровяных пластинок, состояние тромбопластинообразования, липидный состав тромбоцитарных мембран и особенности обмена арахидоновой кислоты в кровяных пластинках. Не разработана тактика мероприятий, направленных одновременно на восстановление гемостатических нарушений с оптимизацией микроциркуляции, нормализацией обменных процессов и коррекцию функциональных нарушений пищеварения у новорожденных телят.
Ранее не оценивались в сравнительном аспекте возможности различных методов коррекции с изолированным и сочетанным использованием энтеросорбентов и современных антимикробных препаратов - производных полигексаметиленгуанидина на агрегационную активность кровяных пластинок с различными индукторами и их сочетаниями in vitro и в условиях кровотока (in vivo). Не проводилась их сравнительная оценка по возможности корректировать морфологические изменения тромбоцитов при их активации в просвете сосудов у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения. Не выяснено состояние ПОЛ, содержание средних молекул и активность антиокислительных ферментов в тромбоцитах у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения на фоне данной коррекции. Остается не исследованной динамика тромбопластинообразования, липидного состава тромбоцитарных мембран и особенности обмена арахидоновой кислоты в кровяных пластинках у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения с помощью данных видов коррекции. В этой связи были сформулированы цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования. Определить динамику параметров тромбоцитарного гемостаза у физиологически зрелых телят в период новорожденности, выявить его особенности при функциональных нарушениях пищеварения для поиска путей эффективной коррекции тромбоцитопатии.
Задачи исследования
-
Изучить состояние тромбоцитарных функций у физиологически зрелых здоровых новорожденных телят;
-
Исследовать состояние тромбоцитарных функций у телят имеющих функциональные нарушения пищеварения в фазу новорожденности, находящихся в обычных хозяйственных условиях выращивания;
-
Определить в плазме крови и тромбоцитах здоровых телят в фазу новорожденности содержание средних молекул, активность перекисного окисления липидов, уровень антиоксидантной защиты и липидный состав кровяных пластинок;
-
Определить динамику содержания средних молекул, активности перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной защиты плазмы крови и тромбоцитов, изменения липидного состава кровяных пластинок предрасполагающую к развитию тромбоцитарных дисфункций у новорожденных телят с риском развития функциональных нарушений пищеварения;
-
Оценить в плазме крови и тромбоцитах телят с функциональными нарушениями пищеварения в фазу новорожденности содержание средних молекул, активность перекисного окисления липидов, состояние антиоксидантной защиты и липидного состава кровяных пластинок;
-
Определить степень влияния различных подходов к коррекции тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения;
-
Разработать и апробировать способ профилактики тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с риском развития функциональных нарушений пищеварения.
Научная новизна исследования
-
Впервые у здоровых физиологически зрелых и физиологически незрелых новорожденных телят, до возникновения функциональных нарушений пищеварения и после их развития изучено состояние первичного гемостаза, антиоксидантной защиты тромбоцитов, липидный состав их мембран, активность ПОЛ, и установлено гематологическими исследованиями у телят, подверженных риску возникновения функциональных нарушений пищеварения, что еще до проявления внешне выраженных признаков расстройства пищеварения выявляются повышенный уровень средних молекул, активация ПОЛ и ослабление антиоксидантной защиты жидкой части крови и тромбоцитов с признаками тромбоцитопатии.
-
Разработан и апробирован способ коррекции функциональных нарушений пищеварения у новорожденных телят, нормализующий активность тромбоцитов, включающий в себя сочетание «Фосфопага», энтеросорбента «Экос» и кальция глюконата.
-
Полученные данные о повышенном содержании в плазме крови средних молекул, активизации ПОЛ плазмы и тромбоцитов при наличии мембранопатии кровяных пластинок у новорожденных телят с обязательно развивающимися у них в последующем функциональных нарушений пищеварения и тромбоцитопатии, позволяет считать эти изменения ранними предвестниками их развития и служить основанием для проведения мер профилактики, направленных на нормализацию свойств тромбоцитов.
-
Для практического применения предложен способ профилактики развития функциональных нарушений пищеварения и тромбоцитопатии у новорожденных телят с нормализацией у них субфизиологических нарушений первичного гемостаза, включающий сочетание «Фосфопага», энтеросорбента «Экос» и кальция глюконата.
Практическая значимость работы
-
Установлено, что у физиологически зрелых телят в течение всей фазы новорожденности сохраняется стабильность функционального состояния кровяных пластинок, способствуя адаптации организма животного к внеутробному существованию.
-
Выяснена патогенетическая роль повышения уровня средних молекул, активации ПОЛ, ослабления антиоксидантной защиты плазмы и тромбоцитов в формировании реологических нарушений тромбоцитов у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения, что открывает новое направление для поиска средств нормализации первичного гемостаза.
-
Проведенная апробация различных корректирующих подходов (традиционная коррекция, сорбент «Экос», «Биопаг-Д», «Фосфопаг», сочетание «Фосфопага» и «Экоса», а также сочетание «Фосфопага», «Экоса» и кальция глюконата) позволила выявить наиболее эффективный способ коррекции тромбоцитопатии при функциональных нарушениях пищеварения и их профилактики у новорожденных телят, состоящий из «Фосфопага», «Экоса» и кальция глюконата, способный полностью нормализовывать липидный состав мембран тромбоцитов, антиоксидантную защиту, активность ПОЛ плазмы и кровяных пластинок и реологические дисфункции тромбоцитов, исключая тромботические осложнения, нарушения микроциркуляции и ослабление трофики тканей растущего организма.
-
У новорожденных телят с риском развития функциональных нарушений пищеварения для профилактики развития тромбоцитопатии необходимо восьмидневное применение сочетания «Фосфопага», «Экоса» и глюконата кальция.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Показатели тромбоцитарного гемостаза у здоровых телят характеризуются стабильностью показателей в фазу новорожденности.
-
При функциональных нарушениях пищеварения у новорожденных телят происходит активация тромбоцитарного гемостаза с усилением агрегации кровяных пластинок in vivo и in vitro.
-
Реологические свойства кровяных пластинок при функциональных нарушениях пищеварения у новорожденных телят изменяются в результате повышения активности ПОЛ и увеличения содержания средних молекул в плазме крови и тромбоцитах, что способствует ухудшению микроциркуляции.
-
Применением «Фосфопага», глюконата кальция и сорбента «Экос» у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения можно корректировать уровень средних молекул, активность ПОЛ, антиоксидантную защиту плазмы и тромбоцитов, и тем самым способствовать выздоровлению животных.
-
Комплекс препаратов, включающий «Фосфопаг», глюконат кальция и сорбент «Экос» у физиологически незрелых новорожденных телят с риском развития функциональных нарушений пищеварения нормализует субфизиологические отклонения в тромбоцитарном гемостазе.
Реализация результатов исследования. Полученные данные внедрены в работу ветеринарной службы Фатежского, Советского, Суджанского, Октябрьского, Золотухинского, Курского, Железногорского, Обоянского, Конышовского районов Курской области и в педроцесс в Белгородской сельскохозяйственной академии.
Апробация. Апробация проведена на расширенном заседании кафедры АФК и спорта КИСО (филиал) РГСУ, кафедры физиологии Курской государственной сельскохозяйственной академии им. И.И. Иванова с привлечением сотрудников Белгородского государственного университета, Белгородской сельскохозяйственной академии и Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии РАСХН 27 декабря 2007г.
Публикации. Материалы диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Экология, окружающая среда и здоровье населения Центрального Черноземья (2005), X съезде биохимиков Украины (2006), Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических, технико-экономических сфер жизни общества (2007, 2008), IV научной конференции с международным участием «Проблемы агропромышленного комплекса (2007), XI Международной научно-производственной конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (2007), 19 Международной межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (2007), научном симпозиуме специалистов, молодых ученых и студентов «Адаптивные реакции в биологии и медицине» (2007, 2008) в рамках Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических и технико-экономических сфер жизни общества».
По теме диссертации опубликованы 62 работы, в т.ч. 2 монографии, 9 статей в журналах, вошедших в перечень, рекомендованный ВАКом, получено 3 патента на изобретение.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя использованной литературы, содержащей 364 отечественных и 78 зарубежных источника, двух приложений, полностью раскрывающих суть примененных корректирующих подходов. Диссертация изложена на 250 страницах машинописи, включает 57 таблиц и 34 рисунка.
Характеристика обследованных телят
Материалы диссертации получены при работе в Курском институте социального образования (филиал) РГСУ совместно с Медведевым Ильей Николаевичем и Беловой Татьяной Александровной, давших согласие на их оформление в виде диссертационного исследования.
Под наблюдением находились телята хозяйств Курской области. В исследование включались здоровые новорожденные телята сементальской и чернопестрой породы в день отела от здоровых коров 1-2 отела с нормально протекавшей беременностью и не имевших отклонений в результатах лабораторных анализов согласно использованных в настоящей работе методов. Во время беременности коровы, полученные от которых телята были включены в настоящее исследование, находились на рациональном режиме питания (Калашников А.П., 2003). Общее количество телят, прошедших первичный осмотр и обследование, составило 449 голов. Здоровые телята осматривались и обследовались за период новорожденности 5 раз (1-2 сут., 3-4 сут., 5-6 сут., 7-8 сут., 9-10 сут.). Все оставшиеся здоровыми телята были физиологически зрелыми. В случае возникновения признаков ФНП у теленка не позднее, чем через 0,5 суток, определялись все оцениваемые показатели и применялся в течение последующих 10 дней один из используемых в работе видов коррекции с оценкой тех же показателей по ее завершению. Общее число телят, у которых за период новорожденности развились ФНП, составило 153 (36,7%), при этом 296 (63,3%) остались здоровыми, в т.ч. 29 здоровых новорожденных телят с риском облигатного развития ФНП, которым был проведен курс успешной профилактической коррекции. Из новорожденных телят с развившимися ФНП 146 (95,4%) имели признаки физиологической незрелости. Содержание новорожденных животных осуществлялось в стандартных условиях телятника при нередко избыточной выпойке молозивом.
С учетом способа коррекции тромбоцитарных нарушений новорожденные телята с ФНП были подразделены на 6 групп. Количество новорожденных животных с ФНП в группах составило соответственно 25(16,4%), 25 (16,4%), 25 (16,4%) 25 (16,4%), 27 (17,4%) и 26 (17,0%). В первой группе новорожденных телят с ФНП в течение 10 суток коррекцию производили с помощью традиционного для данных хозяйств подхода, включающего голод на 10-12 часов с последующим назначением небольших доз молозива (1/4 от обычного количества) 5-6 раз в сутки с постепенным доведением его объема молозива до нормы. За 15 мин до выпаивания телятам давали 50,0мл натурального желудочного сока, разбавленного 50,0мл теплой воды.
Вторую группу составили телята, которым в схему выпаивания вечером включали в виде водной взвеси гидроалюмосиликатный сорбент – «Экос» (производство Белгородского государственного университета) 150мг/кг живой массы в течение 10 суток на ночь.
В третьей группе животных коррекцию производили выпаиванием утром 0,01% раствора полигексаметиленгуанидин хлорида («Биопаг-Д», производства Института эколого-технологических проблем г.Москва) по 100,0 мл в сутки в течении 10 дней.
Четвертая группа новорожденных телят находилась на коррекции с помощью выпаивания утром полигексаметиленгуанидин фосфата («Фосфопаг», производства Института эколого-технологических проблем г.Москва) в растворе 0,01% по 100,0 мл в сутки в течении 10 дней.
В пятой группе новорожденных телят с ФНП в течение 10 дней применялось сочетание «Фосфопага» и «Экос» с распределением их в течение суток следующим образом: 0,01% «Фосфопага» 100,0 в утренние часы, а «Экос» 150мг/кг на ночь для исключения сорбции «Экосом» «Фосфопага».
В шестой группе новорожденных телят в течение 10 суток было применено сочетание 0,01% «Фосфопаг» 100,0 мл утром, 10% 10,0 мл глюконата кальция в обед и «Экос» 150мг/кг вечером.
Группа контроля представлена 267 здоровыми новорожденными телятами, не имевшими отклонений в объективном статусе и в результатах лабораторных исследований.
Группа профилактической коррекции представлена 29 здоровыми новорожденными телятами с риском облигатного развития ФНП, обследованных в суточном возрасте. С целью профилактики ФНП и нивелирования зарегистрированных у них отклонений, проводился 8-дневный превентивный курс коррекции: 0,01% «Фосфопаг» 100,0 мл утром, 10% 10,0 мл кальция глюконат в обед и «Экос» 150мг/кг вечером.
Методы исследования
Морфо-биологический анализ крови включал определение эритроцитов и лейкоцитов (Битюков И.П. и др., 1990); гемоглобина – гемоглобинцианидным методом; гематокритной величины – по И.Тодорову (1963); общего белка в сыворотке крови (Колб В.Г. и др., 1982).
Активность перекисного окисления липидов в плазме оценивалась по содержанию ТБК-активных продуктов набором фирмы ООО „Агат-Мед” и ацилгидроперекисей (Гаврилов В.Б. и соавт., 1983). Для оценки антиокислительного потенциала жидкой части крови определялась ее антиокислительная активность по Волчегорскому И.А. и соавт. (2000). В плазме оценивали уровень средних молекул по Габриелян Н.Г., Липатова В.И. и др. (1985) при 280нм и 254нм.
Состояние внутритромбоцитарного ПОЛ определяли по концентрации базального уровня МДА в реакции восстановления тиобарбитуровой кислотой в отмытых и ресуспендированных тромбоцитах на основе принципа метода Shmith J.B. et al. (1976) в модификации Кубатиева, А.А., Андреева С.В. (1979) и содержанию ацилгидроперекисей (Гаврилов В.Б. и соавт., 1983). В отмытых и ресуспендированных тромбоцитах определяли содержание средних молекул по Габриелян Н.Г., Липатова В.И. и др. (1985) при 280нм и 254нм., уровни общего холестерина энзиматическим колориметрическим методом набором „Витал Диагностикум” и общих фосфолипидов по содержанию в них фосфора (Колб, В.Г. и др., 1982) с последующим расчетом отношения ХС/ОФЛ в тромбоцитах. Активность внутритромбоцитарных антиоксидантных ферментов устанавливали для каталазы и супероксиддисмутазы (Чевари С. и др., 1991).
Подсчитывали количество тромбоцитов в капиллярной крови в камере Горяева. Агрегационная активность тромбоцитов оценивалась визуальным микрометодом по Шитиковой А.С. (1999) с использованием в качестве индукторов АДФ (0,510-4 М.), коллагена (разведение 1:2 основной суспензии), тромбина (0,125ед/мл.), ристомицина (0,8 мг/мл.), адреналина (5,010-6 М.), а также сочетания АДФ+адреналин, АДФ+коллаген и коллаген+адреналин в приведенных концентрациях.
Продукты лабилизации тромбоцитарных фосфолипидов – активаторы свертывания (Ф3 –тромбоцитов) оценивали по методу Е.Д. Еремина (1974) с вычислением индекса тромбоцитарной активности. Активность и время образования тромбоцитарного тромбопластина выявляли по методу Biggs R., Douglas A.S., Macfarlane R.G. (1953).
Для косвенной оценки обмена эндогенной арахидоновой кислоты в тромбоцитах, а также активности в них циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы – ферментов, непосредственно осуществляющих образование тромбоксана в кровяных пластинках, использованы три пробы переноса по методу Ермолаевой Т.А. и соавт. (1992) с регистрацией агрегации тромбоцитов на фотоэлектроколориметре.
Морфологическое определение внутрисосудистой активности тромбоцитов производилось с использованием фазово-контрастного микроскопа по методу Шитиковой А.С. и соавт. (1997).
Производилось измерение температуры тела животного, подсчет ЧСС, ЧДД при каждом осмотре.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия (t) Стьюдента и коэффициента корреляции (r) (Бредерфорд Хилл А., 1958; Углова М.В. и др., 1982).
