Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Современные концепции пищеварения 12
1.1.1. Полостное (внеклеточное или дистантное пищеварение) 12
1.1.2. Внутриклеточное пищеварение 13
1.1.3. Мембранное пищеварение 14
1.1.4. Аутолитическое пищеварение 18
1.1.5. Симбионтное пищеварение 19
1.1.6. Транспортные системы пищеварительного тракта рыб 21
1.2. Структурно-функциональная организация пищеварительной систе- 23
мы рыб
1.2.1. Морфологические и ультраструктурные особенности пищеварительного тракта рыб
1.2.2. Особенности гидролиза пищевых субстратов в пищеварительном тракте рыб
1.2.3. Влияние характера питания на активность пищеварительных ферментов
1.3. Влияние факторов среды на пищеварительные процессы рыб 36
1.3.1. Влияние температуры на процессы пищеварения у рыб 36
1.3.2. Влияние концентрации водородных ионов на процессы пищеварения рыб
1.3.3. Влияние ионов металлов на процессы пищеварения рыб 42
1.3.4. Взаимодействие пищевых веществ в процессе пищеварения рыб
ГЛАВА. 2. Материал и методы исследования 51
2.1. Объекты исследования 51
2.2. Условия проведения экспериментов 52
2.3. Методы исследования 56
2.3.1. Методы определения активности ферментов слизистой оболочки кишечника рыб
2.3.1.1 Определение уровня активности -амилазы 56
2.3.1.2 Определение уровня активности мальтазы 57
2.3.1.3 Определение уровня активности щелочной фосфатазы 58
2.3.1.4 Определение уровня активности казеинлитических протеи- 59 наз
2.3.2 Методы гистологических исследований 60
2.3.2.1 Методы световой микроскопии 60
2.3.2.2 Методы трансмиссионной электронной микроскопии 61
2.3.3 Методы математического анализа 62
ГЛАВА 3. Структурная организация кишечника осетровых видов рыб и их гибридов
3.1. Гистологическая характеристика кишечного эпителия осетровых видов рыб и их гибридов
3.2. Сравнительная характеристика ультраструктуры кишечного эпителия осетровых рыб и их гибридов
ГЛАВА 4. Влияние температуры инкубации на активность пищеварительных ферментов осетрообразных видов рыб и их гибридные формы
4.1. Влияние температуры инкубации на активность карбогидраз 102
4.2. Влияние температуры инкубации на активность щелочной фосфатазы
4.3. Влияние температуры инкубации на активность казеинлитических протеиназ
4.4. Сравнительный анализ реакции ферментных систем слизистой оболочки кишечника родительских видов и их гибридных форм на изменение температуры инкубации
4.4.1. Сравнительный анализ реакции ферментных систем русского осетра, ленского осетра и их гибрида (РОЛО) на изменение температуры инкубации
4.4.2. Сравнительный анализ реакции ферментных систем белуги, стерляди и их гибрида (Бестера) на изменение температуры инкубации
4.4.3. Сравнительный анализ реакции ферментных систем стерляди, белуги и их гибрида (Стербела) на изменение температуры инкубации
ГЛАВА 5. Влияние концентрации водородных ионов на активность пищеварительных ферментов осетрообрахных видов рыб и их гибридных форм
5.1. Сравнительный анализ реакции ферментных систем слизистой оболочки кишечника родительских видов и их гибридных форм на изменение рН инкубационной среды
5.1.1. Сравнительный анализ реакции ферментных систем русского осетра, ленского осетра и их гибрида (РОЛО) на изменение рН инкубационной среды
5.1.2. Сравнительный анализ реакции ферментных систем белуги, стерляди и их гибрида (Бестера) на изменение рН инкубационной среды
5.1.3. Сравнительный анализ реакции ферментных систем стерляди, белуги и их гибрида (Стербела) на изменение рН инкубационной
среды
ГЛАВА 6. Влияние углеводов аминокислот а активность пищеварительных ферментов осетрообразных видов рыб
6.1. Влияние углеводов и аминокислот на активность -амилазы 186
6.2. Влияние углеводов и аминокислот на активность мальтазы 189
6.3. Влияние углеводов и аминокислот на активность щелочной фосфатазы
6.4. Влияние углеводов и аминокислот на активность казеинлитических протеиназ
ГЛАВА 7. Влияние ионов металлов на активность пищеварительных ферментов осетрообразных видов рыб
7.1. Влияние ионов металлов на активность -амилазы слизистой оболочки кишечника
7.2. Влияние ионов металлов на активность мальтазы слизистой оболочки кишечника
7.3. Влияние ионов металлов на активность щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника
7.4. Влияние ионов металлов на активность казеинлитических протеиназ слизистой оболочки кишечника
7.5. Исследование совместного влияния температуры и ионов металлов на активность щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника
ГЛАВА 8. Взаимодействие пищевых веществ 224
Процессе пищеварения в слизистой оболочке кишечника осетрообразных видов рыб и их гибридов заключение 232
Выводы 265
Список литературы
- Внутриклеточное пищеварение
- Методы определения активности ферментов слизистой оболочки кишечника рыб
- Сравнительная характеристика ультраструктуры кишечного эпителия осетровых рыб и их гибридов
- Сравнительный анализ реакции ферментных систем слизистой оболочки кишечника родительских видов и их гибридных форм на изменение температуры инкубации
Внутриклеточное пищеварение
Внутриклеточное пищеварение обеспечивает гидролиз нерасщепленного субстрата после его проникновения внутрь клетки (Кушак, 1983; Уголев, 1985; Jennings, 1972; Peptidetransport …, 1977). Данный тип пищеварения, описанный еще в позапрошлом веке (Мечников, 1880), до недавнего времени филогенетически считался самым древним, поскольку распространен у простейших и примитивных многоклеточных животных, но встречается и у многих высокоорганизованных многоклеточных (Barrington, 1962). Однако наибольшего признания получила другая точка зрения, в соответствии с которой внутриклеточное пищеварение возникло в результате объединения полосного и мембранного пищеварения эндоцитозом (Уголев, 1985).
Внутриклеточное пищеварение можно разделить на два типа. В результате первого через клеточные мембраны транспортируются в основном небольшие молекулы, и в дальнейшем они гидролизуются ферментами цитозоля, что было про демонстрированно для ряда дипептидов (Уголев, Иезуитова, 1982; Кушак, 1983; Уголев, 1985, 1986; Груздков и др., 1991; Уголев, Кузьмина, 1993). Второй тип пищеварения обеспечивается в основном лизосомами, в которых содержится широкий спектр гидролитических ферментов (DeDuve, 1977; Лизосомы, 1980; Немо-ва, Высоцкая, 2004). В данном случае поступающие в клетку путем пино- и фагоцитозом вакуоли, содержащие различные субстраты, соединяются с лизосомой, в результате чего образуется фагосома, в которой и происходит гидролиз. Механизм взаимодействия фермента с субстратом близок к таковому для дистантного пищеварения.
Данный тип пищеварения характеризует низкая скорость, так как он лимитирован проницаемостью мембраны и процессами эндоцитоза, в результате чего играет незначительную роль в обеспечении пищевых потребностей организма высших животных. Однако в некоторых случаях данный механизм может быть существенным для проникновения во внутреннею среду организма некоторых уникальных веществ, а также на ранних стадиях развития организма (Ferguson, 1979; Walker, 1979; Уголев и др., 1979, 1983; Уголев, 1985; Georgopoulou et al., 1986; Sire et al., 1992). В то же время у рыб данный тип пищеварения может играть существенную роль и во взрослом состоянии, на что указывает значительное количество инвагинаций апикальной мембраны, визикул и лизосом в энтероцитах дистального отдела кишечника (Жолдасова, Веригина, 1982; Уголев, Кузьмина, 1993).
Мембранное пищеварение осуществляется на границе внеклеточной и внутриклеточной среды за счет ферментов, локализованных на клеточной мембране энтероцитов. Локализация ферментов на мембране позволяет определенным образом ориентировать активные центры ферментов, в результате чего свободная ориентация каталитических центров ферментов по отношению к субстратам становится невозможной. Из-за этого глубоко расположенные связи в молекулах био полимеров недоступны действию ферментов, участвующих в процессах мембранного пищеварения, вследствие чего нутриенты, образовавшиеся в ходе полостного пищеварения, в первую очередь атакуются ферментами панкреатического происхождения, адсорбированными на слизистой поверхности кишечника, и лишь потом собственно кишечными ферментами, прочно связанными с клеточными мембранами (Уголев, 1963, 1967, 1972, 1980, 1985, 1991; Уголев и др., 1983; Груздков и др., 1991; Кузьмина, 2005).
Для рыб данный тип пищеварения был описан в 60-70 годы прошлого века (Берман, Саленице, 1966; Пегель и др., 1971; Уголев, 1972; Кузьмина, 1976, 1977), у данной группы животных этот тип пищеварения реализуется за счет ферментов, синтезируемых поджелудочной железой и адсорбируемых на щеточной кайме эн-тероцитов и собственно кишечными ферментами (Уголев, 1972; Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 2005). Панкреатические ферменты (-амилаза, липаза, проте-иназы) относятся к типу эндогидролаз и осуществляют промежуточные стадии гидролиза нутриентов. Эти ферменты, как правило, обладают небольшой молекулярной массой (до 50000 дальтон) и состоят из одной полипептидной цепочки. Панкреатические ферменты адсорбируются, как правило, в примембранном слое на структурах гликокаликса. Возможность адсорбции панкреатических ферментов описана для большинства групп позвоночных животных. Способность к адсорбции показана для -амилазы, липазы, эластазы, трипсина, химотрипсина и РНКа-зы (Уголев, 1967, 1972; Уголев и др., 1977а,б, 1983; Валенкевич и др., 1978; Уголев, Кузьмина, 1993; Huang et al., 1999; Кузьмина, 2005). Связывание панкреатических ферментов со структурами энтероцитов неодинаково, так, например, -амилаза легко поддаётся десорбции, в то время как различные протеиназы достаточно сложно (Goldberg et al., 1968, 1971).
Собственно кишечные ферменты представлены интегральными белками и обладают амфипатической структурой и состоят из двух частей - гидрофильной и гидрофобной. На гидрофильную часть приходится большая часть массы молекулы (до 95%), на этой части фермента локализованы каталитические центры. Гидрофобная часть состоит в основном из аминокислот, пронизывающих фосфоли 16 пидный бислой (Уголев и др., 1983). Синтез собственно кишечных ферментов осуществляется кишечными клетками с их дальнейшим включением в состав ли-попротеиновой мембраны. Данные ферменты можно отнести к экзогидролазам, осуществляющим, главным образом, заключительные этапы гидролиза биополимеров. Некоторые собственно кишечные ферменты (дипептидазы) являются периферическими, т.е. частично включенными в мембранный бислой, о чем свидетельствует их спонтанная солюбилизация (Lindberg et al., 1975; Уголев и др., 1975; Кушак, 1983).
К числу собственно кишечных ферментов относятся дисахаридазы, амино-пептидазы, дипептидазы, щелочная фосфатаза, моноглицеринлипаза, -амилаза и мн. др. Данные ферменты в активном состоянии- это олигомеры с большой молекулярной массой. Так, например, карбогидразы имеют массу более 200000 даль-тон, кишечная щелочная фосфатаза от 120000 до 150000 дальтон, аминопептида-зы - от 225000 до 280000 дальтон (Kelly, Alpers, 1973; Kim, 1977; Malik, Butter-worth, 1977; Colbeau, Maroux, 1978; Kennyy et al., 1978; Flanagan, Forstner, 1978; Gray, 1981; Semenza, 1981, 1986; Kennyy, Maroux, 1982).
Тот факт, что ферменты, осуществляющие мембранное пищеварение иммобилизованы, указывает, что их активные центры, в свою очередь, ориентированы определенным образом по отношению к мембране и жидкой фазе. Данный факт исключает свободную ориентацию каталитических центров относительно субстрата, вследствие чего мембранное пищеварение малоэффективно при гидролизе крупных молекул. Таким образом, мембранное пищеварение рассматривают акцепторным по отношению к полостному и донорным по отношению к всасыванию. Исходя из этого А.М. Уголевым (1963, 1964, 1970, 1972а, 1977, 1985, 1987; Уголев, Смирнова, 1977; Уголев, Иезуитова, 1982; Уголев и др., 1983, 1986) было высказано предположение о сопряжении пищеварительных и транспортных функций, когда мономер, образовавшийся в результате гидролиза, передается непосредственно на вход транспортной системы. Такой прямой путь передачи возможен в том случае, если фермент и переносчик образуют единый ферментно-транспортный комплекс или ансамбль. В изучении свойств собственно кишечных ферментов рыб к настоящему времени достигнуты определенные успехи. Так, в частности, выявлено, что у рыб, относящихся к разным систематическим группам, различна локализация ферментов и их свойств. Было доказано, что распределение ферментов в слизистой оболочке кишечника неравномерно. Так, исследованы различные градиенты разноименных ферментов у рыб как одного вида, так и одного и того же фермента у рыб разных видов. Общей закономерностью можно считать тот факт, что гидролиз жиров осуществляется в основном в проксимальном отделе кишечника и пи-лорических придатках, углеводов и белков в медиальном и дистальном отделе кишечника (Кузьмина, 1978, 1992; Уголев, Кузьмина, 1993; Kuz mina, Gelman, 1997; Неваленный и др., 2003; Кузьмина, 2005).
В то же время при изучении 4-х видов уклеев из о. Шинькай было установлено, что максимальная активность амилаз, протеиназ и липаз наблюдается в кишечнике и минимальная в гепатопанкреасе (LiuWei et al., 2011). Для сомика Pelteobargusvachelli было продемонстрированно, что одноименные пищеварительные ферменты, локализованные в разных частях пищеварительной системы, имеют разные характеристики. Аналогичные данные были получены при изучении пищеварительных ферментов илистого прыгуна Boleophthalmu spectinirostris и амурского лжепескаря Bostrichthyss inensis (Ren-xie et al., 2007; WuRen-Xie et al., 2006, 2007).
Методы определения активности ферментов слизистой оболочки кишечника рыб
При исследовании влияния температуры на уровень активности пищеварительных ферментов рыб Рыбинского водохранилища установлено, что значения температурного оптимума у «мирных рыб» соответствует 40С, у типичных и факультативных хищников - 30С. При низких температурах активность -амилазы у «мирных» рыб составляет 10-20% от максимума, у хищных 35-70% (Уголев, Кузьмина, 1993). Однако при исследовании температурных адаптаций чехони выявлено, что ответная реакция ферментов схожа с аналогичной хищных рыб (Кузьмина, Морозова, 1977). При исследовании общей амилолитической активности, сахаразной и мальтазной активности авторам не удалось выявить значительных видовых различий. Оптимальные значения температуры для данных ферментов находятся в диапазоне 40-60С (Уголев, Кузьмина, 1993). При исследовании протеиназ авторами установлено несколько важных особенностей, так, в частности, отмечено, что температурная функция желудочных протеиназ зависит во многом от субстрата (Кузьмина, 1990г). Оптимальные значения температуры для протеиназ и щелочной фосфатазы отмечены в диапазоне 40-50С (Уголев, Кузьмина, 1993).
При исследовании рыб, обитающих в разных климатических условиях, было доказано, что температурный оптимум щелочной фосфатазы тропических видов рыб составляет 50-60С, глубоководных видов, обитающих при температуре 2-4С, составляет 30С. Кроме того выявлено , что величина температурного может отображать условия существования вида в прошлом. Так, у угольной сабли, обитающей при температуре 4-5С, но эволюционировавшей в условиях тропиков, температурный оптимум щелочной фосфатазы соответствует 60С (Гельман, 1976а,б,в; Уголев и др., 1986). При исследовании температурных характеристик ферментов белорыбицы, обитающей в бассейне р. Волги и Северного Каспия, но эволюционировавшей в холодных водах бассейна Северного-Ледовитого океана, установлено, что температурные оптимумы ферментов смещены в сторону низких значений температуры (Неваленный и др., 2003).
При исследовании влияния температуры на рост, интенсивность питания и усвоение пищевых веществ сома Leiocassios longirostris установлено, что оптимальная температура для интенсивного питания является 27,66С, для роста 26,59С, для эффективного усвоения корма - 26,44С. Кроме того, установлено, что наибольшая активность пищеварительных ферментах наблюдается при температурах содержания 24 и 28, нежели 20 и 32С (Hongyue et al., 2009), аналогичные результаты были получены при исследовании молоди Cynoglossus semilaevis (Xiang-Li et al., 2008). При исследованиях влияния температуры на уровень активности ферментов верхогляда (Erythroculterili shaefoumi) установленно, что температурные оптимумы одноименных ферментов в разных органах могут отличаться на 10С (Jian-xin et al., 2007). Аналогичные результаты были получены и при исследовании молоди Pelteobagrus vachelli, так, оптимальные значения температуры для протеаз составили 50, 50 и 60С в желудке, кишечнике и гепатопан-креасе, для липазы - 45, 50 и 35С соответственно и для амилазы - 30, 30, 35С соответственно (Wu-chim et al., 2008).
При исследовании влияния температуры на молодь амурского осетра установлено, что наибольшая активность липаз обнаруживается при температуре 14С, протеиназ в диапазоне 21-28С и амилаз при температуре 21 С (Hong-jie et al., 2007).
При исследовании влияния температуры акклиматизации на уровень активности пищеварительных ферментов установлено, что у акклимированных к холоду американских гольцов активность пепсина выше, чем у рыб, акклимированных к теплу (Owen, Wiggs, 1971). Наибольшая протеолитическая активность пилори-ческих придатков и тонкого кишечника семги также наблюдается у рыб, адаптированных к низким температурам (Torrissen, Torrissen, 1984). При исследовании влияния температуры акклимации на трипсин и химотрипсин радужной форели (McLees, Stevens, 1982) и целлюлазу фундулюса (Moerland, 1985) авторами не отмечено каких- либо различий у рыб, адаптированных к разным температурам. В дальнейших исследованиях кинетических характеристик трипсина радужной форели, акклимированной к 10 и 15С, удалось установить, что у особей одной линии Кмактивность трипсина увеличивается у рыб, акклимированных при низких температурах, в то время как у особей второй линии данная закономерность не выявлена (McLees, Stevens, 1986).
В экспериментах по акклимации карпа к пониженной температуре установлено, что протеолитическая и липолитическая активность в гепатопанкреасе снижаются, а амилолитическая, напротив, возрастает. При повышении температуры активность амилазы возрастает в разы, активность липазы возвращается к исходному уровню, а протеолитическая активность достигает своего первоначального значения только при дальнейшем увеличении температуры акклимации (Василевский, 1992).
Установлено, что даже при незначительном изменении температуры среды обитания в течение нескольких часов приводит к изменению в уровне активности ферментов. Такие изменения отмечены для амилазы и трипсина сеголетков карпа при изменении температуры на 2 в течение нескольких часов (Palackova et al., 1988). При увеличении температуры акклимации с 14 до 22С активность трипсина может возрастать в два раза, а амилазы падать в более чем семь раз. Причем, данные изменения не являются обратимыми при обратной акклимации. При длительном воздействии высоких температур амилолитическая активность возрастает в кишечниках карпа, белого толстолобика и форели (Plantikov, 1985; Василевский, Самойлова, 1987; Кузьмина, Поддубная, 1986; Василевский, Василевская, 1993). При исследовании акклимации карпа к высоким температурам установлено, что общая амилолитическая активность и активность щелочной фосфатазы существенно возрастает, в то время как активность сахаразы снижается (Кузьмина, Поддубная, 1986). В дальнейшем аналогичное исследование было проведено и на карасе (Голованова и др., 2002). Установлено, что характер изменений общей амилолитической и общей протеолитической активности при изменении температуры идентичен.
Сравнительная характеристика ультраструктуры кишечного эпителия осетровых рыб и их гибридов
В состав кишечного эпителия входят бокаловидные клетки, синтезирующие мукополисахаридный секрет. Их ультраструктура обычна: апикальная часть клетки в фазе накопления секрета заполнена секреторными вакуолями, а ядро с органоидами смещено в узкую базальную область. Вокруг ядра располагаются стопки цистерн ЭПР, в надъядерной области гипертрофированный аппарат Гольджи, а по всей клетке, в узком ободке цитоплазмы наблюдаются митохондрии (рис. 3.23).
В составе эпителиального пласта, в соединительной ткани и кровеносных сосудах под эпителием у изученных осетровых рыб обнаружены округлые секр е-торные клетки c ядром, содержащим в основном гетерохроматин. В их цитоплазме присутствуют гранулы окаймленного секрета с электронно-плотным центром размером до 450 нм. Органоиды немногочисленны, присутствуют аппарат Гольд-жи, уплощенные цистерны ЭПР и митохондрии с электронно-плотным матрик 87 сом. Иммунокомпетентные клетки, способные к активному движению в толще эпителиального пласта, не образуют межклеточных контактов (рис. 3.24, 3.25).
Иммунокомпетентная клетка в кишечном эпителии стербела.
Процесс размножения и дифференцировки клеток эпителиального пласта происходит в криптах, строение которых оказалось сходным у всех исследованных осетровых (рис 3.17). Малодифференцированные клетки, несущие на апикальной поверхности микроворсинки, располагаются на дне крипты. Они более узкие, чем клетки, вступившие на путь дифференцировки или полностью дифференцированные. В цитоплазме присутствует масса рибосом, апикальное и базаль-ное скопления митохондрий, уплощенные цистерны шероховатого Э ПР (рис 3.17). Однако никогда не наблюдались процессы пиноцитоза, характерные для активно функционирующих энтероцитов. Практически отсутствуют складки пла з 88 матической мембраны. На боковых сторонах крипты располагаются более дифференцированные клетки, которые по мере удаления от дна крипты увеличиваются в ширину, в них сильнее развит синтетический аппарат и появляется зона пиноци-тоза.
Иммунокомпетентная клетка в кишечном эпителии ленского осетра. Далее для каждого вида описаны ультраструктурные особенности клеток пищеварительного тракта, не характерные для других изученных нами видов осетровых или присущие не всем видам.
Ультраструктурные особенности клеток пищеварительного тракта белуги. Некоторые пучки фибрилл цитоскелета, располагающиеся перпендикулярно или под углом к апикальной мембране клетки, обмотаны по спирали более электронно-плотными микрофиламентами. Аналогично устроена та часть стержня микроворсинок, которая погружена в цитоплазму клетки (рис. 3.26). Терминальная сеть развита слабо. Для апикальной части клеток характерно скопление митохондрий и наличие постоянной зоны пиноцитоза, состоящей из пиноцитозных каналов и мелких пузырьков. Зона пиноцитоза у разных особей имеет различную величину, достигая 5-7 мкм, так же, как скопление митохондрий. В зоне пиноцитоза локализуются редкие электронно-светлые липидные включения, окаймленные пузырьки, мультивезикулярные и остаточные тельца. В базальной части клеток тоже наблюдается скопление митохондрий (рис. 3.27), однако более округлых очертаний, отмечается скопление рибосом и коротких уплощенных цистерн ЭПР. В области ядра локализуются аппарат Гольджи, мелкие округлые цистерны ЭПР, вторичные лизосомы, остаточные тельца и капли липидов. Плазматическая мембрана на боковых сторонах клетки очень извилиста.
Пиноцитозные вакуоли (отмечены двойными стрелками), пиноцитозные каналы (отмечены звездочками) и микрофиламенты (отмечены стрелками) в энте роцитах кишечного эпителия белуги. Рис. 3.27. Вытянутые митохондрии в базальной части энтрероцитов (отмечены стрелками) кишечного эпителия белуги.
Ультраструктурные особенности клеток пищеварительного трактастер-ляди. В отличие от других изученных осетровых некоторые энтероциты стерляди содержат митохондрии с электронно-плотным матриксом, хотя у большинства энтероцитов наряду с электронно-плотными наблюдались обычные митохондрии. В составе эпителиального пласта встречались энтероциты с электронно-плотной цитоплазмой, содержащей многочисленные везикулы (рис. 3.28). Терминальная сеть во всех энтероцитах развита слабо, в то же время в цитоплазме наблюдаются многочисленные электронно-плотные пучки микрофиламентов цитоскелета длиной до 4 мкм и диаметром 10 нм (рис. 3.29). Апикальное скопление митохондрий у некоторых особей достигает до трети клетки (рис. 3.18). В центральной части клетки, в области ядра, локализованы округлые цистерны ЭПР, рибосомы, пучки электронно-плотных микрофиламентов, редкие митохондрии (в том числе и с электронно-плотным матриксом), у некоторых особей - капли липидов. В базальной части энтероцитов митохондрий немного, они более округлые, наблюдаются стопки цистерн ЭПР, пучки электронно-плотных икрофиламентов до 3 мкм длиной, липидные капли. В межклетниках и цитоплазме энтероцитов встречаются мультиламеллярные тела.
Энтероциты различной электронной плотности, митохондрии с электронно-плотным матриксом в кишечном эпителии стерляди.
Ультраструктурные особенности клеток пищеварительного тракта бестера.В апикальной части энтероцитов скопление митохондрий достигает 8 мкм в длину. На глубину 5 мкм в клетках некоторых экземпляров удается проследить зону пи-ноцитоза. В этой зоне содержатся многочисленные мультивезикулярные и остаточные тельца, везикулы и окаймленные пузырьки, капли липидов, а также их объединение в конгломераты размером до 1 мкм. В некоторых клетках пучки микрофиламентов цитоскелета и та часть стержня микроворсинок, которая погружена в цитоплазму клетки на 0.3-0.5 мкм, обернуты по спирали более электронно-плотными микрофиламенами, как у стербела (рис. 3.20). Терминальная сеть развита слабо. В других всасывающих клетках такого обертывания нет, но концевые участки стержня микроворсинок из актиновых микрофиламентов могут погружаться в цитоплазму на 1 мкм. В таких клетках терминальная сеть развита хорошо. Кроме того в цитоплазме всасывающих клеток встречаются пучки электронно-плотных микрофиламентов. В ядрах энтероцитов наблюдаются крупные липидные капли до 2 мкм (рис. 3.30). В околоядерной зоне расположены аппарат Гольджи, цистерны гладкого и шероховатого ЭПР, мультиламеллярные тельца и фагосомы. В базальной части всасывающих клеток наблюдаются плотные скопления митохондрий. В отличие от других изученных видов у бестера митохондрии в базальной области некоторых клеток имеют вытянутую форму и достигают 3 мкм в длину.
Сравнительный анализ реакции ферментных систем слизистой оболочки кишечника родительских видов и их гибридных форм на изменение температуры инкубации
При проведении сравнительного анализа ответной реакции -амилазы слизистой оболочки кишечника на изменение рН инкубационного раствора установлено, что наблюдаются значительных различий между переменными, относящимися к бестеру в области высоких значений pH (рис. 5.22), в следствие чего дополнительно была проведена кластеризация по значениям pHот 5 до 10 (рис. 5.23). В области pH 5–6 нет существенных различий между родительскими видами и гибридной формой, в области более высоких значений pH (7 и выше) гибридная форма от обоих родительских видов «обособлен», проявляя незначительное сродство к стерляди. Обращает на себя внимание и тот факт, что белуга и стерлядь бо 173 лее схожи между собой, чем их гибридная форма - бестер. Таким образом, можно сделать вывод об отсутствии существенного сродства гибридной формы к какому-либо из родительских видов в данном случае, а также о существенном возрастании различия реакций гибрида и родителей в зоне высокого pH.
При проведении кластерного анализа ответной реакции мальтазы слизистой оболочки кишечника белуги, стерляди и их гибрида – бестера на изменение рН инкубационной среды установлено, что при pH 3–4, а также 7–8 и 11-12 мальтаза бестера проявляют более существенное сходство с мальтазой белуги, объединяясь с ними в единые небольшие кластеры, в остальных случаях - со стерлядью (рис. 5.24). Следует также отметить, что переменные по белуге и стерляди при pH 7 – 9 выделены в отдельный кластер, удаленный от прочего исследуемого множества переменных.
Результаты кластеризации, полученные для мальтазы при разных рН инкубации (для 30 переменных). Обозначения как на рис. 5.22. Результаты кластеризации ответной реакции казеинлитических протеиназ слизистой оболочки кишечника белуги, стерляди и бестера на изменение рН инкубационной среды оказались довольно однозначны. Наибольшее сходство реакций фермента гибрида и одного из родительских видов – стерляди наблюдается в слабокислой и сильнощелочной среде (pH 6 и 12 соответственно) (рис. 5.25). Переменные, характеризующие уровень активности казеинлитических протеиназ в диапазоне pH от 7 до 10, формируют отдельный кластер, еще более сильно удаленный от множества остальных переменных, чем в предыдущем рассматриваемом случае. Однако на расстоянии, примерно равном 18 ,происходит объединение данного кластера с другим, содержащим переменные по активности исследуемого фермента стерляди в аналогичных условиях. Таким образом, с определенной огворкой можно утверждать, что казеинлитические протеиназы бестера в целом более схожи в ответной реакции на pHинкубационной среды с ферментом стерляди, хотя сходство это все же выражено достаточно слабо.
Результаты кластеризации, полученные для казеинлитических про-теиназ при разных рН инкубации (для 21 переменной). Обозначения как на рис. 5.22.
При проведении сравнительного анализа ответной реакции щелочной фосфа-тазы слизистой оболочки кишечника белуги, стерляди и бестера на изменение рН инкубационной среды установлено, что при pH 11 и 12 щелочная фосфатаза бестера наиболее схожа с щелочной фосфатазой белуги в слабокислой и кислой среде (p
Результаты кластеризации, полученные для щелочной фосфатазы при разных рН инкубации (для 30 переменных). Обозначения как на рис. 5.22.
На двумерной карте (рис. 5.27) видно, что данные по ответной реакции на изменение pH инкубационной среды всего комплекса ферментов образуют ряд «моновидовых» групп, в силу чего нельзя с уверенностью сделать вывод о сходстве ферментов гибрида с каким-либо из родительских видов, несмотря на имеющиеся нюансы, исследованные методами иерархической кластеризации ранее. Например одна из групп включает переменные обоих видов и гибрида в сильнокислой и сильнощелочной средах, однако это тоже не дает оснований говорить о выраженном сходстве с одним из родительских видов.Данные диаграммы Шепар-да (рис. 5.28) также свидетельствуют о хорошем соответствии исходных данных конечной конфигурации точек. Стресс 0,08. Коэффициент отчуждения 0,08.
Сравнительный анализ реакции ферментных систем стерляди, белуги и их гибрида (Стербела) на изменение рН инкубационной среды При сравнительном анализе ответной реакции -амилазы слизистой оболочки кишечника стерляди, белуги и стербела на изменение рН инкубационной среды было установлено, что стербел проявляет сходство с белугой при близких или равных значениях pH в зоне кислых значений (3–5). При более высоком pH постепенно усиливается сходство ответной реакции реакций -амилазы с таковыми для стерляди, в существенно щелочной среде (pH 9 и выше) сходство с адаптивными реакциями стерляди прослеживается достаточно четко, хотя при pH 11 наиболее близкой гибриду оказывается переменная белуги при pH 12 (рис. 5.29).
Переменные B, S и SB содержит результаты относительно воздействия рН инкубации на уровень активности -амилазы белуги, стерляди и стербела соответственно, в конце имени цифрами обозначена соответствующее рНинкубационной среды.
При исследовании ответной реакции мальтазы слизистой оболочки кишечника стерляди, белуги и стербела на изменение рН инкубационной среды можно видеть (рис. 5.30), что в данном случае выделенные кластеры, как правило, включают переменные по обоим родительским видам и по гибридной форме, что свидетельствует об отсутствии преобладающего сродства стербела к одному из родительских видов.
Анализируя полученные результаты ответной реакции казеинлитических протеиназ слизистой оболочки кишечника стерляди, белуги и стербела на изменение рН инкубационной среды, было решено рассмотреть кластеризацию на расстоянии, равном 11 и меньше. При расстоянии, равном 11, выделяется 3 кластера, наиболее крупный из которых содержит переменные по активности казеинлити-ческих протеиназ белуги и стербела, а остальные два – по стерляди (рис. 5.31). Анализируя более подробно структуру крупнейшего из выделенных кластеров, можно заметить, что до расстояния, равного 1 и менее, в нем отсутствуют кластеры с переменными только одного вида. Существенно удаленным от множества прочих данных является переменная с информацией по уровню активности казе 182 инлитических протеиназ стербела в нейтральной среде, однако и для нее в конечном итоге сходство с белугой существенно выше, чем со стерлядью. Таким образом, можно предположить, что в данном случае фермент гибридной формы на всем исследованном диапазоне pH обнаруживает существенно большее сходство с ферментом белуги, чем с аналогичным энзимом стерляди.
При анализе ответной реакции щелочной фосфатазы можно увидеть, что при pHот 5 до 9 реакции фермента гибридной формы, выражаемые в изменении уровня активности, более схожи с реакциями щелочной фосфатазы белуги. При pH=4, а также в диапазоне данного показателя от 10 до 12, напротив, отмечается большее сходство реакций щелочной фосфатазы гибрида с ферментом стерляди, что выражается в формировании соответствующих кластеров смешанной структуры. При этом сходство между стербелом и стерлядью для соответствующих значений pH существенно выше, чем для стербела и белуги в диапазоне от 5 до 9.
По результатам многомерного шкалирования (рис. 5.33) можно заключить, что ферменты стербела в кислой и слабокислой средах не демонстрируют выраженного сходства с ферментами какого-либо из родительских видов, тогда как в случае нейтральной и щелочной сред наблюдается выраженное в соответствующих рангах расстояний существенное сходство с ферментами белуги. Переменные с информацией о реакциях ферментов стерляди в нейтральной и щелочной среде формируют значительно удаленные от основного множества компактные группы данных. Данные диаграммы Шепарда (рис. 5.34) также свидетельствуют о хорошем соответствии исходных данных конечной конфигурации точек. Стресс 0,08. Коэффициент отчуждения 0,08.
