Введение к работе
Актуальность проблемы. До сих пор знания особенностей физиологии сельскохозяйственных животных в раннем онтогенезе недостаточны. Остается актуальным эмпирический подход к решению проблем, касающихся различных сторон развития системы крови всех видов сельскохозяйственных животных в онтогенезе. Цикл индивидуального развития организма определяется наследственностью, которая в полной мере реализуется лишь, если на каждом этапе его развития будут обеспечены специфичные и обязательные для него условия среды [Лысов В.Ф., Максимов В.И., 2003; Шуканов А.А. и соавт., 2004].
Известно, что функциональная активность тромбоцитарного гемостаза во многом определяет агрегатное состояние крови. В зависимости от степени отклонений условий среды от требующихся в раннем онтогенезе, а также выраженности нарушений обмена веществ имеет место либо адаптация организма, либо возникновение разнообразных форм дисфункций. Большое значение в становлении систем организма оказывают особенности обмена веществ у разных видов животных, в частности у моногастричных и полигастричных. Важным достижением биологии и, в частности физиологии, можно считать введение в практику различных средств и приемов восстановления нарушенного хода физиологических процессов при различных состояниях у животных. Использование их не всегда приводит к эффективному результату, и успех или неуспех коррекции зависит в значительной степени от состояния местной и общей реактивности организма, которые изменяются в ходе онтогенеза, формирования его структур и становления функций [Карпуть, И.М., 1989; Лысов В.Ф., Максимов В.И., 2003].
В общей структуре отклонений от физиологического состояния у животных наиболее уязвимой является фаза новорожденности. На этом этапе развития у телят часто могут возникать функциональные нарушения в системе пищеварения, а у поросят нередко возникает анемия. Функциональные нарушения пищеварения у телят и анемия у поросят ведут к ряду общих изменений в организме во многом через формирование дисфункций тромбоцитов, обуславливающих нарушение реологии крови, возникновение гипоксии и нарушениям сердечной деятельности, обеспечивая снижение резистентности к респираторным болезням, интоксикации, нарушениям обмена веществ и др. [Зинкевич А.М., 1985; Кондрахин И.П., 2003].
В тоже время, динамика активности тромбоцитарного гемостаза и тонких механизмов его реализации у телят и поросят в течение раннего онтогенеза, у телят с функциональными нарушениями пищеварения и поросят с анемией в фазу новорожденности изучены недостаточно: не раскрыты причины возникновения и пути формирования у них тромбоцитопатии; не разработаны эффективные и научно-обоснованные подходы ее коррекции; не выяснено влияние различных индукторов и их сочетаний на агрегационные функции кровяных пластинок, имеющее место в реальных условиях кровотока; не оценена морфологически степень активации тромбоцитов в просвете сосудов, не выяснено состояние ПОЛ тромбоцитов и активность антиокислительных ферментов кровяных пластинок; не изучено состояние тромбопластинообразования, липидный состав тромбоцитарных мембран и особенности обмена арахидоновой кислоты в кровяных пластинках; не разработана тактика мероприятий, направленных одновременно на восстановление гемостатических нарушений с оптимизацией микроциркуляции, нормализацией обменных процессов и коррекцию функциональных нарушений пищеварения у телят и анемии у поросят в фазу новорожденности.
В связи с этим вполне очевидна актуальность и целесообразность изучения становления тромбоцитарного гемостаза у новорожденных телят и поросят в постнатальном онтогенезе. Исходя из этого были сформулированы цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования – выявить особенности физиологического становления тромбоцитарного гемостаза в отдельные фазы раннего онтогенеза у телят и поросят, его изменения при наиболее часто возникающих отклонениях от гомеостаза в фазу новорожденности с поиском эффективной коррекции активности тромбоцитов у телят с функциональными нарушениями пищеварения и поросят при анемии.
Задачи исследования: 1. Исследовать состояние тромбоцитарных функций, содержание средних молекул, активность ПОЛ, уровень антиоксидантной защиты плазмы крови и тромбоцитов, липидный состав кровяных пластинок и протромботический потенциал первичного гемостаза у здоровых телят в раннем онтогенезе. 2. Определить особенности тромбоцитарных функций, активность ПОЛ, антиоксидантной защиты плазмы крови и тромбоцитов, состояние липидного состава кровяных пластинок и протромботический потенциал первичного гемостаза у здоровых поросят в раннем онтогенезе. 3. Провести сравнительный анализ активности тромбоцитов у телят и поросят в раннем постнатальном онтогенезе. 4. Определить динамику содержания средних молекул, активность ПОЛ и состояние антиоксидантной защиты плазмы крови и тромбоцитов, изменения липидного состава кровяных пластинок и уровень активности тромбоцитов у новорожденных телят с риском развития и возникшими функциональными нарушениями пищеварения. 5. Определить степень влияния различных подходов к коррекции тромбоцитарных нарушений и протромботического потенциала первичного гемостаза у новорожденных телят с функциональными нарушениями пищеварения (традиционная коррекция, сорбент «Экос», «Биопаг-Д», «Фосфопаг», сочетание «Фосфопага» и «Экоса» и сочетание «Фосфопага», «Экоса» и кальция глюконата). 6. Разработать и апробировать способ профилактики тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с риском развития функциональных нарушений пищеварения. 7. Установить особенности активности ПОЛ и состояния антиоксидантной защиты плазмы крови и тромбоцитов, изменения липидного состава кровяных пластинок, сопутствующих развитию тромбоцитарных дисфункций у новорожденных поросят с анемией. 8. Оценить активность тромбоцитарных функций и уровень протромботического потенциала первичного гемостаза у новорожденных поросят с анемией и на фоне изолированного применения препарата железа (ферроглюкин) и его сочетаний с фоспренилом и гамавитом.
Научная новизна исследования состоит в том, что впервые:
1. Определены видовые особенности состояния тромбоцитарного гемостаза, антиоксидантной защиты тромбоцитов, липидного состава их мембран, активности ПОЛ и протромботического потенциала первичного гемостаза у телят и поросят в раннем онтогенезе. 2. Выявлены особенности тромбоцитарного гемостаза, антиоксидантной защиты тромбоцитов, липидного состава их мембран, активности ПОЛ и протромботического потенциала первичного гемостаза у физиологически незрелых новорожденных телят до возникновения функциональных нарушений пищеварения и после их развития, содержания в плазме крови средних молекул, активности ПОЛ плазмы, что позволяет считать эти изменения ранними предвестниками развития функциональных нарушений пищеварения и дисфункций тромбоцитов с усилением их активности и может служить основанием для проведения мер профилактики, направленных на нормализацию свойств кровяных пластинок. 3. Установлена зависимость активности тромбоцитарного гемостаза, антиоксидантной защиты тромбоцитов, липидного состава их мембран, активности ПОЛ и протромботического потенциала первичного гемостаза у физиологически незрелых новорожденных поросят с дефицитом железа. 4. Найден способ коррекции и профилактики функциональных нарушений пищеварения у новорожденных телят, нормализующий активность тромбоцитов и их протромботический потенциал, посредством сочетания «Фосфопага», энтеросорбента «Экос» и кальция глюконата. 5. Определено, что у новорожденных поросят с анемией при применении препарата железа (ферроглюкин) в сочетании с фоспренилом и гамавитом нормализуется активность тромбоцитов и их протромботический потенциал.
Научно-практическая значимость работы. Выполненное исследование содержит новое решение актуальной научной проблемы – оценки специфики становления тромбоцитарного гемостаза у телят и поросят в раннем постнатальном онтогенезе и при наиболее часто возникающих у них отклонениях от гомеостаза в фазу новорожденности.
Установленные особенности становления морфофизиологических параметров тромбоцитарного гемостаза в различные фазы раннего постнатального онтогенеза и при наиболее часто возникающих отклонениях от гомеостаза в фазу новорожденности у телят и поросят необходимы для решения практических задач по созданию нормальных условий содержания животных, обеспечивающих полное проявление их генетических потенциальных возможностей.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Для каждой фазы раннего постнатального онтогенеза у крупного рогатого скота и свиней свойственна определенная активность тромбоцитарного гемостаза.
-
Активность тромбоцитарного гемостаза у разных видов животных имеет свои особенности.
-
Развивающиеся функциональные нарушения пищеварения у телят и дефицит железа у поросят в фазу новорожденности вызывают характерные сдвиги тромбоцитарного гемостаза.
-
Дисфункции тромбоцитарного гемостаза в фазу новорожденности возможно корректировать у телят с функциональными нарушениями пищеварения с помощью «Фосфопага», «Экоса» и глюконата кальция, а у поросят с анемией сочетанием ферроглюкина с гамавитом.
Реализация результатов исследования. Полученные данные, научные положения и выводы внедрены в работу ветеринарной службы Фатежского, Советского, Суджанского, Октябрьского, Золотухинского, Курского, Железногорского, Обоянского, Конышовского районов Курской области РФ и научно-исследовательскую работу Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии РАСХН.
Апробация. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: Международной научно-практической конференции «Экология, окружающая среда и здоровье населения Центрального Черноземья (2005), X съезде биохимиков Украины (2006), научной конференции с международным участием «Научные исследования высшей школы» (2006), IV научной конференции с международным участием «Проблемы агропромышленного комплекса (2007), XI Международной научно-производственной конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (2007), V Международной конференции «Современные наукоемкие технологии» (2007), 19 Международной межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (2007), V научной конференции с международным участием «Гомеостаз и эндоэкология» (2007), IV научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (2007), научной конференции с международным участием «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники» (2007), Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических, технико-экономических сфер жизни общества (2007, 2008), Научном симпозиуме специалистов, молодых ученых и студентов «Адаптивные реакции в биологии и медицине» в рамках Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических и технико-экономических сфер жизни общества» (2007, 2008), первом международном конгрессе ветеринарных фармакологов «Эффективные и безопасные лекарственные средства» посвященного 200-летию высшего ветеринарного образования и Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (2008), на расширенном заседании кафедры адаптивной физической культуры и спорта КИСО (филиал) РГСУ с привлечением сотрудников кафедры физиологии Курской государственной сельскохозяйственной академии им. И.И. Иванова, Курского государственного медицинского университета, Белгородского государственного университета, Белгородской сельскохозяйственной академии и Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии РАСХН, Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина 17 октября 2008г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 82 работы, в т.ч. 3 монографии, 17 статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, получено 10 патентов на изобретение и 2 решения о выдаче патента на изобретение.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя использованной литературы, содержащей отечественных и зарубежных источников, и двух приложений, полно раскрывающих суть примененных лечебных подходов. Диссертация изложена на 396 страницах машинописи, включает 49 таблиц и 30 рисунков.
2.1. Характеристика животных
Исследования, положенные в основу диссертации, проведены в 2004-2008гг. на крупном рогатом скоте и свиньях хозяйств Курской области, лабораторные анализы выполнялись у телят и поросят, находившихся под наблюдением на базе Центра гемостазиопатий Курской областной клинической станции переливания крови. В исследование включены 449 здоровых новорожденных телят симментальской и черно-пестрой породы в день отела от здоровых коров 1-2 отела с нормально протекавшей беременностью, находившихся на рациональном кормлении [Калашников А.П. и др., 2003]. Телята осматривались и обследовались за период новорожденности 5 раз (1-2 сут., 3-4, 5-6, 7-8, 9-10 сут.). В случае возникновения признаков ФНП у теленка не позднее, чем через 0,5 сут. после их начала, определялись все оцениваемые показатели, и применялся в течение последующих 10 сут. один из используемых в работе видов коррекции с оценкой тех же показателей по ее завершению. Общее число телят, у которых за период новорожденности развились ФНП, составило 153 (36,7%), при этом 267 (63,3%) остались здоровыми, составив группу контроля. В исследование включены 29 здоровых новорожденных телят с риском облигатного развития ФНП, которым был проведен курс успешной профилактической коррекции. Из новорожденных телят с развившимися ФНП 146 (95,4%) имели признаки физиологической незрелости (масса при рождении менее 20 кг, т.е. менее 7% массы тела матери, длина теленка менее 70 см, наличие менее 4 резцов и менее 12 коренных зубов, пуповина у них отпадала не менее через 12 сут. жизни). Содержание новорожденных животных осуществлялось в стандартных условиях телятника при нередко избыточной выпойке молозивом. Новорожденные телята были подразделены на 8 групп: 1-я – здоровые (контроль) 267 голов, 2-7-я – новорожденные телята с ФНП разделенные с учетом способа коррекции тромбоцитарных нарушений, их количество в группах составило соответственно 25(16,4%), 25 (16,4%), 25 (16,4%) 25 (16,4%), 27 (17,4%) и 26 (17,0%). Во 2-й группе телят коррекцию состояния производили с помощью традиционного для хозяйств подхода (голод на 10-12 ч. с последующим назначением небольших доз молозива -1/4 от обычного количества, 5-6 раз в сут. с постепенным доведением объема молозива до нормы; за 15 мин до выпаивания телятам давали 50,0 мл натурального желудочного сока, разбавленного 50,0 мл теплой воды) с наблюдением в течение 10 сут.; в 3-ей – включения в схему выпаивания вечером включали в виде водной взвеси гидроалюмосиликатный сорбент – «Экос» (производство Белгородского государственного университета) 150мг/кг живой массы в течение 10 сут. на ночь с целью снижения сорбции питательных веществ из рациона; в 4-ой - выпаивания утром 0,01% раствора полигексаметиленгуанидин хлорида («Биопаг-Д», производства Института эколого-технологических проблем г. Москва) по 100,0 мл в сутки в течении 10 сут.; в 5-ой - выпаивания утром полигексаметиленгуанидин фосфата («Фосфопаг», производства Института эколого-технологических проблем г. Москва) в растворе 0,01% включаясь в выпаивание по 100,0 мл в сутки в течении 10 сут.; в 6-ой - применения в течение 10 сут. сочетания «Фосфопага» и «Экос» с распределением их в течение суток следующим образом: 0,01% «Фосфопага» 100,0 в утренние часы, а «Экос» 150мг/кг на ночь для исключения сорбции «Экосом» «Фосфопага»; в 7-ой - применения в течение 10 суток сочетания «Фосфопага», глюконата кальция и «Экоса» с распределением их с течение суток: 0,01% «Фосфопаг» 100,0 мл утром, 10% глюконат кальция 10,0 мл в обед и «Экос» 150мг/кг вечером; в 8-й - проведения профилактической коррекции у 29 здоровых новорожденных телят, имеющих риск облигатного развития ФНП, обследованных в суточном возрасте. С целью профилактики ФНП и нивелирования зарегистрированных у них отклонений, наличие которых позволяло прогнозировать возникновения ФНП сразу же после обследования, проводился 8-сут. превентивный курс коррекции: 0,01% «Фосфопаг» 100,0 мл утром, 10% глюконат кальция 10,0 мл в обед и «Экос» 150мг/кг вечером.
В исследование также включены 22 здоровых теленка 30 сут. возраста, 21 - 3 мес. и 23 - годовалого возраста, содержащихся в стандартных условиях и находящихся на достаточном и полноценном рационе питания.
Проведены исследования 149 новорожденных поросят, 24 здоровых 20- сут. возраста, 23-40-сут. и 22 здоровых животных годовалого возраста породы крупная белая. Новорожденные поросята были разделены на 4 группы: 1-я – здоровые (контроль) – 27, 2-4-я – поросята с анемией (121), в т.ч. хряков 63 (52,1%) и 58 (47,9%) свинок с анемией 1-2-сут. возраста, взятые в исследование сразу после установления у них анемии по общему состоянию животного и лабораторным показателям. Анемия во всех случаях была железодефицитной – уровень железа в крови животных в среднем составлял 13,6±0,45 мкмоль/л, гемоглобин - 84,4±0,90г/л, количество эритроцитов крови - 4,21±0,15х1012/л. Поросята с анемией получены в зимний период от свиноматок 1-2 опороса, находившихся во время беременности на недостаточном и нерациональном питании. Случайным образом новорожденные поросята с анемией были подразделены на 3 равные группы, соответственно по 38 (31,4%), 42 (34,7%) и 41 (33,9%) животных. Коррекция анемии во 2-й группе поросят (38 животных) осуществлялась ферроглюкином по 150 мг (2мл) внутримышечно, двукратно с интервалом между инъекциями 10 сут.; в 3-ей (42 поросенка) - назначался ферроглюкин по 150мг (2мл) внутримышечно, двукратно с интервалом 10 сут и фоспренил 0,05мл/кг внутримышечно, двукратно в разных шприцах в разные точки, первый раз одновременно с первой инъекцией препарата железа и в той же дозе через пять сут. после его первой инъекции; в 4-ой (41 животное) - ферроглюкином 150мг (2мл) внутримышечно, двукратно с интервалом 10 сут. и гамавитом 0,01 мг/кг внутримышечно один раз в сут., пять суток, начиная с первой инъекции ферроглюкина.
2.2.Методы исследования
Зоогигиенические параметры содержания животных соответствовали нормативам. Физиологическую зрелость новорожденных животных определяли по системе интегрального показателя, приведенных в работах В.Ф. Лысова (1977), А.И. Кузнецова, В.Н. Лузиной, В.Г. Лукошкиной (1984).
Для решения поставленных в работе задач проведен морфо-биологический анализ крови, который включал определение эритроцитов [Лысов В.Ф., Ипполитова Т.В., Максимов В.И., Шевелев Н.М., 2004], гемоглобина [Битюков И.П. и др., 1990], гематокритной величины [И.Тодоров, 1963], общего белка в сыворотке крови [Колб, В.Г. и др., 1982]. Кроме того в протокол исследования новорожденных поросят с анемией включено определение содержания в крови сидероцитов, нормобластов и ретикулоцитов, среднего содержания гемоглобина (СГЭ) и средней его концентрации в 1 эритроците (СКЭ), среднего объема (СОЭ) и диаметра (СДЭ) этих клеток крови, концентрации в сыворотке крови железа (СЖ), общей (ОЖСС) и латентной (ЛЖСС) железосвязывающей способности сыворотки крови, коэффициента насыщения трансферрина (ТФ) железом (КНТ), уровня ТФ в сыворотке (СЖ - количества железа, связанного ТФ, ОЖСС – количество железа, которое может быть связано ТФ, ЛЖСС – разницы между ОЖСС и СЖ, КНТ – процента ТФ, связанного с железом, вычисляющегося путем деления СЖ на ОЖСС) [Камышников В.С., 2000].
Активность ПОЛ в плазме оценивали по содержанию ТБК-активных продуктов набором фирмы „Агат-Мед”и ацилгидроперекисей [Гаврилов В.Б. и др., 1983]. Для оценки антиокислительного потенциала жидкой части крови определяли ее антиокислительную активность по Волчегорскому И.А. и соавт. (2000). В плазме оценивали уровень средних молекул по Габриелян Н.Г., Липатова В.И. и др. (1985) при 280нм и 254нм [ Габриэлян Н.И. и др., 1985].
Состояние внутритромбоцитарного ПОЛ определяли по концентрации базального уровня МДА в реакции восстановления тиобарбитуровой кислотой в отмытых и ресуспендированных тромбоцитах на основе принципа метода Shmith J.B. et al. (1976) в модификации Кубатиева, А.А., Андреева С.В. (1979) и содержанию ацилгидроперекисей [Гаврилов В.Б. и др., 1983]. В отмытых и ресуспендированных тромбоцитах определяли содержание средних молекул по Габриелян Н.Г., Липатова В.И. и др. (1985) при 280нм и 254нм [Габриэлян Н.И. и др., 1985]. В отмытых и ресуспендированных тромбоцитах [Ястребов Г.Н., 1985] количественно оценены уровни общего холестерола энзиматическим колориметрическим методом набором фирмы „Витал Диагностикум” и общих фосфолипидов по содержанию в них фосфора [Колб В.Г., 1982] с последующим расчетом отношения ОХС/ОФЛ в тромбоцитах. Активность внутритромбоцитарных антиоксидантных ферментов устанавливали для каталазы и супероксиддисмутазы [Чевари С. и др., 1991].
Оценку состояния системы тромбоцитарного гемостаза производили по ряду параметров: подсчитывали количество тромбоцитов в капиллярной крови в камере Горяева; агрегационную активность тромбоцитов оценивали визуальным микрометодом по А.С.Шитиковой (1999) с использованием в качестве индукторов АДФ (0,510-4 М.), коллагена (разведение 1:2 основной суспензии), тромбина (0,125ед/мл.), ристомицина (0,8 мг/мл.) (НПО „Ренам”), адреналина (5,010-6 М. Завод Гедеон Рихтер), а также сочетания АДФ+адреналин, АДФ+коллаген и коллаген+адреналин в приведенных концентрациях. Продукты лабилизации тромбоцитарных фосфолипидов – активаторов свертывания (Ф3 –тромбоцитов) оценивали по методу Е.Д. Еремина (1974) с вычислением индекса тромбоцитарной активности. Активность и время образования тромбоцитарного тромбопластина выявляли по методу Biggs R., Douglas A.S., Macfarlane R.G. (1953). Для косвенной оценки обмена эндогенной арахидоновой кислоты в тромбоцитах, а также активности в них циклооксигеназы (ЦО) и тромбоксансинтетазы (ТС) использованы три пробы переноса по методу Ермолаевой Т.А. и соавт. (1992) с регистрацией агрегации тромбоцитов на фотоэлектроколориметре. Морфологическое определение внутрисосудистой активности тромбоцитов производили с использованием фазовоконтрастного микроскопа по методу Шитиковой А.С. и соавт. (1997).
Кровь для биохимического исследования у животных брали в утренние часы из вены после ночного перерыва приема корма.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия (t) Стьюдента, корреляционного и системного многофакторного анализа [Бредерфорд Хилл А., 1958; Углова М.В. и др., 1982].
