Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди эндогенных факторов тревожности и страха важную роль играют агонисты широко представленных в мозге рецепторов холецистокинина (ХЦК) типа В (также называемых ХЦК2 рецепторами). Наибольшее внимание привлекает самый меньший из обнаруживаемых в мозге С-концевых фрагментов холецистокинина тетра-пептид Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (ХЦК-4). Большое количество клинических данных указывает на особую анксиогенную активность именно ХЦК-4, вызывающего у людей, изначально не страдающих паническими расстройствами, сильные панические атаки. Пациенты, страдающие паническими расстройствами, более реактивны к анксиогенному действию ХЦК-4 и других агонистов ХЦК-В рецепторов. (Bradwejn J et.al, 1991). Показано, что анксиогенное влияние ХЦК-4 опосредовано стимуляцией некоторых отделов дофаминергической системы через ХЦК-В рецепторы (Crawley JN, 1995). Однако способность ХЦК-4 и особенно его малоизученных аналогов оказывать анксиогенное действие на животных нуждается в дальнейшем углубленном изучении, так как имеющиеся на сегодняшний день в литературе результаты не лишены противоречий.
Мишенью наших исследований помимо ХЦК-4 были его структурные аналоги - ранее не изученный ХЦК-3 (HCl-Met-Asp-Phe-NH2) и пентагастрин в двух модификациях: pAla-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (ПГ) и N-tert-butyloxycarbonyl-PAla-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (БОК-ПГ); влияние их на психоэмоциональный статус крыс и биохимические изменения в мозге, сопровождающие эти эффекты. Особый интерес представляет исследование мало изученного феномена долговременности эффектов пептидов как на поведенческом, так и на биохимическом уровне.
Широкое распространение в клинической практике тревожных состояний, в том числе сопровождаемых приступами панических атак, определяет большой интерес не только к механизмам этих явлений, но и к методам их купирования. До сих пор проблема коррекции патологической тревожности и депрессий далека от успешного решения, методы купирования таких состояний на длительное время отсутствуют. Наши исследования, основанные на идее, выдвинутой академиком И.П.Ашмариным (Ашмарин И.П., Гомазков О.А., 1989), направлены на разработку принципиально нового подхода к длительной коррекции тревожных и панических состояний путем иммунокоррекции. Нами использовался метод инверсной иммунорегуляции -активной иммунизации к конъюгатам ХЦК-4 и его структурного аналога с антигеном-носителем.
В течение последних двух десятилетий опубликовано большое число работ, в которых исследовались эффекты иммунизации к широкому кругу
соединений, близких по структуре или даже идентичных соединениям реципиента, в том числе и к регуляторным пептидам (Ашмарин И.П., Гомазков О.А., 1989, Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. и др., 1991, Евсеев В.А., Трекова Н.А. и др., 1995, Данилова Р.А., Обухова М.Ф., Ашмарин И.П. и др., 1988.). Активная иммунизация животных гетерологичным или гомологичным биорегулятором, индуцируя образование аутоантител к нему, ведет к длительным изменениям активности соответствующего биорегулятора и физиологических функций, с которыми он связан (как правило противоположной направленности). Прицельность подавления определенных систем регуляции позволяет успешно использовать такой подход для изучения механизмов патологического поведения и обосновать возможность его иммунокоррекции. Опыт, накопленный в исследованиях с использованием метода инверсной иммунорегуляции, позволяет нам расценивать такой подход, как наиболее направленный, длительный и стабильный в плане вызываемых физиологических изменений. Несмотря на наличие ряда работ по активной иммунизации к регуляторным пептидам, исследования по иммунизации животных к ХЦК-4 и его аналогам как в отечественной, так и в зарубежной литературе не опубликованы. Поэтому были необходимы исследования для оценки возможности и эффективности иммунизации к конъюгатам ХЦК-4 и ХЦК-3, а также изучение корреляции поведенческих эффектов иммунизации с биохимическими изменениями в мозге.
Одной из важных проблем в плане применения метода иммунокоррекции в клинике является подбор допущенных к применению на людях антигенов-носителей и адъювантов. При положительных эффектах иммунизации на животных это может позволить без предварительной проверки на безвредность перейти к испытаниям описанного подхода к коррекции тревожных и панических состояний у людей.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение кратковременных и долговременных (отставленных и инверсных) поведенческих и биохимических эффектов пептидных регуляторов -индукторов тревожности - ХЦК-4 и его аналогов. В работе были поставлены следующие задачи:
Оценка эффективности и направленности действия аналогов ХЦК-4 -ХЦК-3, і>(9.К"-пентагастрина и пентагастрина, и сопоставление их действия с анксиогенными эффектами ХЦК-4.
Изучение долговременности вызываемых ХЦК-4 и его аналогами эффектов на поведенческом и биохимическом уровнях после однократного парентерального введения.
Для получения особо длительных инверсных эффектов - проведение активной иммунизации белых крыс синтезированными конъюгатами ХЦК-4 и ХЦК-3 с антигенами-носителями.
Оценка эффективности иммунизации на:
иммунологическом
поведенческом
биохимическом уровнях.
Сравнение направленности и длительности поведенческих и биохимических эффектов пептидов при однократном парентеральном введении и при использовании метода инверсной иммунорегуляции.
В случае анксиолитического действия иммунизации - проведение исследований с использованием антигенов-носителей и иммуностимуляторов, допущенных к применению в клинике.
Научная новизна. Впервые оценено влияние на поведение белых крыс структурного аналога ХЦК-4 - HCl-Met-Asp-Phe-NH2 (ХЦК-3), который был впервые синтезирован в институте Молекулярной генетики Л.А.Андреевой.
Выявленный нами анксиогенный эффект ХЦК-3 позволяет говорить, что среди агонистов рецепторов ХЦК В, играющих важную роль в этиологии тревожных состояний, наряду с аналогом ХЦК-4 - пентагастрином и аналогом ХЦК-8 - церулеином, является и трипептид ХЦК-3. Выявлен очень важный феномен отставленных эффектов анксиогенных олигопептидов: эффекты ХЦК-4 и ХЦК-3, идентичные по характеру ранним, наблюдаются до 14 суток после однократного парентерального введения, как на поведенческом, так и на биохимическом уровне. Известно, что анксиогенные олигопептиды характеризуются коротким периодом полураспада in vivo (менее 15 минут), поэтому факты пролонгированных эффектов ХЦК-4 и ХЦК-3 заслуживают особенного внимания. Данные по изучению отставленных анксиогенных эффектов ХЦК-4 и синтезированного нами аналога ХЦК-3 как по физиологическим, так и биохимическим показателям на сегодняшний день в литературе отсутствуют.
Впервые проведено ковалентное связывание ХЦК-4 и ХЦК-3 с антигеном-носителем (М.Ф.Обухова) и исследования по активной иммунизации крыс с оценкой функционального состояния иммунизированных крыс. Полученные данные о длительном (месяцы) анксиолитическом и антидепрессивном эффекте иммунизации, позволили показать принципиально новую возможность направленной и длительной иммунокоррекции патологических форм проявления тревожности, страха и депрессий. Помимо этого, впервые показано изменение уровня биоаминов в стриатуме после иммунизации к ХЦК-4 и -3, направленность которого, особенно по содержанию дофамина и серотонина, противоположна прямому действию исследуемых пептидов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные факты о долговременных отложенных эффектах анксиогенных пептидов ХЦК-3 и ХЦК-4 соответствуют концепции пептидного функционального континиума,
предложенной академиком И.П. Ашмариным (1986) и значительно ее расширяют. Значение этого явления принципиально важно как в фундаментальном аспекте для развития представлений о функции регуляторов центральной нервной системы, так и в прикладном плане - открывается возможность разработки регуляторов тревожности весьма длительного действия.
Несмотря на большие успехи современной медицины и существующее огромное количество анксиолитических и антидепрессивных препаратов, коррекция тревожных и депрессивных расстройств до сих пор продолжает оставаться весьма актуальной проблемой, а методы долговременной (в том числе иммунологической) коррекции таких состояний на длительное время отсутствуют. Показанная нами успешность иммунизации к пептидам-анксиогенам, а также подбор антигена-носителя (столбнячный анатоксин) и иммуномодулятора (полиоксидоний), широко применяемых в клинической практике, открывают возможность практического применения метода инверсной иммунорегуляции в целях коррекции патологического состояния тревожности и депрессии. Основное его преимущество состоит в длительности и стабильности вызываемых эффектов при небольшом числе воздействий. Такой подход в терапии ряда хронических болезней, таких как алкоголизм и психические нарушения, может позволить избежать многократного систематического введения лекарственных препаратов, обладающих кратковременным действием.
Апробация работы. Апробация результатов представленного диссертационного исследования успешно прошла на конференции молодых ученых по проблемам ВНД, посвященной 90-летию со дня рождения Л.Г.Воронина (Москва, 1998), Международной конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 1999), Международной медицинской конференции «Medicine at the turn of Millenia» (Люблин, 2000), П-й Российской конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001), 6-ой Пущин ской конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2002), Международном междисциплинарном семинаре «Новые технологии в медицине и экологии, интегративная медицина» (Высокие Татры, 2003), XI российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), XIX съезде Физиологического Общества Им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), Втором Международном Междисциплинарном Конгрессе «Достижения нейронауки для современной медицины и психологии» (Судак, 2006), XII и XV международной конференции и дискуссионного научного клуба IT + ME (Гурзуф, 2004 и 2007), а также на заседаниях кафедры высшей нервной деятельности Биологического факультета МГУ.
По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения в двух главах, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 140 страницах, содержит 39 рисунков и 6 таблиц. Список литературы включает 204 источника, из них 34 отечественных. Диссертация изложена на русском языке.
