Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 . Современное состояние проблемы 16
1.1. Понятие малых доз радиации в радиобиологии 16
1.2. Радиационный гормезис при малых дозах ионизирующей радиации 19
1.3. Основные молекулярно - клеточные реакции на облучение при малых дозах ионизирующей радиации 33
1.4. Поражающее действие малых доз ионизирующей радиацией. Увеличение радиочувствительности при облучении в малых дозах 40
1.5. Радиационная стимуляция при больших дозах ионизирующей радиации 46
1.6. Радиобиология водных организмов 48
1.7. Радиационный гормезис и радиационная стимуляция биологических объектов 51
1.8 Обоснование задач исследования 58
Глава 2. Материал и методы 61
2.1. Исследования на ракообразных (жаброногий рак A, salind) 61
2.2 Исследования на моллюсках (приморский гребешок Mizuhopecten yessoensis)
2.3. Исследования на красной водоросли грацилярии бородавчатой Gracilaria verrucosa (Huds.) Papenf. (Rhodophyta, Gigartinales) 65
2.4. Исследования на мерцательном эпителии животных 68
Глава 3. Эксперименты с жаброногий раком Аш salina 73
3.1. Действие гамма - радиации на выклев науплиев A. salina (раса оз. Онтарио) из цист 73
3.2. Продолжительность жизни рачков A., Salina, выклюнувшихся из облученных яиц 78
3.3. Влияние у - радиации на рост A, salina з
3.4. Влияние изменения температуры и солености на выживаемость рачков A.salina, выклюнувшихся из облученных яиц 87
3.5. Влияние у - радиации на продолжительность жизни и плодовитость A. salina, облученных на стадии зрелости 90
3.6.. Стимуляция жизненных процессов A.salina, выклюнувшихся из обработанных алкилирующими соединениями цист 92
3.7. Включение Н-тимидина Н - уридина в науплии A. salina, облученных или обработанных 1 - 4 - бис - диазоацетилбутаном на стадии эмбриональной диапаузы 96
3.8. Обсуждение результатов экспериментов с ракообразными 100
Глава 4. Эксперименты с моллюсками (приморский гребешок)
4.1. Влияние у - облучения на выживаемость и рост приморского гребешка 104
4.2. Действие у - облучения на репродуктивную систему приморского гребешка
4.2.1. Действие у - облучения на репродуктивную систему самок приморского гребешка 110
4.2.2. Действие облучения на половые клетки самцов приморского гребешка 116
4.2.3. Влияние у - облучения на синтез ДНК и РНК в клетках гонад приморского гребешка 117
4.2.4. Отдаленное действие у - излучения на репродуктивную систему приморского гребешка 121
4.3. Обсуждение результатов экспериментов с приморским гребешком 125
Глава 5. Эксперименты с водорослями (грацилярия) 128
5.1. Радиочувствительность грацилярии и ее аномальный рост «под лучом» при больших дозах гамма - облучения 128
5.2. Влияние условий культивирования на проявления эффекта радиационной стимуляции у грацилярии 135
5.3. Совместное действие гамма - облучения и фитогормонов на грацилярию 144
5.4. Влияние гамма - излучения на рост фрагментов грацилярии в условиях морского плантационного культивирования 150
5.5. Влияние гамма - радиации на выход гелеобразущих полисахаридов из талломов грацилярии 153
5.6. Мутагенное действие стимулирующих доз гамма - радиации на грацилярию 155
5.7. Обсуждение результатов экспериментов с грацилярией 161
5.8. Общие итоги изучения эффекта радиационной стимуляции при облучении радиорезистентных морских организмов 166
Глава 6. Эксперименты с мерцательном эпителием животных 168
6.1 .Эксперименты с мерцательным эпителием жабр мидии и обонятельного эпителия лягушки 168 6. 2. Эксперименты с мерцательным эпителием трахеи крыс. 173
6.3. Обсуждение результатов экспериментов с мерцательным эпителием животных 176
Глава 7. Теоретические аспекты эффекта радиационной стимуляции при больших и малых дозах ионизирующего облучения 180
Заключение 203
Список сокращений 204
Список использованных литературных источников
- Основные молекулярно - клеточные реакции на облучение при малых дозах ионизирующей радиации
- Исследования на красной водоросли грацилярии бородавчатой Gracilaria verrucosa (Huds.) Papenf. (Rhodophyta, Gigartinales)
- Стимуляция жизненных процессов A.salina, выклюнувшихся из обработанных алкилирующими соединениями цист
- Влияние у - облучения на синтез ДНК и РНК в клетках гонад приморского гребешка
Введение к работе
1. Актуальность работы
В связи с ростом использования атомной энергии в различных областях деятельности человека, развитием ядерной энергетики, и связанные с этим аварии, проблема действия малых доз (МД) ионизирующей радиации (ИР) на здоровье человека и природную среду носит поистине глобальный характер.
В настоящее время существуют две противостоящие друг - другу модели для оценки риска стохастических эффектов ИР в зависимости от дозы облучения.
Из первой модели следует, что риск повреждения генетического аппарата клетки и риск возникновения заболеваний канцерогенной и не канцерогенной природы при облучении МД ИР, наилучшим образом оценивается линейными отношениями без порога. Любая сколь угодно МД повышают вероятность возникновения рака и других заболеваний не канцерогенной природы. В основе этой модели лежит экстраполяция результатов, полученных при больших дозах в область МД (NCRPM, 1987; Prasad et al., 2004).
Вторая модель постулирует, что существует пороговая доза, ниже которой ИР не может вызвать заболеваний канцерогенной и не канцерогенной природы и повреждение генетического аппарата клетки (Bond et al., 1991; Cohen, 2002). Эта модель, прежде всего, опирается на концепцию радиационного гормезиса (РГ).
Понятие радиационный гормезис предполагает, что ионизирующая радиация являясь при больших дозах губительным фактором для живых организмов, в малых дозах может индуцировать положительные биологические процессы и оказывать благоприятное стимулирующее действие на организм (Кузин, 1995; Boothman et al., 1998). Радиационный гормезис проявляется как повышение плодовитости, роста, деления клеток и увеличение продолжительности жизни различных биологических объектов (Кузин, 1995), и доказанного в последнее время антиканцерогенного действия малых доз ионизирующего излучения (Feinendegen et al., 2004).
В связи с этим, в последнее время, ряд исследователей и авторитетных комиссий предлагают пересмотреть нормы радиационной безопасности в сторону повышения границ предельно допустимых лучевых нагрузок, как на персонал, связанный с работой с источниками ионизирующей радиации, так и на население. Обеспечение мероприятий по радиационной защите требует значительных средств, и возможное смягчение норм радиационной безопасности может принести огромную экономическую выгоду. Поэтому проблема радиационный гормезис актуальна не только в познавательном плане, но и как проблема, затрагивающая охрану здоровья людей.
Существует несколько моделей пытающихся объяснить эффект РГ. Модели первого типа (Виленчик, 1987; Pollycove, Feinendegen, 2001) пытаются объяснить РГ активацией адаптивных клеточных реакций, которые ликвидирует не только радиационные повреждения, но и эндогенные повреждения ДНК. Модели второго типа (Кузин, 1995; Эйду с, 2001) постулируют, что мишенью при РГ является мембрана клетки.
Модели первого типа не объясняют по-нашему мнению, главное: почему при подавляющим превалировании эндогенных повреждений ДНК над радиационными повреждениями, именно последние ответственны за активацию адаптивных клеточных реакций?
Аналогично, модели второго типа указывая на цепочку событий, приводящих к РГ, не объясняют каким образом единственный акт ионизации в биомембране может приводить к ряду регистрируемых изменений в клетке, при том, что индуцированные ИР радикальные реакции по конечным продуктам не отличаются от продуктов эндогенных радикальных реакций.
В тех случаях, когда облучению подвергались радиорезистентные организмы, эффект радиостимуляции наблюдался и при достаточно больших дозах. За исключением работ по предпосевному облучению семян сельскохозяйственных растений (Березина, Каушанский, 1975), исследования по эффекту радиостимуляции при больших дозах крайне фрагментарны и малочисленны. В тоже время, невозможно построение адекватной модели РГ без
5 ответа на вопрос: попадают ли под понятие РГ эффекты радиостимуляции при больших дозах? Другими словами, имеем мы дело с различными радиобиологическими эффектами — РГ при МД и эффектом радиостимуляции при больших дозах или это один эффект?
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является исследование закономерностей эффекта радиационной стимуляции биообъектов при больших дозах ИР, и ответ на вопрос о различии механизмов эффекта радиационной стимуляции при больших и малых дозах.
Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи.
1. Исследовать закономерности эффекта радиационной стимуляции при
больших дозах ИР у животных и растений различных таксономических групп
- ракообразных Artemia Salina, моллюсков Mizuhopecten yessoensi, красных
водорослях Gracttaria verrucosa;
-
Изучить закономерности эффекта радиационной стимуляции при больших дозах ИР на различных стадиях онто - и гаметогенеза, при которых наблюдаются (приморский гребешок М. yessoensis) или отсутствуют процессы пролиферации (цисты A., salina).
-
Исследовать процессы лучевого поражения при интервалах доз, в которых регистрируются эффекты радиационной стимуляции у исследуемых радиорезистентных биологических объектов.
-
Исследовать у животных различных таксономических групп, действие сверхмалых доз ИР на двигательную активность ресничек мерцательного эпителия (МЭ), которая зависит от мембранной разности электрохимических потенциалов.
-
Исследовать действие радиомиметиков, из группы алкилирующих соединений на животных (А._ salina).
-
Разработать адекватные модели механизма эффекта радиационной стимуляции при больших и малых дозах облучения.
Научная новизна
1. Впервые показано стимулирующее действие у- облучения при боль
ших дозах на различные биологические процессы на одном виде животного
(Artemia Salina, Mizuhopecten yessoensis).
-
Впервые показано, что алкилирующие соединения при определенных концентрациях оказывают стимулирующее действие на биологические процессы у животных (Artemia, salina).
-
Впервые показано, что большие дозы у- радиации при действии их на радиорезистентные организмы могут активировать процессы пролиферации (М yessoensis, G. verrucosa) и дифференцировки клеток (М. yessoensis).
-
Показано, что радиационная стимуляция при больших дозах сопровождается процессами лучевого поражения у животных и растений различных таксономических групп.
-
Доказано, что радиостимуляции при больших дозах может объясняться различными процессами клеточного поражения: клеточной гибели, ин-гибирование клеточного деления, репрессия генов, разрывы в ДНК.
6. Впервые показано, что сверхмалые дозы ИР влияют на двигательную
активность ресничек МЭ животных различных таксономических групп.
7. Разработаны модели механизма радиационной стимуляции при
больших и малых дозах облучения биологических объектов.
Практическое значение
Стимулирующий эффект ИР неоднократно пытались применять для повышения продуктивности с. — х. объектов (Березина, Каушанский, 1975; Кузин, 1977). Проведенные нами исследования позволяют предложить применение эффекта радиостимуляции для повышения продуктивности объектов марикультуры. Так, при культивировании приморского гребешка, нами рекомендованы следующие дозы у- облучения: для спата - 7,5 Гр, для одно- и двухлетних - 15 Гр (Ивановский и др.,1985). Учитывая увеличение выживаемости животных и прирост биомассы их мускула вследствие стимулирующего эффекта у- облучения, выход конечного продукта возрастает в 1,6 - 1,8
7 раз (Ивановский и др.,1985). При культивировании грацилярии, нами рекомендована доза у- облучения 50 Гр (Ивановский и др.,1987). Выход конечного продукта, в этом случае увеличивается в 1,7 - 2,2 раза. Описанный нами эффект сверхчувствительности двигательной активности ресничек МЭ на ИР, может найти применение как тест-система (биологический дозиметр) на воздействие ИР. Практически всегда, воздействие поллютантов на окружающую среду комплексное. Стратегия оценки экологического вреда должна базироваться на биологических тест - системах, одним из требований к которым -их высокая радиочувствительность. Данный подход был нами реализован при оценке возможного вреда, наносимого экосистемам, при планировании строительства комплекса по перегрузке хлористого калия (повышенная радиоактивность) в порту Восточный (Карпенко, Ивановский и др., 1995).
Обоснованность и достоверность результатов подтверждается использованием методов статистической обработки результатов: метода <р, метода парных сравнений, Стьюдента, Фишера и регрессионного анализа.
Апробация результатов исследования
Материалы диссертации были изложены автором на: Всесоюзном совещании по морской аквакультуре (Керчь, 1976), Всесоюзном совещании генетические аспекты проблемы « Человек и биосфера» (Свердловск, 1978), 4 -й Всесоюзной конференции по морским беспозвоночным (Севастополь, 1986), Всесоюзной конференции «Люминесцентные методы исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности» (1985), 5 -й Всесоюзной конференции «Биология клетки» (Тбилиси, 1987), 3 -й Всесоюзной конференции по морской биологии (Севастополь, 1988), Всесоюзной конференции « Синергизм действия ионизирующей радиации и других физических и химических факторов на биологические системы» (Пущино, 1988), Всесоюзной конференции « Научно - технические проблемы марикультуры в стране» (Владивосток, 1989), I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), 1 -м Всесоюзном симпозиуме "Молекулярно-клеточные механизмы хронического (внешнего и внутреннего) действия ионизирующих из-
8 лучений на биологические системы" (Пущино, 1990), Всероссийской конференции « Прикладные аспекты радиобиологии» (Пущино, 1994), 3 -м Международном симпозиуме "Механизмы действия ионизирующих сверхмалых доз" (Москва, 2002).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 37 работ в отечественной и зарубежной печати (22 в рецензируемых изданиях).
Личным вклад автора
Личный вклад автора состоит в том, что им осуществлена постановка задачи всех экспериментальных исследований и самостоятельно получены все теоретические результаты. Автор принимал личное участие во всех экспериментах и ему принадлежит интерпретация всех основных экспериментальных и теоретических результатов, представленных в диссертации. Автором выдвинута основная гипотеза и разработана модель механизма биологического действия радиационной стимуляции при больших и малых дозах.
Под руководством автора успешно защищена кандидатская диссертация В. Н. Кулепанова «Особенности стимулирующего действия у- радиации на объекты марикультуры» по специальности радиобиология в МГУ в 1991 г.
Объем и структура диссертации
Основные молекулярно - клеточные реакции на облучение при малых дозах ионизирующей радиации
При гомогенном распределении дозы, поглощенная доза в большой массе ткани идентична дозе в маленькой массе ткани. Средняя доза от поглощения одной частицы в микромассе биологической ткани называют средней "удельной энергией" (Z,). Это дозу, отнесенную к 1 нанограмму ткани, называют средней "микродозой". Доза, полученная клеткой, может состоять из единственного попадания или из многократных попаданий, то есть, от одной или более микродоз. В ткани доза 0.01 Гр, составляет среднюю микродозу (Z,) - 0.0009 Гр для гамма - квантов (250 КЭВ), 0.006 Гр для протонов (10 МЭВ), и 0.35 Гр для альфа - частиц (4 МЭВ). Это различное качество частиц определяются их линейными потерями энергии (ЛПЭ), выраженные в КЭВ на 1 мкм траектории частицы. Облучение с высоким ЛПЭ и, следовательно, с высокими средними микродозами, затрагивает меньшую часть клеток (F), при меньшем числе треков на одну клетку. Данная малая тканевая доза отображает среднюю дозу, полученною клеткой. Тканевая доза может быть выражена в микродозиметрических терминах, как D = ———, где JV# Нн число треков на микромассу (клетку), NE - число облученных микромасс (клеток). С физической точки зрения малые дозы соответствуют одному событию пролета частицы сквозь заданный чувствительный объем. Тогда, распро 17 страняя это понятие на биологические объекты, малые дозы будут соответствовать наименьшему воздействию на биологическую структуру, когда происходит только одно событие пролета ионизирующей частицы через заданный биологический объем [90]. Согласно Д. М. Спитковскому [92], величина низкой дозы в основном определяется долей пораженных мишеней и варьирует для разных видов излучения. При прохождение одной ионизирующей частицы через ядро клетки эти дозы будут порядка 10" - 10 Грей [167], в зависимости от размеров ядра. Микродозиметрические расчеты показывают, что суммарная поглощенная доза 0,01 Гр гамма-излучения 60Со вызывает в среднем три повреждения ядра [165].
Однако в этих определениях малых доз с физических позиций присутствует определенная искусственность. Непонятно из каких соображений постулируется прохождение одной частицы через ядро клетки? Заметим, что при действии а - частиц на клеточные культуры биологические эффекты регистрируются при прохождении 0,05 - 0,3 частицы на клетку [190].
С биологических позиций, малыми дозами считаются такие дозы, которые не могут привести к вредным для организма последствиям. При оценке биологической эффективности облучения часто используют ограничения, принятые в докладе НКДАР ООН [243], базирующиеся на принципе онко-генной безвредности для смешанной популяции людей при облучении с низкой величиной линейной потери энергии (ЛПЭ). При таком подходе малыми дозами радиации можно считать дозы не более 2-Ю 1 Гр, или дозы мощностью не более 0,6 Гр/ч. Считается, что облучение в таких дозах не может привести к вредным для организма последствиям ввиду того, что наблюдаемый при таких мощностях доз уровень индуцированных повреждений ДНК в несколько раз ниже уровня спонтанных повреждений [142]. A.M. Кузин считал, что под малыми дозами нужно понимать сублетальные дозы, лежащие на два порядка ниже летальных [54]. Т. Д. Лукки [174] определяет малая доза, как дозу между фоновой дозой от окружающей среды и пороговой дозой, вызывающей определенные физиологические реакции. Определенные физиологические реакции - дисфункцию двигательной активности клеток мерцательного эпителия, мы наблюдали уже при дозе 7,5-10-5Гр[34,45].
Е. А. Нейфах [72] считает, что для хронического облучения термин «малые дозы» (до 15 сЗв) необоснован, особенно, для детей. Реалистически оценивать патогенетическую значимость техногенных возрастных радиодоз, считает он, позволяет использование относительной единицы радионагрузки «фон», равной средней мощности суммарного природного фона 1 мЗв / год. Автор обосновывает свою точку зрения тем, что у затронутых контингентов ранними радиогенными биохимическими симптомами являются подъём уровней катаболитов липоперекисного каскада с одновременным и сопряженным истощением системы незаменимых антиоксидантов (витамины Е и А), объединённые в «Чернобыльский синдром». У детей до 1 года 0,4 сЗв повышают отношение уровней катаболитов липоперекисного каскада к уровню антиоксидантов в 4 раза
Аналогично считает и Л. М. Рожденственский [86], основываясь на анализе эпидемиологических данных по японской и чернобыльской когортам лиц, подвергшихся облучению в разных дозах. По его мнению доза 200 мГр необоснованно высока, чтобы считать ее верхней границей при определении малых доз. По расчетам Л. М. Рожденственского [86] верхней границей малых доз для редкоионизирующих излучений и клеточных ядер диаметром 8 мкм является доза 0,65 мГр, а нижней границей больших доз - 8 мГр.
Приведенные факты наглядно демонстрируют сложность определения понятия малых доз с биологических позиций. По сути, исследователи определение малых доз сводят к поиску пороговой дозы, т.е. дозы при которой не наблюдаются процессы радиационного поражения. Трудности определения такой границы связаны с многообразием ответных реакций организма и клетки на ионизирующее облучение. Для различных биологических процессов и различных биологических объектов определение малых доз будут разниться. Поэтому само понятие малой дозы с биологической точки зрения весьма условно, и часто определяется интуитивно. Так в материалах 3 -го Международного симпозиума "Механизмы действия ионизирующих сверхмалых доз" (Москва, 3-6 декабря 2002года), авторы сообщений оперировали понятием «малая доза» в диапазоне от 7,5-10"5 Гр до 30 Гр.
Заметим, что единства мнений не наблюдается и в определении границ малых доз при радиационном гормезисе. В статье Р. Маклиса и Б. Брисфорда [176] эти границы определяются следующим образом: «Понятие радиационный гормезис обычно применяют к физиологической пользе от облучения с низкой величиной ЛПЭ в диапазоне от 1 до 50 сГр общей поглощенной дозы» [176]. С другой стороны, К. Л. Мосман и Л. М. Ледесма [188] считают, что явление гормезиса обычно наблюдают при дозах облучения меньше 10 сГр. Верхняя граница малых доз в приведенном выше интервале Р. Маклиса и Б. Брисфорда в 2,5 раза превышает определение НКДАР ООН малых доз [243]. Заметим, что при дозе 50 сГр у самцов млекопитающих происходит массивное клеточное опустошение половых желез [99], что вряд ли можно отнести к физиологической пользе от облучения.
Итак, можно констатировать, что никаких достаточно обоснованных физических или биологических критериев для проведения строгих границ между большими и малыми дозами до настоящего времени нет. Условно примем оценку, содержащуюся в докладе НКДАР ООН [243], т.е. малыми дозами радиации будем считать дозы не более 2-Ю 1 Гр [243].
Исследования на красной водоросли грацилярии бородавчатой Gracilaria verrucosa (Huds.) Papenf. (Rhodophyta, Gigartinales)
Сухие яйца A. salina, раса о. Онтарио, отбирали при десятикратном увеличении в стеклянные бюксы по 1000 штук в каждый, заливали 20 мл солевого раствора и спустя 5 ч облучали /- лучами 60Со на установке рх - у- 30 (фирма «Изотоп») (мощность дозы 0,25 Гр/с). Используемые в эксперименте среды с различной соленостью приготавливали на основе профильтрованной и аэрированной морской воды из Уссурийского залива Японского моря, добавляя в нее необходимые количества NaCl или разбавляя дистиллированной водой до требуемой концентрации. Для измерения солености (электропроводности) использовался прибор ИЭ-1, который был разработан и изготовлен в Институте вычислительного моделирования СО РАН. Для измерения электропроводности в приборе применена мостовая схема, в одно из плеч которой подключается измерительная кювета с пробой воды. Калибровка прибора производилась по растворам поваренной соли с различной ее концентрацией.
Выклев науплиев регистрировался в течение 7 суток с момента замачивания цист A. salina в условиях постоянной температуры 27±0,5С и круглосуточного освещения люминесцентными лампами (освещенность 1000 лк). Водные растворы супермутагенов алкилирующих соединений N-нитрозометилмочевины (НММ) и 1 - 4 - бис-диазоацетилбутана (ДАБ) вводили в среду с яйцами при аналогичных условиях.
Исследования влияния повышенной температуры на зрелых рачках в возрасте 40 дней (раса оз. Онтарио), облученных на стадии диапаузы яиц, проводились на группах животных, состоявших из 50 особей (25 самок и 25 самцов). Температуру среды повышали в течение 1 ч от 27 до 36 С. В случае облучения особей A. salina, достигших определенного возраста, их отбирали по 25 шт в стеклянные бюксы, содержащие 50 мл морской воды (69%о) и немедленно облучали. Для экспериментов по продолжительности жизни использовали раствор морской воды при солености 69%о, из которого отбирали выклюнувшихся из яиц науплиев. Затем их помещали в 50 мл морской воды той же солености по 50 штук на бюкс. По истечении 7 суток после выклева животных переносили в 100 мл, и по прохождении следующих 7 суток - в 200 мл воды той же солености. Далее объем среды оставался неизменным до конца эксперимента. Температуру поддерживали постоянной (27±0,5С). Кормление проводили по специально разработанной методике водной суспензией гидролизных дрожжей [26]. Смену воды в банках осуществляли 1 раз в 2 недели. При определении размеров животного бралось не менее 15 особей на точку.
В экспериментах по введению меченных предшественников синтезов ДНК и РНК науплиев A, salina (раса оз. Сасык) соответствующего возраста, выклюнувшихся из облученных или обработанных мутагенами яиц, отбирали в партии по 15 штук в стеклянные бюксы, содержащие 10 мл морской воды (соленость 69%о), вводили раствор 3Я-тимидина или 3Я-уридина (активность 2,74 МБк) и выдерживали при температуре 27С в течение суток. Затем науплиев отмывали в морской воде (соленость 69%о) И фиксировали в растворе Карнуа. Выделение нуклеиновых кислот проводили по Шнейдеру [14]. Интенсивность метки определяли на сцинтилляционном счетчике SL-300 (Вели-кобритания). Интенсивность включения Я-тимидина и Я-уридина рассчитывали на единицу длины тела рачка, так как ввиду малых размеров науплиев A. salina измерение сухого веса рачка представлялось затруднительным.
Полученные данные обрабатывались с использованием метода Фишера, метода парных сравнений и регрессионного анализа [79]. Повторность экспериментов 3 - 5-кратная. 2.2. Исследования на моллюсках (приморский гребешок
Mizuhopecten yessoensis) Исследования проводили на четырех возрастных группах М. yessoensis: спате (осевшие личинки гребешка), однолетних (неполовозрелых), двухлетних (впервые созревающие) и трехлетних (участвовавших в нересте).
Спат собирали с коллекторов в б. Алексеева (о. Попова Японское море), оттуда же доставляли взрослых гребешков, выросших на искусственных плантациях.
Неполовозрелых моллюсков отбирали в ноябре, половозрелых - в июне. Перед облучением животных в течение 3 суток адаптировали к лабораторным условиям. Облучение проводили на установке РХ-/-30 у- лучами 60Со (мощность дозы 0,1 Гр/с)
Полевые эксперименты проводили на гребешковых плантациях в б. Алексеева (о. Попова Японское море). Облученных и интактных моллюсков рассаживали по 10, шт. в садки площадью 0,123 м , установленные на глубине 5 м.
Животных содержали в термостатированных морских аквариумах объемом 60 л, с постоянной аэрацией и очисткой воды через биофильтр. Гребешков отловленных летом содержали при температуре 17С, а отловленных в ноябре - при 10С. Кормом служила культура одноклеточной водоросли Platimonas viridis.
Результаты экспериментов обрабатывали статистически с применением критерия Стьюдента. В каждом варианте опытов количество животных составляло 15-30 шт. В ряде случаев для оценки действия у- радиации на спат использовали эмпирическую зависимость массы мягких тканей от длины створки раковины гребешка [6]:
Стимуляция жизненных процессов A.salina, выклюнувшихся из обработанных алкилирующими соединениями цист
Итак нами показано, что действие у- излучения значительно повышает выклев науплиев при облучении в широком диапазоне доз (10 - 500 Гр). В период от гидратации цист до выклева науплиев пролиферация клеток и синтез ДНК в яйцах A. salina отсутствуют, в этот период регистрируются лишь процессы клеточной дифференцировки [122, 180]. В то же время регистрируется синтез РНК и белковый синтез [122]. Очевидно, на этом этапе развития A. salina как, повреждающее так и стимулирующее действие радиации может быть связано лишь с синтезом РНК.
Интенсивность синтеза белка снижается в науплиях при увеличении концентрации NaCl, что связывается с угнетением трансляции мРНК в этих условиях [126]. Отсюда и объяснение полученной зависимости выклева нау плиев от солености среды (рис. 3) существованием оптимального уровня концентрации солей для протекания синтеза РНК и белков в замоченных яйцах A. salina, а стимуляцию выклева под действием определенных доз радиации - усилением синтеза РНК. Чем менее соленость соответствует оптимальному уровню протекания биосинтетических процессов, тем ниже процент выклева науплиев A. salina, и тем более отчетливо проявляется эффект радиационной стимуляции по этому признаку.
В цистах артемии рядом исследователями было показано отсутствие процессов пострадиационной репарации как по критерию выклева науплиев, так и по критерию их выживаемости после облучения [180]. Дозы свыше 40 Гр, при которых мы наблюдали стимуляцию выклева науплиев, оказались повреждающими для артемии по критерию выживаемости науплиев, что говорит об оставшихся отнерепарированных радиационных повреждениях.
В то же время наблюдалась достоверная стимуляция выживаемости науплиев, выклюнувшихся при дозах 10 и 20 Гр. Понятно, что при дозе 10 Гр с большим коэффициентом науплиальной гибели по сравнению дозой 20 Гр радиационных повреждений должно быть меньше, хотя при 20 Гр коэффициент смертности науплиев ниже, чем при 10 Гр. Это означает, что эти радиационные повреждения при неизменных условиях не влияют на выживаемость. Дополнительная солевая нагрузка, собственно это и выявила, что и выразилось в снятии стимулирующего эффекта при дозе 20 Гр. По всей видимости, наличием нерепарированных повреждений объясняется повышение гибели науплиев, получивших 20 Гр на стадии диапаузы, при переходе их на следующую онтогенетическую стадию. Скрытые радиационные повреждения, очевидно, сохраняются и на стадии половозрелости, которые выявляются путем повышении температуры.
У рачков, выклюнувшихся из цист, облученных при дозе 10 Гр скрытые радиационные повреждения путем изменения эндогенных условий выявить не удалось. Более того, при этой дозе наблюдалось повышение терморези 102 стентности, как и при дозе 5 Гр, при которой в стабильных условиях никаких гормезисных эффектов не регистрировалось.
Стимуляция продолжительности жизни регистрировалась в одном интервале доз ионизирующей радиации как для бисексуальной диплоидной расы, так и для партеногенетической тетраплоидной расы A. salina. При этом тетраплоидная раса A. salina более радиоустойчива по выживаемости, чем диплоидная. Происходящая при этом стимуляция выживаемости науплиев, выклюнувшихся из облученных в дозах 10 - 20 Гр яиц, также была более выражена у тетраплоидной расы. Эти данные удовлетворительно объясняются, если принять, что стимуляция синтеза РНК, наблюдаемая в данной работе, и белков ведет к повышению выживаемости, а нарушения в молекуле ДНК - к ее снижению (нарушения в геноме тетраплоидной расы, очевидно, менее влияют на выживаемость Л. salina).
Нарушения в геноме, индуцируемые у - излучением, по-видимому, сильнее влияют и на рост A. salina, что и объясняет отсутствие выраженной стимуляции роста при облучении в дозе 20 Гр по сравнению с 10 Гр, несмотря на то, что стимуляция продолжительности жизни наблюдается при облучении в той и другой дозах.
В нашем случае не наблюдалось корреляции между влиянием гамма у облучения и ДАБ на выживаемость и рост A. salina и включением Н-тимидина. В то же время при использовании стимулирующих продолжительность жизни A. salina доз облучения и ДАБ в концентрации 10"4 мг/мл наблюдается повышенное по сравнению с контролем включение Н -уридина. Столь же очевидна связь между включением 3Я - уридина и снижением выживаемости A. salina (облучение в дозе 100 Гр) или отсутствием влияния (ДАВ в концентрации 5-10"3мг/мл) на продолжительность жизни. Также наблюдается весьма тесная корреляция между включением 3Я - уридина и влиянием гамма - облучения и ДАБ на рост A. salina (коэффициент корреляции 0,835 ± 0,135 при/? 0,05). Тем не менее, регистрируемое при облучении в дозе 20 Гр повышенное включение уридина, отражающее уско 103 ренный синтез РНК, не коррелирует с отсутствием достоверного увеличения роста при этой дозе.
Полученные нами результаты свидетельствуют об усилении синтеза РНК при стимулирующем действии радиации на животные организмы.
Наблюдаемое нами стимулирующее действие алкилирующих соединений на жизненные процессы у A. salina также сопровождается повышенным включением 3 Н - уридина в ткани рачка. Возможно, это свидетельствует об одинаковом механизме стимуляции при действии ионизирующего излучения и алкилирующих соединений, при действии их на гидратированные цисты артемии.
Влияние у - облучения на синтез ДНК и РНК в клетках гонад приморского гребешка
Проведенные исследования показали довольно высокую радиорезистентность гребешков, тем не менее, репродуктивная система моллюсков достаточно быстро реагировала на у - облучение.
В норме в гонадах приморского гребешка (особенно в зимнее время) нередко можно встретить резорбирущие ооциты периода желткообразования [20]. В этом случае разрушение половых клеток в гонаде гребешков, как правило, начинается с лизиса цитоплазматической оболочки в апикальной части клетки, разрыхлением под ней цитоплазмы, изменением ее цитоскелета и набуханием ядра. Ионизирующее излучение, прежде всего, действовало на ядро, в связи с чем в ооцитах и сперматоцитах ядра выглядели оптически пустыми либо пикнотическими, одновременно или несколько позднее дезорганизовывались структурные компоненты цитоплазмы. То есть гибель облученных клеток наступала в результате апоптоза.
Отличительной морфологической чертой апоптоза является коллапс ядра. Хроматин, который в норме представлен открытыми и конденсированными областями (гетеро- и эухроматин), становится суперконденсированным в форме полумесяца по периферии ядра. При апоптозе происходит отделение клеток от внеклеточного матрикса, конденсация ядра, сморщивание цитоплазматической мембраны и, в итоге, образование так называемых апоптоз-ных телец - мембранных пузырьков с клеточным содержимым, поглощаемых впоследствии макрофагами и соседними клетками [64].
Характер поражения половых клеток дозами 7,5 и 15 Гр был примерно одинаков, но при 15 Гр деструктивные процессы в гонаде проявлялись быстрее и ярче, чем при дозе 7,5 Гр. Ответная реакция гонад как самцов, так и самок состояла из двух этапов: 1) всплесков пролиферативной активности камбиальных элементов, и 2) деструкции половых клеток, приводящей к стерилизации животных. Следовательно, первая реакция на у - облучение была связана с выходом оогоний и сперматогоний из фазы покоя, в связи, с чем появилось множество митотических пластинок и клеток в ранней профазе мейоза. Увеличение количества ооцитов-1 (периода ядерных преобразований) так же указывает на то, что определенная часть гамет находилась премейоти ческой интерфазе, и после облучения наблюдалось их вступление на путь дифференцировки.
Объяснить усиленное размножение гоний можно тем, что резорбиру-щие клетки выделяют вещества типа гормонов и, погибая, освобождают пространство, которое, как и гормоны может являться фактором, стимулирующим клетки к делению. Это объяснение не подходит в нашем случае, так как деструктивные процессы проходили одновременно или вслед за процессами пролиферации и дифференцировки, когда еще не образовалось свободное пространство в гонадах после резорбции клеток. Очевидно, в наших экспериментах у - радиация явилась фактором, допускающим деление клеток прямо или опосредовано через гормоны (или вещества типа гормонов).
Общая схема процессов, происходящих в облученной гонаде приморского гребешка, представляется следующим образом. В начальный период у - облучение стимулирует гонии к делению или переходу их к следующему этапу дифференцировки. При этом облучение в более высоких дозах раньше вызывало эту реакцию. Следствием этого было увеличение клеточности гонады (рис. 22) и возрастание числа клеток синтезирующих РНК (рис. 28), что и должно было наблюдаться при вступлении клеток на путь мейотической дифференцировки. Подобная реакция клеток гребешка в первые четыре часа после облучения при столь высоких дозах не наблюдается при ионизирующем облучении в клетках наземных животных. Половые клетки приморского гребешка, вступившие в цикл, не восстанавливались от радиационных повреждений и в дальнейшем погибали. Чем выше доза облучения, тем ранее начинается процесс гибели облученных клеток гонады. Это опустошение сопровождается активной компенсаторной пролиферацией гениальных клеток. Клетки, вступившие в митоз, также не были полностью отрепарированы от лучевого повреждения, что и проявилось в последующем снижении синте 127 за РНК. В дальнейшем начиналась их активная резорбция. Чем выше была доза, тем ранее начинался этот этап. Клетки в гонадах гребешков, облученных дозой 7,5 Гр, сохраняли способность к делению, и степень опустошенности гонады при этой дозе были меньше, что в дальнейшем могло привести к восстановлению от лучевого повреждения.
При облучении при дозах 7,5 и 15 Гр нами зарегистрировано ускорение ростовых процессов у приморского гребешка (раздел 4.1). Для животных, облученных при дозе 15 Гр, стимуляция роста, возможно, была связана с переключением биоэнергетических механизмов с процессов воспроизводства на рост соматических тканей. Животные, облученные при дозе 7,5 Гр, спустя год после облучения имели полноценные гонады. Возможно, при этой дозе стимуляция роста, была связана лишь с частичным переключением биоэнергетических механизмов с процессов воспроизводства на рост соматических тканей. Повышенная пролиферативная активность среди соматических элементов гонады свидетельствовала о том, что такая реакция организма гребешка на облучение в определенной мере универсальна и не является прерогативой только половых клеток.
В остальном радиационные повреждения половых клеток приморского гребешка принципиально не отличались от радиационных поражений половых клеток других групп животных, в частности, рыб и млекопитающих, хотя и происходили при больших дозах. Так, повреждающее действие радиации на половые железы у стерляди на ранних этапах гаметогенеза проявлялось в торможении анатомической и цитологической дифференцировки гонад, уменьшении общего количества половых клеток, нарастания в них дегенеративных изменений, наблюдали уже с дозы 3,5 Гр. У млекопитающих, наиболее радиочувствительны половые клетки самцов на ранних стадиях развития. При дозах 0,5 - 1 Гр у них происходит массивное клеточное опустошение половых желез, а после 2 - 4 Гр наступает стерильность. Стерильность самок возникает при больших дозах, чем у самцов: у мышей при дозах 2 -5 Гр, крыс-при 15 -20Гр [99].
