Введение к работе
Актуальность проблемы:
Увеличение длительности космических экспедиций и расширение круга решаемых в полете двигательных задач повышает значение бортовой профилактики, прогнозирования эффектов гравитационной разгрузки и борьбы с двигательными нарушениями. Необходимость контроля и сохранения нормальной функции скелетных мышц требует комплексного исследования физиологических механизмов и закономерностей адаптационных процессов, обеспечивающую функциональные изменения, адекватные изменению биомеханической среды. Согласно этическим нормам [Генин А.М. соавт. 2001], человека нельзя подвергать неблагоприятным воздействиям, что затрудняет корректный анализ феноменологии процессов и физиологических механизмов атрофии мышечной ткани человека. Экспериментальные исследования на животных позволяют провести более детальный анализ исследуемых процессов и изучить механизмы структурно-функциональных перестроек, с применением более жестких, чем это возможно для человека, методов воздействия и методик исследования [Booth F.W. 1982; Fitts R.H. 1986; Belozerova I.N. 2002; Adams G.R. et al. 2003].
Известно, что у человека после космического полета наблюдается снижение функциональной активности скелетных мышц [Oganov V.S. et al. 1976; Козловская И.Б. соавт. 1984; Martin T. 1988; Leach C.S. 1992; Shenkman B.S. et. al. 1994, 1996; Edgerton V.R. et al 1998; Adams G.R. et al. 2003]. В литературе описаны такие изменения скелетных мышц, вызванные гравитационной разгрузкой, как снижение объема мышцы [Dapp K. et al., 1989; Kozlovskaya I. B. et al. 1996; Desplanсhes D. et al. 1997], избирательное уменьшение площади поперечного сечения (ППС) мышечного волокна [Оганов В.С. соавт. 1982; Riley D.A. et al. 2002], изменения спектра изоформ тяжелых цепей миозина в пользу миозина быстрого типа [Takacs et al. 1980; Caiozzo V.J. et al. 1994], разнонаправленные изменения в сети десминовых филаментов [Nara K. et al. 2002], нарушения целостности дистрофинового слоя сарколеммальной мембраны [Гасникова Н.М. соавт. 2006; Chopard A. et al. 1998, 2005], увеличение объёма экстрацеллюлярного матрикса [Karpakka J. et al. 1991; Miller T.D. et al. 2001; Kjaer M. 2004]. Данные современных исследований качественных и количественных изменений белков внутриклеточного цитоскелета и экстрацеллюлярного матрикса постуральных мышц в условиях микрогравитации по-прежнему остаются единичными.
Архитектура скелетно-мышечной клетки определяется балансом сил напряжения внутреннего актинового цитоскелета, костамеров и внеклеточного цитоскелета, формирующих систему самоорганизующихся напряженных модулей и обладающих координированной активностью. Действие микрогравитации на мышечную клетку реализуется через ряд механизмов, которые можно условно разделить на внешние системные, (изменение биомеханики движений, отсутствие опоры и снижение сопротивления среды, нейрорегуляторные и гормональные воздействия) и внутренние местные, (накопление ионов Са2+ в мышечном волокне, нарушение процессов белкового синтеза, усиление протеолиза и др.). Гравитационно-зависимые изменения мышечных белков носят комплексный характер, затрагивающий все структурные уровни, и приводят к компенсаторной адаптации мышцы [Oganov V.S. et al. 1980, 1981, 1982, 1990; Edgerton V.R. et. al. 1998; Fitts R.H. et. al. 2000]. Состояние постуральных скелетных мышц во многом зависит от изменений компонентов саркомера (актин, миозин, титин, небулин, белки М-линии), внесаркомерного цитоскелета (десмин), сарколеммальных белков, формирующих костамеры (дистрофин) и экстрацеллюлярного матрикса (интегрин, коллаген).
На сегодняшний день нет ясного понимания физиологической роли промежуточных филаментов (ПФ) десмина в работе скелетных мышц в нормальных условиях. Известно, что экстрамиофибриллярный цитоскелет десмина, опосредованно через синкоилин и десмуслин/сименин, крепится к мембранным адгезивным комплексам, показана прямая связь между десмином и спектрином и анкерином, непосредственное взаимодействие десмина с белком интрафибриллярного цитоскелета небулином [Capetanaki Y. et al. 2002]. В исследованиях на десмин-/- мышах показано, что нарушение синтеза десмина приводит к разуплотнению саркомеров, нарушению латерального выравнивания миофибрилл и их связи с сарколеммой, потере формы и позиционирования ядра, дегенерации, нарушению локализации и изменению формы митохондрий, нарушению клеточной адгезии и расширению межклеточного пространства. Интересно, что в медленных мышцах концентрация десмина вдвое больше, чем в быстрых мышцах, что может определять физиологические особенности постуральных скелетных мышц. Однако, литературные данные, посвященные влиянию гравитационной разгрузки на свойства ПФ десмина в медленной (камбаловидной) мышце в настоящий момент остаются единичными и часто недостоверными [Chopard A. et al. 2005, Capetanaki Y. et al. 2007; Dapp et al. 2004, Nara K. 2002; Enns et al. 2007].
Сложность механизма регуляции коллагеногенеза, включающего перекрёстное влияние различных сигнальных путей ()TGF- и ()TNF-, факторов роста (IGF-1, b-FGF, VEGF, PDFG), простагландинов, цитокинов (Ил-1, Ил-6, Ил-8), NO, активации/подавления ММР-2/TIMP-1, ММР-9/TIMP-2 [Sakuma K. et. al., 2000; Kjaer M., 2004], не позволяет сформировать чёткой гипотезы гравитационно-зависимых изменений.
Целью настоящего исследования являлся экспериментальный гистоморфологический анализ изменений цитоскелетных и экстрацеллюлярных белковых структур мышц человека и животных при различной длительности гравитационной разгрузки, а также в условиях дополнительного механического и фармакологического воздействия.
Задачи исследования:
-
Изучить динамику объёма десминовых и дистрофиновых структур мышечного волокна и объема коллагеновых структур I и III типа в скелетных мышцах животных на разных сроках моделируемой гравитационной разгрузки.
-
Проверить гипотезу о роли накопления ионов кальция в изменении характеристик цитоплазматических и экстрацеллюлярных белковых структур в постуральных мышцах животных в условиях гравитационной разгрузки и возможность использования блокаторов кальция для предотвращения этих изменений.
-
Проверить гипотезу об эффектах пассивного растяжения на коллагеновые и десминовые структуры в условиях моделируемой гравитационной разгрузки.
Научная новизна:
Определена динамика изменений компонентов внутриклеточного цитоскелета (десмина, дистрофина) и экстрацеллюлярного матрикса (изоформ коллагена I и III типа) МВ камбаловидной мышцы животных при разных сроках гравитационной разгрузки.
Выявлены качественные и количественные изменения в структуре изоформ коллагена экстрацеллюлярного матрикса МВ, увеличение доли изоформы коллагена Ш типа к поздним срокам гравитационной разгрузки.
Показана возможность частичного предотвращения увеличения общего объёма, изменения изоформного состава коллагена и сохранения дистрофинового слоя мышечного волокна камбаловидной мышцы крысы при 14-суточном антиортостатическом вывешивании, сочетанном с хроническим введением блокатора кальциевых каналов L-типа, нифедипина.
Показано, что пассивное растяжение на фоне антиортостатического вывешивания камбаловидной мышцы крысы позволяет частично предотвратить увеличение общего объёма и состава изоформ коллагена I и III типа.
Теоретическая и практическая значимость работы:
Настоящее исследование расширяет понимание физиологических и биохимических структурных изменений, происходящих в скелетной мускулатуре животных и человека при гравитационной разгрузке. Полученные результаты могут использоваться при разработке методов профилактики негативного воздействия невесомости. Разработанные иммуногистохимические (ИГХ) и топогистохимические (ТГХ) методы морфологического исследования цитоскелетных и экстрацеллюлярных белков скелетных мышц успешно используются клинической практике, в том числе в гинекологии и неврологии.
Положения, выносимые на защиту:
-
Нарастание общего объёма коллагена в камбаловидной мышце при моделируемой гравитационной разгрузке прямо пропорционально её продолжительности и сопровождается увеличением доли изоформы коллагена III типа и уменьшением доли изоформы коллагена I типа.
-
Адаптация системы промежуточных филаментов десмина к условиям гипогравитации происходит на ранних сроках гравитационной разгрузки, к 7-м суткам активность процесса адаптации существенно снижается.
-
Пассивное растяжение мышцы и введение блокатора кальциевых каналов L-типа позволяет частично предотвратить деструкцию цитоскелетных сократительных и несократительных белковых структур в условиях гравитационной разгрузки.
Апробация работы:
Материалы диссертации доложены на IV, V, VI «Конференциях Молодых Учёных» (Москва ГНЦ РФ ИМБП РАН, 2004, 2005, 2007). На XXXIV European Muscle Conference, Hortobari, Hungary, 2005, P.17. На «XIII международном совещании» и «VI школе по эволюционной физиологии», Санкт-Петербург, 23-28.01.2006. На 27th Annual International «Gravitational Physiology Meeting», Osaka, Japan, 2006. На 16th IAA «Human in Space» Symposium, 21-24.05.2007. На VI Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», 2007, Москва.
Диссертация апробирована на секции Учёного совета 10.11.2009 г. ГНЦ РФ - ИМБП РАН.
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 в журналах рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации:
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы. Текст диссертации изложен на 136 страницах, иллюстрирован 15 рисунками. Полученные данные представлены в 14 таблицах и 34 графиках. Список литературы включает 317 источника, из них 20 – работ отечественных и 297 - иностранных авторов.
