Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Основные механизмы, контролирующие мышечную массу 10
1.2.Действие на мышцу пассивного растяжения 12
1.2.1. Влияние растяжения на рост мышцы 12
1.2.2. Ростовые процессы в мышце при разгрузке и растяжении. Поддерживающая функция растяжения 14
1.3. Возможные механизмы, опосредующие действие растяжения на мышцу 17
1.3.1. Клетки-миосателлиты 17
1.3.2. Участие белка дистрофина в процессах мехатютрансдукции 26
1.3.3. Система mTOR и ростовые процессы в мышце 29
1.3.4. Роль цитоскелетных белков в регуляции массы мышцы 31
Глава 2. Организация и методы исследования 33
2.1. Использованные в работе экспериментальные методы и подходы 33
2.2. Эксперименты с животными и обработка биологического материала 33
2.3. Методики обработки биоматериала и анализа данных 38
Глава 3. Результаты исследования 44
3.1. Выяснение роли белка дистрофина в реализации анаболического эффекта пассивного растяжения разгруженной постуральной мышцы 44,
3.2. Изучение вклада клеток-предшественников в поддержание морфологических характеристик m. soleus крыс при пассивном растяжении мышцы на фоне гравитационной разгрузки 49
3.3. Эксперимент с предшествующей гравитационной разгрузкой и пассивным растяжением на фоне вывешивания 54
3.4. Эксперимент с хроническим введением рапамицина - ингибитора mTOR на фоне вывешивания с растяжением 57
Глава 4. Обсуждение результатов 59
4.1. Ростовые процессы в постуральной мышце при гравитационной разгрузке и растяжении на фоне гравитационной разгрузки 59
4.2. Предполагаемые механизмы профилактического действия пассивного растяжения m. soleus на фоне разгрузки 63
Заключение 73
Выводы 74
Список литературы 75
- Основные механизмы, контролирующие мышечную массу
- Использованные в работе экспериментальные методы и подходы
- Выяснение роли белка дистрофина в реализации анаболического эффекта пассивного растяжения разгруженной постуральной мышцы
- Ростовые процессы в постуральной мышце при гравитационной разгрузке и растяжении на фоне гравитационной разгрузки
Введение к работе
Актуальность проблемы
Скелетная мышца — пластичный орган, что позволяет ей адаптироваться к изменению условий функционирования, воздействующих как на мышцу, так и на организм в целом. Хроническое снижение функциональной нагрузки на постуральные мышцы и, прежде всего, m. soleus при длительном изменении действия гравитационных сил (переход в горизонтальное положение, устранение опоры на все или только задние конечности, пребывание в условиях невесомости), которое принято называть гравитационной разгрузкой, приводит к глубокой перестройке всей структурно-функциональной организации мышечной ткани. Среди наиболее важных проявлений гипогравитационной перестройки мышц — снижение сократительных возможностей (силы и работоспособности), снижение жесткости мышцы и ее волокон, значительное уменьшение объема ядерного, миофибриллярного аппарата и размеров волокна (атрофия), разрастание соединительнотканных и экстрацеллюлярных структур, изменение миозинового фенотипа волокон в сторону увеличения экспрессии быстрых изоформ тяжелых цепей миозина. Данные недавних исследований позволяют считать, что в основе гравитационно-зависимой перестройки волокон m. soleus лежит стабильное направленное изменение экспрессии большого числа генов, формирование нового целостного т.н. «атрофического» паттерна экспрессии [100]. Теоретически масса скелетной мышцы при разгрузке или нагрузке может меняться за счет изменения количества миоядер, скорости процессов транскрипции, трансляции и интенсивности протеолиза [55].
Настоящая работа включает в себя исследования в области гравитационной физиологии, касающиеся механизмов мышечной пластичности в условиях моделируемой гравитационной разгрузки и мышечного напряжения на ее фоне.
Хроническое пассивное растяжение мышцы — это длительное искусственное повышение механического напряжения структур мышечных волокон. Оно позволяет предотвратить большинство атрофических проявлений в постуральных мышцах млекопитающих, развивающихся при пребывании в условиях гравитационной разгрузки (уменьшение размеров мышечных волокон, снижение числа миоядер, содержания белка в мышечной ткани, изменение миозинового
5 фенотипа) [66, ПО, 131]. Пассивное растяжение m. soleus значительно увеличивает
скорость синтеза мышечных белков [66, 113]. Данные наших исследований
свидетельствуют о том, что этот эффект растяжения зависит преимущественно от
механизмов, локализованных в самой мышце (а не связан с работой
проприоцепторов растяжения) [131]. Однако клеточные механизмы
профилактических эффектов растяжения на фоне функциональной разгрузки
остаются в значительной степени неясными.
Поскольку механизмы гипертрофического действия пассивного растяжения интактной мышцы, как правило, идентичны механизмам, обеспечивающим гипертрофический эффект при резистивной физической нагрузке, мы предположили, что эти известные механизмы рабочей гипертрофии обеспечивают также и поддержание массы постуральной мышцы при ее пассивном растяжении на фоне гравитационной разгрузки.
При растяжении мышцы происходит экспрессия ростового фактора MGF (сплайс-варианта инсулиноподобного фактора роста IGF-1) [120], которая стимулирует пролиферацию резидентных стволовых клеток (клеток-миосателлитов) в мышечной ткани [9]. Активация покоящихся миосателлитов, их введение в пролиферативный цикл с последующим слиянием с материнским волокном и увеличением, таким образом, его ядерного пула могла бы играть важную роль в развитии ростовых процессов, однако, нет работ, однозначно доказывающих необходимость включения ядер миосателлитов для поддержания размеров волокон разгруженной мышцы при растяжении.
Недавние работы свидетельствуют о возможной сигнальной роли белка дистрофина в предотвращении активации протеолиза в мышечной ткани при системной кахексии [5,64]. У мышей mdx с нарушенным синтезом дистрофина не происходит синтез механо-зависимого фактора роста MGF [54]. Это позволяет предположить, что дистрофии (или комплекс ассоциированных с ним белков) является сигнальным звеном, необходимым для реализации анаболического эффекта пассивного растяжения мышцы.
Известно, что рост мышцы может инициироваться действием IGF-1, а также непосредственным механическим раздражением за счет изменения структуры цитоскелетных белков. Цитоскелет выполняет важнейшие сигнальные функции, и его изменения при функциональной разгрузке ранее были показаны неоднократно
[106, 99 и др.]. Уже в течение первой недели разгрузки при использовании общепринятой модели антиортостатического вывешивания достигает предельных значений деструкция титина и небулина [2]. В то же время, исследований по изучению эффективности пассивного растяжения m. soleus после предшествующей деструкции цитоскелета ранее не проводилось.
Рост мышцы при гипертрофии неизменно сопряжен с активацией процессов синтеза белка на рибосомах [31,142]. Существенная роль системы фосфорилирования рибосомальных киназ (Akt/m-TOR) была выявлена и при растяжении интактной m. soleus [21]. При этом известно, что при гравитационной разгрузке функция этой системы подавляется [31]. Вклад системы Akt/m-TOR в поддержание синтеза белка в постуральной мышце при растяжении на фоне разгрузки в настоящее время не изучен.
Таким образом, механизмы, запускающие ростовые процессы, лежащие в основе поддерживающего действия пассивного растяжения постуральной мышцы при гравитационной разгрузке, очевидно, отличны от таковых при растяжении интактной мышцы и в настоящее время требуют изучения.
7 Цель работы состояла в анализе феноменологии и механизмов изменения
основных характеристик ростовых процессов в постуральнои мышце
млекопитающих в условиях моделируемой гравитационной разгрузки, а также
разгрузки сочетанной с хроническим растяжением мышцы.
Задачи работы:
охарактеризовать основные параметры ростовых процессов в постуральнои мышце млекопитающих (размеры волокон, концентрацию белка, состояние ядерного пула и количество клеток-миосателлитов) в условиях моделируемой гравитационной разгрузки и растяжении и на фоне гравитационной разгрузки;
проверить гипотезу о триггерной роли белка дистрофина в ростовых процессах при растяжении на фоне разгрузки;
оценить роль клеток-миосателлитов в реализации профилактического действия пассивного растяжения m. soleus на фоне разгрузки;
проверить гипотезу об участии системы mTOR (фосфорилирования рибосомальных киназ) в реализации анаболического поддерживающего эффекта пассивного растяжения разгруженной постуральнои мышцы;
исследовать действие пассивного растяжения на m. soleus крыс после 7 суток моделируемой гравитационной разгрузки
Научная новизна работы:
впервые показано, что пассивное растяжение на фоне вывешивания позволяет предотвратить снижение массы и размеров волокон m. soleus мышей mdx, дефектных по гену дистрофина;
впервые показано, что пассивное растяжение на фоне вывешивания приводит к резкому усилению процессов пролиферации в m. soleus и увеличивает количество клеток-миосателлитов, экспрессирующих М-кадгерин и NCAM;
впервые показано, что поддержание площади поперечного сечения мышечных волокон и содержания белка в m. soleus при растяжении на фоне разгрузки происходит и при дефиците делящихся клеток-миосателлитов;
впервые установлено, что после 7 суток разгрузки (и соответствующей некомпенсированной деструкции цитоскелета) профилактический эффект пассивного растяжения m. soleus сохраняется;
впервые показано, что профилактический антиатрофический эффект пассивного растяжения m. soleus при вывешивании сохраняется при блокировании протеинкиназы mTOR.
Научная и практическая значимость
Полученные результаты расширяют представление о течении ростовых процессов в постуральной мышце млекопитающих в условиях гравитационной разгрузки и разгрузки в сочетании с пассивным растяжением (моделью эксцентрической нагрузки), а также механизмах, лежащих в основе анаболического эффекта растяжения. Исследование ростовых процессов в постуральной мышце имеет большое практическое значение для оценки эффективности мероприятий, направленных на профилактику атрофии мышц, в том числе на предотвращение негативного влияния на них невесомости, а также создает предпосылки для создания новых модификаций средств физической профилактики.
Положения, выносимые на защиту.
Все основные компоненты ростовых процессов в постуральнои мышце: миоядерный пул, миосателлитные клетки, синтез белка демонстрируют значительную редукцию в условиях моделируемой гравитационной разгрузки.
Применение пассивного растяжения на фоне гравитационной разгрузки как способа навязать мышце хроническое механическое напряжение приводит к поддержанию или увеличению всех основных компонентов ростовых процессов. Однако вклад каждого из этих компонентов в поддержание мышечной массы в этих условиях неодинаков. Искусственная редукция ядерного пула или снижение числа сателлитных клеток могут быть компенсированы при растяжении другими процессами, и не оказывать влияния на поддержание мышечной массы.
Интенсификация синтеза белка для поддержания белковой массы мышцы при пассивном растяжении в условиях гравитационной разгрузки осуществляется на основе сигнальных путей, отличающихся от известных путей, регулирующих рабочую гипертрофию мышцы.
Основные механизмы, контролирующие мышечную массу
Ядра зрелых мышечных волокон являются постмитотическими и не имеют способности к делению [141]. Количество миоядер очень важно, поскольку оно определяет количество ДНК, необходимой для поддержания транскрипции генов [15]. Взаимоотношение между размером волокон и числом миоядер легло в основу концепции миоядерного домена, который представляет собой объем цитоплазмы MB, управляемый продуктами экспрессии генов одного миоядра, которая впервые введена в работах Cheek и сотрудников [41]. Несмотря на то, что понятие ядерного домена довольно условно и очевидно, что экспрессия генов, распределение белков по мышечному волокну зависит от множества переменных, этим понятием удобно пользоваться при описании механизмов пластичности мышц. Во многих работах анализируется не сам домен, а площадь поперечного сечения волокна, приходящаяся на одно миоядро. Allen с соавторами была выдвинута гипотеза постоянствава миоядерного домена [15], которая, однако, оказалась несостоятельной и была опровергнута многочисленными исследованиями в условиях разгрузки и тренировки [82,97, 116,129, 138, 148, 169, 195,].
Дополнительный генетический материал может быть внесен в мышцу только клетками-сателлитами при их слиянии с мышечным волокном. Считается, что они обеспечивают мышечное волокно дополнительными ядрами для роста в постнатальный период [124,125] и участвуют в восстановлении и локальной регенерации мышечных волокон после повреждения [76].
Экспрессии мышечных белков может активироваться или подавляться большим количеством транскрипционных факторов. Регулируя процессы транскрипции, они могут быть очень важны при перестройке скелетной мышцы в ответ на изменяющуюся нагрузку. При увеличении нагрузки на мышцу усиленно экспрессируются миогенные регуляторные факторы (MRF), такие как myoD, myogenin, MRP4, однако, остается неясным, насколько это связано с экспрессией генов специфичных именно для скелетной мышцы [55]. В регуляции массы мышцы участвуют и другие транскрипционные факторы. Предполагается, что в передаче механических сигналов от мембран к ядрам волокон скелетных мышц может играть роль сигнальный путь интегрин pi, RhoA, FAK (фокальная адгезивная киназа) и SRF (сывороточный фактор ответа), снижение концентрации которого происходит при вывешивании и увеличение при функциональной перегрузке [38, 72]. Некоторые транскрипционные факторы (NFAT), участвующие в перестройке скелетной мышцы контролируются кальцием, в основном через кальцинейрин. Однако последние исследования свидетельствуют, что он участвует главным образом в регуляции фенотипа, а не гипертрофии мышцы [38].
Процесс синтеза белка (или трансляции м-РНК) условно подразделяется на 3 этапа. Каждый этап требует участия трансляционных факторов (эукариотические факторы инициации, элонгации и релизинг-факторы, соответственно elFs, eEFs и eRFs), которые временно связываются с рибосомами и контролируют ход и правильность трансляции. Считается, что ключевым в гипертрофии скелетной мышцы является сигнальный путь Akt/tuberoses sclerosis complex (TSC)2/ mammalian target of rapamicyn (mTOR), посредством воздействия на факторы инициации и элонгации приводящий к усилению синтеза белка. mTOR стимулирует биогенез рибосом, инициацию трансляции и элонгацию через фосфорилирование рибосомальных киназ p70S6K и предотвращение связывания 4Е-ВР1 с эукариотическим фактором инициации (elF) 4Е [32]. Кроме того, Akt усиливает трансляцию через ингибирование GSK3, контролирующую активность eIF2B. Таким образом, сигнальный путь Akt/TSC2/mTOR интегрирует воздействия различных стимулов для достижения метаболического ответа мышцы [85].
При снижении сократительной активности в волокнах скелетной мышцы активируется убиквитин - протеосомная система, которая является важным компонентом системы протеолиза в эукариотических клетках [149]. Уровень м-РНК специфических для мышцы лигаз атрогина-1 (или MAFbx) и MURF1 и других компонентов убиквитин-протеосомной системы увеличивается при вывешивании, денервации и иммобилизации мышцы [30, 50]. Интенсивность транскрипции генов, ответственных за атрофию мышцы (атрогенов) управляется протеинкиназой Akt путем ограничения перемещения их транскрипционных факторов семейства Foxo в ядро клетки [99]. Убиквитин-протеосомный распад белков мышечных белков также может активироваться и другими транскрипционными факторами, например, семейства NF- кВ [reviewed in 99].
Волокна скелетной мышцы механочувствительны (являются механоцитами). Это означает, что при воздействии механических факторов в них существенно изменяется экспрессия генов, определяющих массу мышцы и ее фенотип [69]. Было показано, что растяжение является мощным стимулом синтеза белка и роста мышц. В постнатальном онтогенезе волокна скелетных мышц удлиняются за счет добавления новых саркомеров на концах существующих мышечных волокон [68]. Такая возможность существует даже в волокнах полностью сформировавшихся мышц при приспособлении к новой функциональной длине. В них наблюдалась приспособление длины саркомеров для оптимального развития силы мышцы [178, 190]. Эффект растяжения и адаптации к возрастающей функциональной длине саркомера сопряжен с увеличением синтеза белка. В работах лаборатории Goldspink при растяжении атрофированной (после вывешивания) мышцы, содержание РНК увеличилось на 44%, а скорость синтеза белка — на 59%. При растяжении показано увеличение содержания белка, площади поперечного сечения медленных волокон и длины мышцы за счет увеличения числа саркомеров [44]. Растяжение резко увеличивает скорость синтеза белка в мышцах, не влияя, однако, на скорость его распада. [66, 113]. В эксперименте Lowe и Alway растяжение вызывало гипертрофию мышц крыльев японских перепелов [114].
Использованные в работе экспериментальные методы и подходы
Для исследования влияния гравитационной разгрузки на постуральные мышцы млекопитающих применяли модель гравитационной разгрузки — антиортостатическое вывешивание. Растяжение экстензоров голени (модель эксцентрической нагрузки) проводилось на фоне вывешивания. Для изучения механизмов профилактического влияния пассивного растяжения использовали различные экспериментальные подходы: исследования на животных, дефектных по гену дистрофина; подавление пролиферативных способностей клеток-миосателлитов у-облучением, растяжение мышцы, после 7 суток предшествующей гравитационной разгрузки, блокирование протеинкиназы mTOR. Обработка материала проводилась иммуногистохимическими и биохимическими методами.
Все эксперименты на животных были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ-ИМБП РАН. Животные (мыши и крысы) содержались в стандартных условиях вивария, получали корм в соответствии с рационом для лабораторных животных и воду ad libitum. Вывешивание (моделируемая гравитационная разгрузка) проводили по методу Ильина — Новикова за хвост, таким образом, чтобы задние конечности не касались земли, а передние на него опирались. Тело животных при этом располагалось под углом 45 к полу клетки [132] (рис. 1 а). При растяжении экстензоров голени, голеностопные суставы обеих тазовых конечностей были иммобилизованы при помощи гипсовой повязки в положении тыльного сгибания под углом 35 [151, 131] (рис. 1 б). При проведении растяжения применялся нембуталовый наркоз в дозе, вызывающей хорошую релаксацию скелетных мышц (50 мг/кг массы тела животного).
Для выявления роли белка дистрофина в предотвращении атрофии разгруженной постуральной мышцы при растяжении был проведен эксперимент с растяжением m. soleus мышей, у которых отсутствует дистрофии (мыши линии mdx).
Животные группы «Вывешивание C57black - CHS» (п=7) и группы «Вывешивание mdx - MHS» (п=б ) находились в состоянии антиортостатического вывешивания (рис.1)
Животные группы «Вывешивание на фоне растяжения C57black - CHSt» (n=7) и группы «Вывешивание на фоне растяжения mdx - MHSt» (п=6) были вывешены с одновременным растяжением m. soleus.
За день до завершения эксперимента животным был внутрибрюшинно введен BrdU (5 -бром- 2 - дезоксиуридин) в дозе 100 мг на кг массы. На 21 сутки животных забивали методом цервикальной дислокации и выделяли m. soleus обеих задних конечностей. М. soleus обеих конечностей освобождали от соединительной и жировой ткани, разрезали поперек, помещали на картон и покрывали средой для заключения Tissue Тек (О.С.Т. Compound 4583). Далее образцы замораживали в жидком изопентане, охлажденном в жидком азоте, и хранили при - 80 С. Поперечные срезы мышечной ткани толщиной 10 мкм делали в криостате фирмы Leica при -20C. Срезы располагали на покрытых адгезивом гистологических стеклах. Для выявления миоядер, центрально-расположенных ядер и определения ядерного домена использовали иммуногистохимическое выявление белка дистрофина (утрофина у mdx мышей) и окрашивание DAPI. Ядра пролиферирующих клеток выявляли методом окрашивания против BrdU. Для определения площади поперечного сечения мышечных волокон срезы окрашивали антителами против быстрых и медленных изоформ тяжелых цепей миозина.
Для выяснения роли клеток-предшественников в ростовых процессах в т. soleus проводили растяжение на фоне разгрузки m. soleus интактных крыс и крыс, предварительно локально облученных в области голени ионизирующей радиацией в дозе, позволяющей убить пролиферирующие миосателлиты.
Использовали 43 самца крыс Wistar в возрасте 2,5 месяца. За пять дней до начала эксперимента обе голени 22 крыс были подвергнуты у - облучению дозой в 2500 рад в течение 15 минут. Перед воздействием животные были обездвижены с помощью нембуталового наркоза (20 мг/кг массы тела) и укрыты свинцовыми щитами таким образом, чтобы экспонированными источнику изотопа кобальта — 60 оказались только голени. Указанная доза радиации, согласно литературным данным [7,114,154] подавляет пролиферативные способности миосателлитов, не вызывая видимых повреждений мышечных волокон. Продолжительность эксперимента составила 14 суток. Каждая группа кроме группы «Облучение» состояла из 7 животных. В группе «Облучение» было 8 животных.
Выяснение роли белка дистрофина в реализации анаболического эффекта пассивного растяжения разгруженной постуральной мышцы
Вес m.soleus у мышей mdx в среднем выше, чем у мышей аналогичных групп С57 black. После вывешивания сырой вес мышцы достоверно уменьшился на 43% у мышей С57 black и на 51 % у мышей mdx. Растяжение на фоне вывешивания приводит к восстановлению веса m.soleus. Достоверных отличий по весу мышцы у контрольных животных и у животных этой же линии после вывешивания с растяжением не наблюдается.
Патоморфологический анализ срезов m.soleus мышей линии mdx во всех группах показал в целом правильную форму MB, кроме того, наблюдалась небольшая перимизийная инфильтрация, свидетельствующая, по всей видимости, об умеренном воспалительном процессе. В мышцах вывешенных животных (группы CHS и MHS) наблюдается разрастание соединительной ткани. Во всех группах мышей линии mdx были обнаружены волокна с центральными ядрами, количество которых достоверно больше, чем у мышей С57 black соответствующих групп. В результате растяжения у мышей линии mdx отмечено 5-кратное возрастание числа центральных ядер по сравнению с животными соответствующей контрольной группы и группы вывешивание. Массовое появление центральных ядер наряду с большой вариабельностью размеров волокон в m. soleus мышей mdx при растяжении указывает на усугубление патологического процесса и активную регенерацию мышечных волокон.
У мышей линии С57 black в результате вывешивания ППС медленных MB (MB первого типа) снизилась на 60 %, а у мышей mdx - на 55 % по сравнению со значениями данного показателя у животных соответствующих контрольных групп (табл. 1). После растяжения на фоне вывешивания ППС MB первого типа у мышей С57 black была на 45% выше, чем в группе вывешенных животных этой линии, но ниже (на 29%о), чем в контрольной группе. Растяжение па фоне вывешивания предотвращает уменьшение площади медленных MB также и у мышей линии mdx (ППС медленных MB мышей группы MHSt на 44% выше, чем животных группы MHS), но, как и у мышей линии С57 black, этот показатель не достигает значений, характерных для интактных животных.
После вывешивания ППС быстрых MB (MB второго типа) в m. soleus у мышей линии С57 black была на 57%о, а у мышей mdx на 49% ниже, чем у животных соответствующих контрольных групп. Растяжение на фоне вывешивания m. soleus у мышей линии С57 black привело к снижению ППС MB второго типа на 31 % по сравнению с контрольной группой, однако этот показатель на 38 % выше, чем у вывешенных животных. У мышей mdx ППС MB второго типа после вывешивания с растяжением достоверно не отличается от группы животных с нормальным двигательным режимом, но на 33% больше, чем у вывешенных животных.
Данные по изменению миоядерного числа, т.е. количества миоядер, приходящихся на одно мышечное волокно, представлены в табл. 2.
У мышей линии С57 black в контроле среднее число миоядер на мышечное волокно несколько выше (1,15 ± 0,12), чем у мышей линии MDX (0,9 ± 0,06). Та же тенденция сохраняется при вывешивании и при вывешивании с растяжением. После вывешивания у мышей линии С57 black число миоядер на одно волокно нижается на 35 %. Существенное (на 23 %), но недостоверное уменьшение этого параметра наблюдается и у мышей линии MDX. Трехнедельное растяжение полностью предотвращает уменьшение миоядерного числа и сохраняет его на уровне контроля у мышей обеих линий.
Площадь поперечного сечения волокна, приходящаяся на одно миоядро, у мышей MDX независимо от воздействия в среднем на 36 % больше, чем у мышей линии С57 black. После вывешивания этот параметр как у мышей С57 black, так и MDX снижается на 34%. Растяжение лишь частично, хотя и достоверно предотвращает вызванные разгрузкой изменения ядерно-плазменного соотношения. У мышей С57 black и MDX после вывешивания с растяжением на одно миоядро приходится в среднем на 25% меньше площади поперечного сечения волокна, чем у животных соответствующих контрольных групп.
Таким образом, вывешивание мышей линии С57 black подавляет пролиферативную активность в камбаловидной мышце. Количество ядер с включенным BrDU после вывешивания снизилось на 67% по сравнению с контрольной группой (рис. 6). У мышей линии MDX это изменение недостоверно, хотя наблюдается тенденция (на 36%) к снижению пролиферативной активности. Растяжение m.soleus на фоне вывешивания резко активизирует пролиферативные процессы, о чем свидетельствует пятикратное увеличение количества ядер с включенным BrDU по сравнению с нерастянутой группой, причем интенсивность пролиферации почти вдвое превосходит таковую в контроле (рис.6).
В результате вывешивания крыс вес m. soleus снизился более чем в 2 раза по сравнению с контролем (табл. 3). В группе с растяжением потеря массы m. soleus, сопровождающая гравитационную разгрузку задних конечностей, была полностью предотвращена. Между группами с вывешиванием и растяжением (С, HS и HSS) и аналогичными группами с облучением (I, IHS и IHSS) достоверных различий в весе m. soleus обнаружено не было. Таким образом, радиационное воздействие не повлияло на протекание атрофических процессов в камбаловидной мышце крысы и не элиминировало профилактические свойства растяжения.
Данные морфометрических измерений m. soleus (табл. 3) аналогичны изменению веса мышцы: площадь поперечного сечения мышечных волокон (ППС MB) в группе с вывешиванием (HS) снизилась на 50 % для мышечных волокон медленного (I) типа, и на 35 % для волокон быстрого (П) типа по сравнению с контрольной группой (С). Растяжение предотвратило уменьшение ППС мышечных волокон. Статистически значимых отличий ППС волокон обоего типа между необлученными и аналогичными им группами с облучением выявлено не было. Снижение на 50 % сырого веса m. soleus, вызванное гравитационной разгрузкой, сопровождалось уменьшением миоядерного числа, т.е. количества миоядер на поперечный срез мышечного волокна, на 23 % (рис. 7). Растяжение мышцы на фоне вывешивания возвращало миоядерное число (см. выше) на контрольный уровень. В группе I наблюдалась тенденция к снижению миоядерного числа по сравнению с группой К, а после вывешивания и облучения миоядерное число упало на 30 % по сравнению с аналогичной необлученной группой. В группе IHSS число миоядер снизилось на 50 % по сравнению с группой HSS, и на 18 % по сравнению с группой IHS.
Ростовые процессы в постуральной мышце при гравитационной разгрузке и растяжении на фоне гравитационной разгрузки
После двухнедельного вывешивания мышей и крыс наблюдалась потеря массы m. soleus и почти в два раза сократилась 111 1С медленных волокон. Аналогичные изменения в постуральных мышцах были неоднократно показаны после космических полетов и в наземных моделях невесомости [6,151]. Известно, что пассивное растяжение постуральной m. soleus позволяет в значительной степени предотвратить развитие атрофических изменений при моделировании гравитационной разгрузки [66,110,131,151]. И в нашем эксперименте снижение более чем на 50 % сырого веса и ППС MB камбаловидной мышцы при вывешивании были полностью предотвращены пассивным растяжением. Уже после 7 суток вывешивания абсолютное содержание белка в ней снизилось более чем вдвое по сравнению с контролем и продолжало снижаться с увеличением продолжительности вывешивания. Уменьшение абсолютного содержания белка в m. soleus при гравитационной разгрузке без изменения относительного содержания было ранее установлено в работе Goto [74]. Растяжение на фоне разгрузки в течение 14 дней позволяет поддерживать содержание белка в m. soleus на уровне контрольных животных. В группах с растяжением m. soleus абсолютное содержание белка в мышце достоверно выше, чем у животных вывешенных групп. Из литературы [44, 113] известно, что при растяжении на 59% по сравнению с контролем увеличивается скорость синтеза белка, что, несмотря на повышенный распад, приводит к существенному сокращению атрофии, вызванной вывешиванием. Goldspink [65] и Jaspers [92] показали, что растяжение на фоне вывешивания предотвращает ингибирование белкового синтеза и утилизации аминокислот в m. soleus. Среди возможных механизмов, лежащих в основе увеличения интенсивности синтеза белка при растяжении, особое внимание привлекает возможность активации покоящихся резидентных стволовых клеток (клеток-миосателлитов), их введение в пролиферативный цикл с последующим слиянием с материнским волокном и увеличением, таким образом, его ядерного пула. Как показано в работе Hill [83], эти процессы сопровождают развитие анаболических эффектов при растяжении интактной быстрой мышцы.
Напротив, процессы атрофии при разгрузке сопровождаются уменьшением миоядерного числа, т.е. количества миоядер, приходящихся на поперечное сечение мышечного волокна. В нашем эксперименте в результате вывешивания миоядерное число в m. soleus снизилось примерно на 30%. И другими авторами [17,121] также было показано, что уменьшение ППС MB при вывешивании сопровождается сокращением числа миоядер, приходящихся на 1 мышечное волокно. Поскольку снижение миоядерного числа наблюдается при атрофии, вызванной изоляцией поясничного отдела спинного мозга [13], пребыванием в условиях космического полета [15,16], а также хронической денервацией [152], можно предположить, что уменьшение числа миоядер вследствие апоптоза в определенной степени может обусловливать атрофические процессы [16, 136].
Как и в других исследованиях [135], в настоящей работе было обнаружено более глубокое уменьшение площади поперечного сечения волокон при вывешивании, чем уменьшение миоядерного числа. Это находит свое выражение в уменьшении площади поперечного сечения волокна, приходящегося на одно миоядро (ядерного домена). Размер ядерного домена (т.е. ППС/миоядро и объем цитоплазмы на одно миоядро) уменьшился примерно на треть в результате вывешивания.
Последнее наблюдение может свидетельствовать о более глубоком уровне распада цитоплазматических белков по сравнению с деградацией ядерных структур. Ядерную деградацию при разгрузке обычно связывают с действием механизмов апоптоза [16, 59], однако, Bruusgaard и соавт. [35] подвергли сомнению весь комплекс многократно описанных наблюдений ядерных потерь и апоптоза в условиях разгрузки. Их аргументация строится на результатах подсчета миоядер, меченных GFP на протяжении длительных (недели) сроков денервации или разгрузки. Очевидно, что вопрос нуждается в дальнейших исследованиях, хотя наши данные не подтверждают результатов последнего процитированного исследования.
В настоящей работе мы обнаружили эффективное поддержание всех основных параметров, характеризующих состояние мышечной массы, а также поддержание миоядерного числа и размеров ядерного домена при сочетании разгрузки с пассивным растяжением мышцы. Механизмы этого поддержания еще предстоит проанализировать. Однако можно выдвинуть два предположения. Во первых, можно предположить, что количество миоядер поддерживается в волокне при растяжении посредством замещения апоптотических ядер ядрами, поступающими в волокно при слиянии с ним миосателлитных клеток. Во-вторых, не исключено, что при растяжении интенсивность апоптотических процессов резко уменьшена и механизмы, обеспечивающие поддержание ядерного пула и размеров ядерного домена при растяжении, действуют внутри самого мышечного волокна.
Единственным источником дополнительных миоядер являются клетки -миосателлиты. При размножении они могут сливаться друг с другом и с мышечными волокнами, способствуя мышечному росту [169], репарации и регенерации [76, 158]. Наши результаты свидетельствуют о значительном снижении пролиферации клеток-сателлитов при вывешивании, что было и ранее показано в работе [48] .В настоящем исследовании мы обнаружили достоверное снижение количества клеток-миосателлитов, меченых m-кадгерином, в результате 14-суточного вывешивания. Такое уменьшение было показано и ранее [189]. Однако нам впервые удалось обнаружить, что уменьшение клеточного пула миосателлитов при вывешивании происходит, главным образом, за счет клеток, не реагирующих с антителами против NCAM , то есть в условиях разгрузки гибнут лишь молодые клетки-миосателлиты, находящиеся на этапе пролиферации. Этот факт может также лежать в основе и известного феномена снижения пролиферативного потенциала клеток-миосателлитов, изолированных из камбаловидной мышцы вывешенного грызуна [167]. В пользу этого предположения свидетельствуют и результаты работы Ishido с соавторами [90], где в период после функциональной перегрузки в m. plantaris происходит существенное увеличение количества сателлитных клеток, экспрессирующих М-Cad, но не реагирующих с антителами к NCAM, т.е. идут активные пролиферативные процессы в мышечной ткани.
