Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литературы CLASS 13
1.1. Экспериментальное моделирование аутоиммунных процессов в ЦНС 13
1.1.1. Разработка модели экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) 13
1.1.2. Роль Т-и В-лимфоцитов в развитии ЭАЭ 15
1.1.3. Клинические симптомы и типы ЭАЭ 16
1.1.4. Гистологические признаки ЭАЭ 20
1.1.5. Влияние генетических факторов, пола и возраста на развитие ЭАЭ 20
1.1.6. Метаболические нарушения при демиелинизирующем процессе 22
1.2. Роль цитокинов в развитии ЭАЭ 25
1.2.1. Провоспалительные цитокины 27
1.2.1.1. Фактор некроза опухоли альфа (ФНОа) 27
1.2.1.2. Интерлейкин-Ір(ИЛ-Ір) 32
1.2.2. Противовоспалительные цитокины 36
1.2.2.1. Интерлейкин-Ю(ИЛ-Ю) 36
1.2.2.2. Рецепторный антагонист ИЛ-1 (ЙЛ-І)р.а 41
1.3. Глутамат и его рецепторы , 42
1.3.1. Роль глутамата 42
1.3.2. Типы рецепторов глутамата 44
1.3.3. Строение рецепторов глутамата 45
1.3.4. Функции рецепторов глутамата 47
1.3.5. Канальные блокаторы NMDA-рецепторов 48
1.3.6. Роль глутамата и его рецепторов при демиелинизирующих заболеваниях 51
Глава 2. Материалы и методы 55
2.1. Животные 55
2.2. Индукция ЭАЭ 55
2.3. Оценка клинического течения заболевания 56
2.4. Забор материала.. 56
2.5. Препараты 57
2.6. Морфологические исследования 57
2.7. Протонная магнитно-резонансная спектроскопия (+НМРС) 58
2.8. Определение циркулирующего ИЛ-10 58
2.9. Определение циркулирующего ФНО-а-подобного фактора 59
2.10. Определение экспрессии мРНК цитокинов 59
2.11. Статистический анализ 61
Глава 3. CLASS Результаты CLASS 62
3.1. Характеристика развития ЭАЭ и влияние введения амантадина или мемантина на тяжесть заболевания у животных 62
3.2. Гистологические изменения у животных при ЭАЭ 67
3.3. Прижизненное исследование метаболизма в мозге крыс с ЭАЭ 77
3.4. Исследование циркулирующих цитокинов 82
3.4.1. Динамика уровня ИЛ-10 в крови 82
3.4.2. Исследование циркулирующего ФНОа-подобного фактора 84
3.4.3. Исследование динамики циркулирующего ФНОа-подобного фактора в условиях блокады NMDA-рецепторов глутамата 87
3.5. Исследование экспрессии мРНК цитокинов 90
3.5.1. Базовая экспрессия мРНК цитокинов 90
3.5.2. Экспрессия мРНК цитокинов при развитии ЭАЭ 90
3.5.3. Экспрессия мРНК цитокинов в условиях блокады NMDA-рецепторов глутамата 95
ГЛАВА 4. CLASS Обсуждение CLASS 99
Выводы 113
Список литературы 115
- Влияние генетических факторов, пола и возраста на развитие ЭАЭ
- Определение экспрессии мРНК цитокинов
- Прижизненное исследование метаболизма в мозге крыс с ЭАЭ
- Экспрессия мРНК цитокинов при развитии ЭАЭ
Введение к работе
Исследования, выполненные в 60-70 гг. XX века, убедительно показали взаимодействие центральной нервной и иммунной систем. Было доказано, что наряду с модулирующими влияниями нервной системы существуют афферентные пути передачи информации от активированных иммунных клеток в мозг, который, в свою очередь, регулирует интенсивность ответа иммунной системы на стимул (Клименко, 1972, 1993; Корнева и др., 1978; Корнева 1988). Развитие в последующие годы представлений в области молекулярной биологии, клеточной физиологии, нейроиммуномодуляции, нейроиммуноло-гии позволили подойти к пониманию механизмов нейро-иммунных взаимодействий. Получены убедительные доказательства участия нейромедиаторов, нейропептидов, гормонов, а также цитокинов в этих процессах (Rothwell et al., 1992; Dunn, 1992; Dantzer, 2000; Sternberg, 1997; Акмаев, 1996).
Необходимые для нормальной жизнедеятельности организма нейро-иммунные взаимодействия могут приобретать неконтролируемый патологический характер. Показано, что при таких неврологических и психических заболеваниях, как болезни Паркинсона и Альцгеймера, депрессии, эпилепсии, а также при ишемии и травме мозга происходит нарушение межсистемных взаимодействий (Крыжановский и др., 1997). Особенно ярко это можно наблюдать на примере рассеянного склероза, при котором собственная нервная ткань становится мишенью для «агрессивных» иммунных клеток (Черниговская, 1976; Хондкариан и др., 1987; Гусев и др. 1997).
Рассеянный склероз (PC) представляет серьезную медицинскую и социальную проблему, поражая людей трудоспособного возраста (до 30-50 на 1000 чел. населения в зависимости от региона) и приводя к ранней инвалиди-зации заболевших. Отсутствие методов диагностики на ранних стадиях развития заболевания, когда лечение может быть наиболее эффективным, ставит вопрос о разработке таких методических подходов. Поэтому исследования,
позволяющие оценить активность патологического процесса и жизнеспособность клеток мозга, весьма актуальны. В качестве наиболее перспективного на сегодня рассматривается метод магнитно-резонансной спектроскопии (Ринк, 1993; Arnold et al., 1994; Davie et al., 1993, 1994, 1997; Поздняков и др. 2001).
Огромный вклад в изучение патологических процессов в ЦНС при аутоиммунных демиелинизирующих заболеваниях внесло моделирование этих процессов у животных (Леонович, 1973; Жаботинский, Иоффе, 1975; Марков, Абрамчик, 1978; Хохлов, Савченко, 1990; Wekerle et ah, 1994; BradI & Lining-ton, 1996; Noseworthy et al., 2000). Создание и изучение модели рассеянного склероза — экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) — позволило не только понять механизмы развития демиелинизации, но и разработать методы диагностики и лечения.
Аутоиммунный характер этого заболевания обусловил активное изучение роли клеточного и гуморального звеньев иммунитета, а также цитокинов - медиаторов воспаления - в разрушении миелиновой оболочки. Многими исследованиями доказана патогенетическая роль в развитии ЭАЭ/РС фактора некроза опухоли а (ФНОа), интерлейкина-ір" (ИЛ-1р) и других провоспали-тельных цитокинов, а также защитное действие противовоспалительных цитокинов - интерлейкина-10 (ИЛ-10), рецепторного антагониста ИЛ-1 (ИЛ-1 р.а.) (Brosnan et al, 1988; Navikas & Link, 1996; Zipp & Hohlfeld, 1997 и мн. др.) Понимание разнонаправленности влияний про- и противовоспалительных цитокинов, а также необходимости их баланса для нормального иммунного ответа позволило разработать подходы для лечения этих заболеваний с применением цитокиновых препаратов, в частности на основе интерферонов аир (Hohlfeld, 1997; Гусев, Бойко, 2000; Ширинский и др. 2001). Широкое 'применение этих препаратов ограничено необходимостью длительных курсов лечения (годы), а также их высокой стоимостью (до 12000 $/год). Такое лечение не всегда эффективно (Гусев, Бойко, 2001), что указывает на необхо-
димость разработки методов терапии, направленных на другие патогенетические звенья.
Одно из перспективных направлений поиска методов терапии PC основывается на предположениях Huszak (1958) о метаболической природе де-миелинизирующего процесса. К выводу о первичном нарушении обмена миелина при PC на основе своих исследований пришли Корин с соавторами (1975). Исследования того периода выявили наличие нарушений белкового, углеводного, а также липидного обмена у больных PC, причем, биохимические изменения наблюдались на значительном удалении от очагов демиелинизации (Хохлов, Савченко, 1990). Методические возможности того времени не давали оснований для оценки активности патологического процесса в ЦНС, а также о состоянии нервных клеток in vivo.
Использование современных методов, позволяющих прижизненно оценить уровень метаболизма в мозге и даже в его отдельных областях, показало, что при PC происходит не только демиелинизация, но также гибель лишенных оболочки аксонов, а при интенсивном процессе и самих нервных клеток (Arnold, 1999). Это обстоятельство позволило перейти от анализа процессов демиелинизации к механизмам неиродегенеративных процессов при PC.
В настоящее время установлено, что при ряде неиродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера и Паркинсона, ишемических поражениях мозга) существенную патогенетическую роль играет глутаматергическая система мозга (Беспалов, Звартау, 2000). Существуют данные, позволяющие предположить, что глутамат и его рецепторы вовлекаются также в патогенез PC. У больных в ликворе обнаружено повышение концентрации глутамата (Бархатова, 1997), а при ЭАЭ в астроцитах животных наблюдается снижение активности ферментов, ответственных за его деградацию (Hardin-Pouzet et al., 1997). Эти факты свидетельствуют, что избыток глутамата или чрезмерная активация его рецепторов могут вызывать гибель нейронов, наблюдаемую при PC и ЭАЭ. Регуляция активности рецепторов глутамата, в частности,
NMDA-рецепторного комплекса, может быть дополнительной мишенью для коррекции при PC.
Среди известных на сегодня эффективных фармакологических средств, используемых в клинической практике для лечения нейродегенеративных заболеваний, являются низко аффинные блокаторы NMDA-каналов, поскольку они обладают нейротрофическим действием (Беспалов, Звартау, 2000).
Таким образом, несмотря на многочисленность клинических и экспериментальных исследований, нет окончательной ясности в вопросах патогенеза аутоиммунных реакций при PC: каков вклад периферического и центрального пулов цитокинов; насколько наряду с цитокинами в этот процесс вовлечена глутаматергическая система; возможно ли, регулируя активность глутаматных рецепторов, влиять на развитие демиелинизирующего процесса, и взаимодействуют ли глутаматергические и цитокиновые системы.
Целью исследования явилось изучение активности цитокиновых систем организма крыс при ЭАЭ и возможность ее модуляции посредством глу-таматергической системы.
Задачи исследования
В рамках поставленной цели решались следующие задачи:
Изучение динамики уровня циркулирующих в крови цитокинов в процессе развития ЭАЭ у крыс с разной тяжестью заболевания.
Сопоставление паттерна экспрессии мРНК про- и противовоспалительных цитокинов в клетках иммунной системы и ЦНС в процессе развития ЭАЭ при различной тяжести клинического течения.
Исследование действия антагонистов NMDA-глутаматных рецепторов (амантадина и мемантина) на выраженность клинических проявлений ЭАЭ.
Влияние блокады NMDA-рецепторов глутамата на экспрессию мРНК цитокинов в клетках иммунной системы и ЦНС.
Научная новизна
В проведенном исследовании получены приоритетные данные по описанию динамики уровня циркулирующего в крови ИЛ-10 у крыс с различной тяжестью заболевания, показана прогностическая роль изменений уровня этого цитокина. Доказано, что раннее увеличение содержания ИЛ-10 в крови является благоприятным прогностическим признаком.
Выявлена зависимость выраженности клинических симптомов от базового уровня циркулирующего в крови ФНОа-подобного фактора.
Показаны различия динамики экспрессии мРНК про- и противовоспалительных цитокинов в клетках иммунной системы и ЦНС в процессе развития ЭАЭ, которые, вероятно, и определяют роль периферического и центрального пулов цитокинов в развитии аутоиммунного демиелинизирующего процесса.
Получено приоритетное описание паттерна экспрессии мРНК про- и противовоспалительных цитокинов у животных с разной тяжестью заболевания.
Впервые показано, что протективное действие блокаторов NMDA-рецепторов глутамата при ЭАЭ осуществляется в большей степени на периферическом уровне, за счет подавления продукции ФНОа-подобного фактора.
Научно-практическая значимость работы
Полученные экспериментальные данные расширяют представления о разной роли периферического и центрального пулов про- и противовоспалительных цитокинов в развитии патологических процессов в ЦНС. Выявленное модулирующее действие глутаматергической системы на активность ци-токиновых систем раскрывает новые механизмы взаимодействия нервной и иммунной систем.
Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о вовлечении
ff глутамата и его рецепторов в патогенез аутоиммунных демиелинизирующих
заболеваний. Выявлено, что глутаматергическая система мозга может быть новой мишенью для коррекции при терапии аутоиммунных демиелинизирующих заболеваний. Показано, что канальные блокаторы NMDA-рецепторов глутамата (амантадин или мемантин) могут применяться при лечении форм рассеянного склероза, сопровождающихся активацией глутама-тергической системы.
Полученные данные могут лечь в основу новых подходов для диагно
стики и прогнозирования течения демиелинизирующих заболеваний. Пока-
41 зано, что метод протонной магнитно-резонансной спектроскопии перспекти-
вен для оценки активности патологического процесса в очагах демиелиниза-ции и мониторинга эффективности лечения.
Результаты данного исследования могут быть использованы в преподавании различных медицинских и медико-биологических дисциплин.
л*
V'
Влияние генетических факторов, пола и возраста на развитие ЭАЭ
Неодинаковая восприимчивость к ЭАЭ животных разных видов и линий доказывает роль генетических факторов в индукции аутоиммунных демиелини-зирующих заболеваний. Наиболее восприимчивы к ЭАЭ морские свинки и кролики, однако заболевание у них протекает слишком остро и часто с большим числом летальных исходов. Мыши менее восприимчивы к ЭАЭ и при их использовании, как правило, необходимо дополнительно к мозговому антигену и адъюванту вводить токсин Bordetella pertussis (Lublin et al., 1981). Крысы более восприимчивы, чем мыши, но разные линии крыс отличаются как по восприим чивости к ЭАЭ, так и по типу его течения. Так у крыс линии Lewis отмечается монофазное заболевание, у крыс линии Dark Agouti - хронически рецидивирующая форма ЭАЭ (Lorentzen et al., 1995) даже при введении неполного адъю-ванта Фрейнда, а крысы линии Fisher, Brown Norway резистентны к индукции ЭАЭ.
Фактором, определяющим восприимчивость к ЭАЭ, является наличие определенного гаплотипа генов главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) и генов, не связанных с ГКГ (Baker et al, 1995). Природа этих генов еще окончательно не определена. Предполагалось, что это гены Т-клеточных рецепторов (ТКР) (Burns et al., 1989), однако ряд данных не подтвердил эту гипотезу (Jansson et al., 1993).
Encinas с соавторами (1996) в геноме крыс выявлено 2 локуса (в области теломеры 2-ой хромосомы и в центре 3-ей хромосомы), a Bergsteinsdottir с соавторами (2000) - 11 локусов, связанных с восприимчивостью к заболеванию. Кроме того, показано, что разные фазы ЭАЭ контролируются различным набором генов (Bergsteinsdottir et al., 2000). При этом 5 локусов были общими с другим аутоиммунным заболеванием - ревматоидным артритом. Dahlman с соавторами (1999) обнаружен у крыс аналогичный локус эаэ4 на 9 хромосоме.
У мышей выявлено 2 локуса на 2-ой хромосоме, которые определяют восприимчивость к ЭАЭ (Butterfield et al., 1998). Эти локусы соответствовали хромосомам бр21 и 17q22 человека, которые наиболее часто встречаются у больных PC. Этими же авторами (1999) идентифицированы еще 3 локуса, ответственных за восприимчивость к ЭАЭ на 16, 7 и 13 хромосомах мышей (эаэ11-13, соответственно). Дополнительно, определено, что локус эаэ12 существенен для ремиттирующего ЭАЭ, тогда как эаэ 7 и 13 для монофазного ЭАЭ.
Методами иммуногенетики установлено, что у больных PC также имеется генетическая предрасположенность. Среди больных PC чаще выявляются антигены гистосовместимости A3, В7, DW2, DR2. Также допускается существование специального гена чувствительности к PC (Хондкариан и др., 1987). Среди других факторов, влияющих на предрасположенность к ЭАЭ, отмечались врожденная или индуцируемая чувствительность к вазоактивным аминам, недостаток или отсутствие у резистентных животных энцефалито генных Т-клеток, повышенный уровень Т-супрессоров и другие (Заргарова, Фаво-рова, 1999а).
Кроме генетических факторов на частоту развития и выраженность клинических симптомов ЭАЭ влияет пол животных. Самки оказываются более восприимчивыми к индукции ЭАЭ, при этом заболевание у них протекает в более тяжелой форме, чем у самцов. Аналогично, заболеваемость и тяжесть течения PC выше у женщин, чем у мужчин. У женщин PC начинается в среднем на 1-2 года раньше, но у мужчин выше вероятность развития неблагоприятного первично проградиентного течения PC (Гусев с соавт., 1997).
В экспериментах показано, что вероятность индукции ЭАЭ неодинакова у молодых и старых животных (Smith М. et al., 1999). Наиболее часто дебют PC наблюдается в возрасте 20-30 лет, т.е. PC возникает в период установившегося гормонального развития у лиц со зрелой химически и гистологически структурой миелина (Гусев и др., 1997).
Таким образом, ЭАЭ является адекватной моделью PC, сходной с ним по ряду клинических и гистологических признаков, что позволяет широко использовать эту модель для изучения роли биохимических, иммунологических и морфологических изменений в формировании патологических процессов ЦНС, исследовании роли нейро-иммунных взаимодействий в патогенезе PC, а также для поиска эффективных методов диагностики и лечения этого тяжелого заболевания.
Демиелинизирующие заболевания ЦНС типа рассеянного склероза (PC) характеризуются не только аутоиммунными процессами, но и сопровождаются метаболическими нарушениями в поврежденных участках мозга. Биохимические изменения отмечаются раньше неврологических проявлений и могут иметь значение для диагностики патологических процессов. Идея о метаболической природе демиелинизирующего процесса высказывалась еще Huszak в 50-е гг., когда было показано изменение липидного, углеводного и белкового обменов у больных PC. Позже были выявлены структурные изменения белков нервной ткани, нарушение азотистого обмена и активности протеолитических ферментов, а также изменение активности некоторых окислительно-восстановительных ферментов в митохондриях клеток головного и спинного мозга (Корин, Недзьведь, 1968). Однако эти изменения не всегда отражали процессы, происходящие в ЦНС.
С конца 80-х гг. в медицинских исследованиях стал использоваться метод магнитно-резонансной спектроскопии (МРС), позволяющий прижизненно оценить уровень различных метаболитов в мозге (Ринк, 1993). В последние годы с развитием протонной МРС ( МРС) возможности метода значительно расширились и позволяют судить об активности патологического процесса по изменению спектров метаболитов непосредственно в очагах (Поздняков и др., 2001). Основными определяемыми метаболитами являются:
1. N-ацетиласпартат (NAA) - маркер активности и жизнедеятельности нейронов (Birken & Oldendorf, 1989);
2. креатин (Сг) — маркер энергетического метаболизма, часто используется как внутренний стандарт для количественной оценки активности метаболизма (Leary et al., 1999);
Определение экспрессии мРНК цитокинов
Экспрессию мРНК ФНОа, ИЛ-1(3, ИЛ-10 и ИЛ-lp.a. в селезенках и спинном мозге животных определяли методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Забор материала проводили на 7 сутки после инокуляции гомогената мозга (латентный период), 14 сутки (пик заболевания у большинства животных), 33 сутки (фаза выздоровления у большинства животных). Животных декапитировали, в течение 3 минут выделяли поясничный отдел спинного мозга, немедленно замораживали материал в жидком азоте и хранили при температуре -70С до выделения мРНК.
Тотальную мРНК выделяли в соответствии со стандартным протоколом (43) с использованием гуанидина тиоционата ("Promega", США).
Для проведения обратной транскрипции использовали 1 мкл затравочных олиго-аТ-праймеров ("Promega", США), нуклеотидтрифосфаты (до конечной концентрации 1, 25 мМ каждого) ("Силекс М", Москва), 0,5 мкл ингибитора рибонуклеаз ("Promega", США), 1 мкл обратной транскриптазы М-MLV ("Promega", США). Пробу добавляли в объеме из расчета 2 мкг на реакцию. Общий объем реакционной смеси доводился до 20 мкл деионизиро-ванной водой.
Для проведения ПНР по 2 мкл продуктов ОТ-реакции добавляли в реакционную смесь, содержавшую: 2,5 мкл 10 кратного буфера, нуклеотидтрифосфаты до конечной концентрации в растворе 0,8 мМ каждого, специфический праймер (+) 25 пкМ, специфический праймер (—) 25 пкМ, 1 мкл Taq DNA полимеразы, MgCl2 - концентрацию подбирали для каждой пары прай-меров отдельно (см. табл. 1). Конечный объем доводился до 25 мкл деиони-зированной водой. ПЦР проводились в амплификаторе фирмы "Techne" (Великобритания) при термальном профиле: 94С/1 мин.; при температуре отжига/1 мин. (см. табл. 1 - подбиралась предварительно для каждой пары праймеров); при температуре +72 С/1,2 мин.
Специфические праймеры подбирались с помощью программы "Primer - Master 1.0" по нуклеотидным последовательностям соответствующих мРНК и ДНК крыс, полученным из Европейского молекулярного банка данных. Последовательности праймеров и условия проведения ПЦР (концентрация ионов магния и количество циклов проведения реакции) представлены в таб лице 1. В качестве внутреннего стандарта для оценки прохождения реакции обратной транскрипции использовали мРНК р-актина.
Анализ ПЦР-продуктов проводили с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием для визуализации мРНК. Фотографирование гелей производили цифровым фотоаппаратом «Canon» (Power Shot S30) в проходящем УФ-свете на трансиллюминаторе «Vilber Lourmat» (Франция).
В работе применяли статистические методы: вычисление средних величин, квадратичного отклонения, доверительных интервалов. Достоверность различий между средними величинами и относительными показателями определяли с помощью t-критерия Стьюдента.
Однократное подкожное введение гомогената гомологичного спинного мозга в ПАФ вызывало у крыс Вистар развитие монофазного ЭАЭ различной тяжести, которую оценивали по наличию клинических признаков. Наиболее частыми симптомами являлись; снижение мышечного тонуса, выраженные парезы и параличи конечностей и хвоста (Рис. 5). Кроме того, у части животных отмечались непроизвольное дрожание головы и тела (тремор) и нарушение функций тазовых органов.
Наблюдались определенные различия по уровню и тяжести заболевания между самцами (п=25) и самками (п=25): последние заболевали в 2,1 раза чаще (42,5% и 89,2%; соответственно), с более коротким латентным периодом (17,2±1,4 и 12, 3±2, 1 дней; соответственно) и более тяжелой симптоматикой (КИнаксималь1шй=1,4 и КИмикнмаяьный =3,6; соответственно). Поскольку у самок наблюдалась большая предрасположенность к индукции ЭАЭ и различная его тяжесть, все дальнейшие исследования проводились на самках.
Общая заболеваемость самок (по результатам 3 экспериментов) составила 91,3 %. Легкое течение заболевания (КИ = 0,5-3,0) наблюдалось у 47,1% крыс. Более тяжелые неврологические расстройства (КИ = 4}5-6,0) отмечались у 52,9% животных, из них у 14,8 % заболевание окончилось летально. Клинические симптомы ЭАЭ у крыс появлялись через 10,6+2,4 суток. Продолжительность заболевания зависела от тяжести: при легком течении — 5,2±2,3 суток; при тяжелом течении - 21,4±1,8 суток, после чего у большинства животных наступало полное или частичное спонтанное выздоровление. Следует отметить, что у 1-2% животных ЭАЭ приобретал хронический характер с постоянным прогрессированием заболевания, примерно у 1% животных наблюдалось ремштирующее течение с усилением и ослаблением клинических проявлений. Достоверных различий в тяжести заболевания у самок в зависимости от фазы эстрального цикла выявлено не было.
Прижизненное исследование метаболизма в мозге крыс с ЭАЭ
Типичные Н MP-спектры, полученные от нормального мозга крысы, включают N-ацетиласпартат - NAA (213,46 ррт), холин - Cho (44,93 ррт) и инозитол - Ins (71,15 ррт), креатин — Сг (76,47 ррт). Спектры липидов не регистрируются (Рис. 15).
+Н МРС исследование больных крыс выявило определенные различия в уровне метаболитов в мозге крыс с разной тяжестью заболевания. У легко болевшего (КИ=1) и выздоровевшего животного спектры метаболитов и их количество отличались от контрольных в меньшей степени, чем у животных с наличием клинических признаков (Рис. 16). Уровень всех метаболитов был снижен, особенно NAA, несмотря на то, что животные были уже здоровы (7 дней после исчезновения последних симптомов заболевания).
При наличии симптомов болезни в момент обследования изменения уровня метаболитов в мозге были более значительными.
У крысы с умеренной выраженность неврологических нарушений на пике заболевания (КИ=3) сильно падал уровень NAA — в 6 раз и Cho - в 19 раз, по сравнению с контрольными животными (Рис. 17). Кроме того, харак терной особенностью этого животного было появление в спектре пика липидов (Lip). Обращает внимание то, что уровень Сг хотя и был снижен (по сравнению с контрольными животными), в отличие от других больных крыс количество Сг возрастало с ослаблением проявлений болезни.
Самые существенные метаболические нарушения наблюдались у тяжело болевшего животного (КИ=5,5) с постоянным ухудшением состояния. NAA и Сг у этой крысы практически отсутствовали (NAA снижен в 21 раз; Сг - в 7,6 раза по сравнению с контрольными животными). Cho, напротив, регистрировался в значительном количестве и его уровень был повышен в 4,1 раза. Увеличение Cho сопровождалось появлением двойного пика липидов (60,50 ррт и 38,06 ррт) (Рис. 18).
Диаграмма на рисунке 19 показывает, что существует базовая продукция ИЛ-10 в крови, уровень которой не влияет на тяжесть заболевания и достоверно не отличается в разных группах животных. Так, количество ИЛ-10 в сыворотках крови до иммунизации у не заболевших животных и у животных с легкими клиническими проявлениями составило 478±30 и 502±21 пг/мл, соответственно. Аналогичные показатели - 556±10 пг/мл и 530±12 - выявлены у животных с умеренными и тяжелыми расстройствами. В процессе развития заболевания, однако, наблюдались различия в изменении уровня циркулирующего ИЛ-10 у тяжело и легко болевших животных. Крысы с незначительной и умеренной выраженностью неврологических нарушений (КИ=1 и КИ=2) имели двух волновую динамику ИЛ-10 в крови с максимумами на 14 (768±64 пг/мл) и 28 (802±72 пг/мл) сутки после индукции ЭАЭ. Эти сроки соответствовали началу клинических проявлений болезни и фазе выздоровления. Следует отметить, что повышение продукции ИЛ-10 у этих животных наблюдалось уже в индуктивную фазу (7 сутки). На 21 сутки уровень ИЛ-10 возвращался к базовым значениям. У тяжело болевших крыс (КИ=4,0) достоверного увеличения уровня ИЛ-10 в крови не отмечалось ни на одном из исследованных сроков.
Нами также исследовалась динамика уровня ИЛ-10 в спинно-мозговой жидкости крыс, однако содержание ИЛ-10 в ликворе оказалось ниже предела обнаружения, следовые количества цитокина были выявлены лишь у нескольких животных с различными неврологическими проявлениями и в разные периоды болезни, что не позволило оценить динамику уровня циркулирующего ИЛ-10 в ЦНС. При исследовании динамики циркулирующего ФНОа-подобного фактора у крыс выявлено, что сыворотки животных (взятые до введения энцефали-тогена) обладали неодинаковой цитотоксической активностью (Рис, 20). Анализ показателей активности циркулирующего ФНОа-подобного фактора до иммунизации показал, что у впоследствии заболевших животных его уровень был значительно выше, чем у не заболевших.
Среди животных с клиническими признаками ЭАЭ также наблюдались колебания значений уровня ФНОа-подобного фактора в группах крыс с разной выраженностью симптомов болезни. Незначительное снижение показателей цитотоксической активности ФНОа-подобного фактора отмечено уже на 7 сутки после индукции ЭАЭ в группах впоследствии не заболевших и животных с легкой и умеренной тяжестью заболевания. У тяжело заболевших в дальнейшем животных эти значения были достоверно выше. Обращает внимание, что именно у этих животных не наблюдалось повышения ИЛ-10 на этом сроке. На пике заболевания (14 сутки) происходило падение уровня ФНОа-подобного фактора во всех группах животных, однако у тяжело болевших крыс этот показатель почти в 2 раза превосходил значения, наблюдаемые в других группах, причем такое соотношение показателей сохранялось на всех последующих сроках.
В течение трех последующих недель существенных изменений в уровне ФНОа-подобного фактора не отмечено, однако на 42 сутки во всех группах болевших крыс концентрация ФНОа-подобного фактора несколько возросла.
Экспрессия мРНК цитокинов при развитии ЭАЭ
Анализ экспрессии мРНК цитокинов в клетках иммунной системы (селезенка) показал наличие высокой базовой продукции мРНК ИЛ-13 и ИЛ-1 р.а. у всех исследованных животных. Следует отметить, что уровень экспрессии мРНК ФНОа в селезенке интактных крыс был неодинаков, как и уровень циркулирующего в крови ФНОа-подобного фактора. У некоторых животных наблюдалась довольно интенсивная экспрессия мРНК ФНОа, тогда как у ряда крыс экспрессия мРНК ФНОа не определялась. В норме нам не удалось обнаружить экспрессии мРНК ИЛ-10. (Рис. 24.).
В противоположность наличию базовой экспрессии м РНК цитокинов в селезенке, при физиологических условиях в ЦНС крыс мы не обнаружили мРНК провоспалительных цитокинов (ИЛ-1(3 и ФНОа). Важно отметить, что при этом мРНК рецепторного антагониста ИЛ-1 выявлялась на высоком уровне в клетках спинного мозга интактных животных.
В процессе развития ЭАЭ экспрессия мРНК ИЛ-1р и ИЛ-1 р.а. у крыс в селезенке практически не изменялась и не отличалась от интактных животных на всех исследованных сроках (Рис. 24 и 25). Однако усиление экспрессии мРНК ФНОа уже в латентный период (7 сутки) мы наблюдали у всех крыс (Рис. 25). В дальнейшем экспрессия мРНК ФНОа сохранялась вплоть до 30 суток. У животных с разной выраженностью неврологических нарушений и без видимых клинических проявлений ЭАЭ в селезенке наблюдался сходный паттерн экспрессии мРНК ИЛ-13, ИЛ-1 р.а. и ФНОа. Кроме того, у отдельных животных (больных и не больных) на 14 сутки выявлялась экспрессия мРНК ИЛ-10. Следует отметить, что именно в этот период в крови легко болевших животных отмечался максимальный уровень этого цитокина.
В отличие от селезенки, в спинном мозге наблюдалось изменение экспрессии мРНК цитокинов в процессе развития ЭАЭ, кроме того, выявлены различные паттерны экспрессии мРНК цитокинов у крыс с разной тяжестью заболевания (Рис. 26).
Так, в латентный период (7 сутки) у всех инокулированных крыс, как и у интактных животных, определялась только экспрессия мРНК рецепторного антагониста ИЛ-1. Однако, накануне появления клинических симптомов экспрессия мРНК этого цитокина уже не выявлялась.
Нам не удалось обнаружить экспрессии мРНК ни одного из исследованных цитокинов на 14 сутки после индукции ЭАЭ у животных без клинических симптомов заболевания. Однако, у заболевших животных в этот период (пик заболевания) выявлялась экспрессия мРНК провоспалительных цитокинов, причем у животных с разной выраженностью клинических симптомов наблюдались особенности: у легко болевших животных отмечалась экспрессия одного из исследованных провоспалительных цитокинов (ФНОа или ИЛ-ір). Противовоспалительные цитокины у этих животных не выявлялись.
При тяжелом течении заболевания у крыс обнаруживалась мРНК обоих провоспалительных цитокинов (ФНОа и ИЛ-ір), кроме того, у этих крыс присутствовала мРНК ИЛ-1р.а.
На 33 сутки при полном выздоровлении у животных не наблюдалось экспрессии мРНК цитокинов, как и у неболевших животных (с индуцированным ЭАЭ). Однако при наличии клинических симптомов в этот период все еще отмечалась экспрессия провоспалительных цитокинов ФНОа или ИЛ-1р.
Характерно, что экспрессия мРНК ИЛ-10 появлялась только в фазу выздоровления животных, выявлялась закономерность: при наличии мРНК ИЛ-10 отсутствовала экспрессия мРНК ФНОа; при наличии мРНК ИЛ-1 р.а. не выявлялась экспрессия мРНК ИЛ-1(3. При этом, у животных с более легким течением ЭАЭ (КИмаксималь1[Ь1Й=4,5; КИ1И момент обследования-0)5) В ЦНС ВЫЯВЛЯЛЭСЬ экспрессия м РНК ИЛ-ір, тогда как более тяжелые неврологические нарушения (КИмаксималЬ1ШЙ=5,5; КИкамоме[!ТОбслеяова1ШЯ=1,5) наблюдались в присутствии экспрессии мРНК ФНОа.
Исследование экспрессии мРНК цитокинов в клетках иммунной системы (селезенка) и в ЦНС (спинной мозг) животных показало, что именно ци-токины, образовавшиеся в мозговом компартменте, вовлечены в развитие неврологических нарушений у животных при ЭАЭ.
Курсовое (15 дней) в/б введение амантадина (20 мг/кг) крысам без индуцированного ЭАЭ не влияло на экспрессию мРНК цитокинов, Практически у всех крыс этой группы как в селезенке, так и в спинном мозге паттерн экспрессии мРНК ФНОа, ИЛ-1р\ ИЛ-lp.a. был аналогичен наблюдаемому у ин-тактных крыс: в селезенке присутствовала экспрессия мРНК всех цитокинов, в спинном мозге - только мРНК ИЛ-1 р.а. (Рис. 24 и 27). Т.е., препарат не изменял паттерн экспрессии цитокинов в физиологических условиях.
