Содержание к диссертации
СОДЕРЖАНИЕ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Аутоиммунный нейродегенеративный процесс и его моделирование на животных 12
1.1.1. Патогенетические механизмы аутоиммунного неиродегенеративного процесса на примере PC и ЭАЭ 13
1.1.2. Разработка новых подходов к лечению аутоиммунной нейродегенеративной патологии 18
1.2. Кальпаиновая система внутриклеточных протеаз 23
1.2.1. Структура кальпаинов 23
1.2.2. Тканевая локализация кальпаинов 25
1.2.3.Регуляция активности кальпаинов 27
1.2.4. Физиологические функции кальпаиновой системы 31
1.2.5.Участие кальпаиновой системы в патологических процессах 40
1.3. БЕЛОК GAP-43 (Growth Associated Protein-43) 47
1.3.1.Структурные и биохимические свойства белка GAP-43 47
1.3.2.Физиологическая роль белка GAP-43 52
1.3.3.Участие белка GAP-43 в патологических процессах 56
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 62
2.1. Животные 62
2.2. Индукция ЭАЭ 62
2.3. Оценка клинического течения заболевания 62
2.4. Препарат 63
2.5. Забор материала 63
2.6. Выделение тотальной мРПК 64
2.7. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) 65
2.8. Электрофорез РНК и ДНК в агарозном геле 66
2.9. Экстракция белка GAP-43 67
2.10. Измерение концентрации белка 67
2.11. Одномерный электрофорез белков в полиакриламидном геле в системе уксусная кислота/мочевина 68
2.12. Окраска белков в ПААГ 69 х
2.13. Препаративный электрофорез белков 69
2.14. Иммуноблоттинг белков 70
2.15. Иммуноферментный анализ 71
2.16. Определение активности кальпаинов 72
2.17. Методы математической статистики 73
2.18. Используемые реактивы 73
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 74
3.1. Характеристика развития ЭАЭ 74
3.2. Экспрессия мРНК и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС в индуктивную фазу ЭАЭ 78
3.3. Экспрессия мРНК и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС животных с различной тяжестью течения ЭАЭ 93
3.4. Влияние интраназального введения низких доз ингибитора кальпаина 1 на выраженность ЭАЭ 108
3.5. Экспрессия мРНК GAP-43, распределение белка GAP-43 и его фрагмента GAP-43-3
в клетках ЦНС в процессе развития ЭАЭ при различной тяжести течения болезни 114
3.6. Белок GAP-43 в СМЖ крыс с различной тяжестью течения ЭАЭ 140
Заключение 145
4. ВЫВОДЫ 153
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Ограниченный протеолиз белков и пептидов в живых тканях и клетках является особой формой физиологической регуляции и считается универсальным механизмом, ответственным за образование и модификацию ферментов. Реакции ограниченного протеолиза лежат в основе функционирования важнейших физиологических систем, в частности, ренин-ангиотензиновой, калликреин-кининовой, иммунитета, гемостаза, комплемента, апоптоза, регуляции экспрессии генов (Соловьева и др., 1995). Поэтому для понимания принципов регуляции физиологических систем необходимо детальное изучение внутриклеточных регуляторных протеаз и тех реакций, которые они катализируют.
Среди внутриклеточных протеолитических систем особого внимания заслуживают те из них, которые активируются в ответ на увеличение в клетке концентрации ионов кальция - ключевого посредника множества клеточных реакций. Однако при развитии ряда патологических процессов существует опасность чрезмерной активации кальций-зависимых протеолитических систем вследствие нарушения гомеостаза ионов кальция, вызванного, в частности, экзайтотоксическим действием глутамата, аномально высокой проводимостью кальциевых каналов (Lajtha, Banik, 2002). С этой точки зрения особый интерес вызывает Са -зависимая кальпаиновая система внутриклеточных протеаз, гиперактивация которой приводит к нарушению регуляции многих физиологических функций организма (Goll et al., 2003). Так, гиперактивация кальпаинов, наблюдаемая в клетках ЦНС при развитии ряда нейродегенеративных заболеваний, способствует накоплению в клетке неупорядоченных нейрофибрилл и Р" амилоидных бляшек, а также вызывает запуск процесса апоптоза (Goll et al., 2003). В единичных научных работах показано изменение уровня экспрессии компонентов кальпаиновой системы в post mortem образцах тканей пациентов с рассеянным склерозом (наиболее распространенное и социально значимое нейродегенеративное заболевание аутоиммунного генеза) (Banik N. et al., 1999а). Однако роль кальпаиновой системы в условиях развития данного патологического процесса до сих пор не установлена. Гиперактивация кальпаинов при развитии рассеянного склероза может иметь значение на всех этапах патогенеза: от регуляции миграции активированных Т-лимфоцитов и расщепления белков миелина до активации проапоптотических ферментов. Действительно, расщепление кальпаином основного белка миелина, белка нейрофиламентов может стимулировать образование энцефалитогенных пептидов; расщепление прокаспаз до каспаз способствует запуску апоптотических каскадов; расщепление белков клеточной адгезии увеличивает миграционную способность клетки (Goll et al., 2003). Кроме этого, выявление новых субстратов кальпаина расширяет представление о функциональной роли кальпаиновой системы. Так, недавно было показано, что нейроспецифический белок GAP-43 (growth associated protein) является субстратом кальпаина (Захаров с соавт., 2005). Поскольку белок GAP-43 известен как маркер конусов роста, пластических и регенеративных процессов, протекающих в нервной ткани (Oestreicher et al., 1997), весьма вероятно, что протеолитическое расщепление белка GAP-43 кальпаином может, существенно изменяя его свойства, подавить регенеративную способность клеток ЦНС.
Поскольку спектр возможных исследований на пациентах с рассеянным склерозом достаточно узок, очевидна перспектива исследования вовлечения кальпаиновой системы в нейродегенеративные процессы аутоиммунного генеза на модели данной патологии у лабораторных животных. Действительно, модель на лабораторных животных обладает тем преимуществом, что за относительно короткое время воспроизводит различные стадии развития болезни и позволяет уточнить механизмы н
формирования патологии данного типа, а также выявить новые мишени для фармакологического воздействия с целью эффективного лечения нейродегенеративных заболеваний аутоиммунного генеза.
Наиболее адекватной моделью рассеянного склероза считается экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) (для обзора Gold et al., 2006). Многочисленные исследования показали, что основные механизмы поражения ЦНС в экспериментальных моделях аутоиммунного энцефаломиелита, сходны с таковыми у пациентов с рассеянным склерозом (Smith et al., 1999 и мн. др.). У животных с индуцированным ЭАЭ, как и у людей при рассеянном склерозе, наблюдается аутоиммунный ответ на компоненты миелина, приводящий к демиелинизации, а затем и к дегенерации аксонов и, в итоге, к гибели нервных клеток; проявляется патологическая цепь событий с развитием парезов, параличей и другими симптомами болезни. Интересно, что у некоторых видов лабораторных грызунов наступает супрессия патологических процессов и регенерация поврежденных тканей даже при повреждении обширных областей ЦНС. У таких животных неврологические и двигательные нарушения сглаживаются, и наступает частичное или полное выздоровление, после которого животные резистентны к повторной индукции ЭАЭ (Gold et al., 2006). К сожалению, молекулярные механизмы, лежащие в основе спонтанного выздоровления животных, остаются практически неизученными. В этом отношении экспериментальное исследование протеолитического расщепления белка GAP-43 кальпаином позволит выявить новые аспекты регуляции регенераторной способности клеток ЦНС в условиях развития патологии данного типа.
Цели и задачи исследования.
Цель работы: показать включение кальпаиновой системы клеток ЦНС и иммунной системы в развитие аутоиммунных нейродегенеративных процессов на модели ЭАЭ у крыс. Задачи исследования были сформулированы следующим образом:
1. Определить уровень экспрессии компонентов кальпаиновой системы и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС в индуктивную фазу ЭАЭ.
2. Определить уровень экспрессии компонентов кальпаиновой системы и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках различных отделов ЦНС на пике развития ЭАЭ. Сопоставить полученные данные с тяжестью клинического течения ЭАЭ.
3. Исследовать действие ингибитора кальпаина I на выраженность клинических проявлений ЭАЭ.
4. Определить уровень экспрессии мРНК GAP-43, а также изучить распределение белка GAP-43 и его протеолитического фрагмента в клетках спинного мозга на пике развития ЭАЭ. Сопоставить полученные данные с тяжестью клинического течения ЭАЭ.
5. Определить уровень белка GAP-43 в ликворе крыс в процессе развития ЭАЭ при различной тяжести течения болезни.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Кальпаиновая система клеток ЦНС и иммунной системы вовлечена в процесс формирования и развития нейродегенеративной патологии аутоиммунного генеза.
2. Увеличение уровня белка GAP-43 в ликворе крыс с ЭАЭ и увеличение степени его протеолиза кальпаином в клетках ЦНС отражает тяжесть течения заболевания, что может служить диагностическим и/или прогностическим критерием развития и интенсивности аутоиммунного нейродегенеративного процесса.
3. Подавление активности кальпаинов с помощью специфических ингибиторов является перспективным направлением для разработки новых подходов в лечении аутоиммунных нейродегенеративных заболеваний.
• Научная новизна работы.
В проведенном исследовании впервые получены данные о включении кальпаинрври системы клеток лимфатических узлов брыжейки и верхних отделов спинного мозга в процесс формирования и развития нейродегенеративнрй патологии аутоиммунного генеза. Выявлено, что распространенность гиперактивации и сверхэкспрессии т-кальпаина по различным отделам спинного мозга крыс связана с тяжестью течения ЭАЭ. Впервые показано увеличение уровня экспрессии мРНК кальпастатина и нейроспецифического белка GAP-43 в клетках различных отделов спинного мозга крыс с бессимптомным и легким течением ЭАЭ, а также обнаружено увеличение степени протерлитическогр расщепления белка GAP-43 кальпаином в клетках различных отделов спинного мозга крыс с тяжелой формой ЭАЭ. Установлено увеличение содержания белка GAP-43 и его протеолитических фрагментов в ликврре крыс с симптомами ЭАЭ на пике заболевания. Впервые продемонстрировано, что подавление активности кальпаинов с помощью интраназального введения низких доз ингибитора кальпаина I предотвращает развитие или снижает выраженность ЭАЭ.
Научно-практическое значение полученных результатов.
Выявленное в данном исследовании включение кальпаинрври системы клеток ЦНС и иммунной системы в развитие ЭАЭ у крыс углубляет представление о физиологических функциях кальпаинов и раскрывает ряд неизвестных ранее звеньев механизма формирования аутоиммунных нейродегенеративных процессов.
Предотвращение развития или снижение выраженности ЭАЭ У крыс в результате подавления активности кальпаинов с помощью ингибитора кальпаина I указывает на возможность использования препаратов на основе ингибиторов кальпаина для лечения аутоиммунных нейродегенеративных заболеваний и других форм патологии ЦНС, связанных с деструкцией нервных клеток. Данные о протеолизе белка GAP-43 под действием кальпаина существенно расширяют и дополняют сложившиеся к настоящему времени представления о механизмах функционирования белка GAP-43 в условиях развития нейродегенеративного процесса. На основе полученных данных об изменении уровня белка GAP-43 и его протеолитических фрагментов в ликворе могут быть разработаны новые подходы для диагностики и прогнозирования течения аутоиммунного нейродегенеративного процесса в клинике.
Личный вклад соискателя.
Соискатель проанализировал литературу по теме исследования, осуществил планирование экспериментов и получил основную часть результатов, которые представил в докладах на конференциях и в статьях. Экспериментальная часть исследования полностью выполнена на базе Физиологического Отдела им. И.П. Павлова ГУ НИИЭМ РАМН. Индукция ЭАЭ и оценка клинического течения заболевания проводилась совместно с к.б.н. И.Н. Абдурасуловой (Физиологический Отдел им. И.П. Павлова ГУ НИИЭМ РАМН) и к.м.н. Ю.Л. Житнухиным (Отдел Иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН).
