Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
1. Механизмы эндокринных и свободнорадикальных процессов прихолодовом воздействии 10
1.1. Холод как стресс-индуцирующий фактор 10
1.1.1. Ретроспектива исследований холодовой адаптации животных и человека 10
1.1.2. Современное представление о механизмах воздействия низких температур на животных и человека 12
1.1.3. Холодовый стресс и антиоксидантная система организма 14
1.2. НеЙроэндокринные механизмы реализации ранних этапов стрессорного
ответа на холодовое воздействие 18
2. Тканеспецифические особенности процесса перекисного окисления липидов и антиокислительной защиты 22
2.1. Общая характеристика перекисного окисления липидов .22
2.2. Характеристика антиоксидантной системы организма 23
2.3. Антиокислительная система тканей 25
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 31
ГЛАВА III. Динамика изменения показателей перекисного окисления липидов у неполовозрелых крыс при воздействии холодом 40
3.1. Определение поведенческих реакций 40
3.2. Динамика перекисного гемолиза эритроцитов у неполовозрелых крыс 43
3.3. Динамика промежуточных продуктов перекисного окисления липидов у неполовозрелых животных 43
3.4. Динамика уровня малонового диальдегида в печени и мозге неполовозрелых животных 50
3.5. Исследование динамики активации ферментативных антиоксидантов при холодовом воздействии у неполовозрелых животных 57
ГЛАВА IV. Динамика изменения показателей перекисного окисления липидов у половозрелых крыс при воздействии холодом 60
4.1. Определение поведенческих реакций половозрелых животных 60
4.2. Динамика перекисного гемолиза эритроцитов половозрелых крыс 64
4.3. Динамика промежуточных продуктов перекисного окисления липидов у половозрелых животных 64
4.4. Динамика уровня малонового диальдегида в печени и мозге взрослых животных... 71
4.5. Исследование динамики активации ферментативных антиоксидантов в период холодового воздействия половозрелых животных 78
ГЛАВА V. Обсуждение результатов 82
Выводы 93
Библиографический список 94
Приложения 118
- Ретроспектива исследований холодовой адаптации животных и человека
- Характеристика антиоксидантной системы организма
- Динамика промежуточных продуктов перекисного окисления липидов у неполовозрелых животных
- Динамика промежуточных продуктов перекисного окисления липидов у половозрелых животных
Введение к работе
Актуальность темы. Современные технические устройства и технологии все более эффективно устраняют отрицательное воздействие на человека природных, производственных и бытовых факторов. Однако переохлаждение организма и формирование его устойчивости к холоду остается практически значимой проблемой физиологии и медицины.
На выявление изменений физиологических систем организма животных и исследование его приспособления к длительному действию холода (часы, дни) направлено внимание многих отечественных и зарубежных ученых (Дорошенко Г.К., 1995; Колосова Н.Г., 1999; Гасангаджиева А.Г., 1997; Селятицкая В.Г., 1996, Кондратенко Е.И., 2004).
Установлено, что воздействие холодом сопровождается активацией окислительных процессов, что является важнейшим признаком биохимической терморегуляции у теплокровных животных (Соколовский В.В., 1988). Это вызывает усиление свободнорадикальных процессов (Эмирбеков Э.З., Львова СП., 1985; Соколовский В.В., 1988; Дорошенко Г.К., 1995), что инициирует повреждающее действие низкой температуры. Действию свободных радикалов кислорода препятствует антиоксидантная система (АОС), которая обеспечивает связывание и модификацию активных кислородных метаболитов (Соколовский В.В., 1988; Подберезкина М.Б., Осинская Л.Ф., 1989; Дубина Е.Е., 1992).
Кратковременные воздействия низких температур (продолжительностью до 1,5 часов) встречаются довольно часто как в повседневных, так и в экспериментальных ситуациях. Начальное звено адаптации организма животных к холоду в этих ситуациях не исследовалось. Свободнорадикальное окисление и различные звенья антиоксидантной системы организма на раннем этапе холодового воздействия являются малоизученными.
Результаты холодового воздействия на организм зависят от возраста индивидуума и обусловлены метаболическими возможностями различный тканей.
Виды этих зависимостей до сих пор не являлись предметом экспериментальных исследований.
Таким образом, проблема изучения возрастных и тканеспецифических особенностей свободнорадикальных процессов и антиоксидантной системы животных на раннем этапе холодового воздействия является актуальной.
Цель исследования - изучить динамику ранних изменений свободнорадикальных процессов и различных звеньев антиоксидантной системы, их тка-неспецифические особенности у неполовозрелых и взрослых самцов крыс при остром холодовом воздействии.
Для достижения намеченной цели нами были поставлены следующие задачи:
Изучить изменение параметров ориентировочно-исследовательского поведения у половозрелых и неполовозрелых самцов белых крыс в динамике холодового воздействия.
Определить динамику накопления промежуточных продуктов пере-кисного окисления липидов в крови и разных отделах мозга в условиях непродолжительного холодового воздействия.
Исследовать тканеспепифические особенности и динамику накопления малонового диальдегида у неполовозрелых и взрослых самцов крыс при кратковременном охлаждении.
Дать оценку изменения активности ферментативного звена антиоксидантной системы в процессе развертывания ответной реакции организма на хо-лодовое воздействие в зависимости от возраста животных.
Сопоставить результаты исследования процессов ПОЛ и механизмов антиоксидантной защиты в динамике кратковременного охлаждения у неполовозрелых и взрослых самцов крыс.
Научная новизна
Впервые исследована динамика ответа организма на холодовое воздействие в течение 15-90 минут. Показано, что время ответной реакции организма животных на холод зависит от типа исследуемой ткани и возраста животного.
Получены данные об особенностях ранней динамики ориентировочно-исследовательского поведения при воздействии холодом.
Выявлены тканеспецифические особенности процессов свободноради-кального окисления при холодовом воздействии. Установлено, что мозг быстрее реагирует на изучаемое воздействие, чем печень.
Установлены возрастные различия в изменении показателей свободнора-дикальных процессов при непродолжительном воздействии холодом, которые проявились в динамике изучаемых показателей: половозрелые животные реагировали уменьшением уровня промежуточных продуктов перекисного окисления липидов, а неполовозрелые —увеличением.
Выявлена динамика ответной реакции звеньев ферментативной антиок-сидантной системы, реагирующей на экспериментальное воздействие и показателей свободнорадикального окисления при действии холода.
Основные положения, выносимые на защиту
Реакция организма на холодовое воздействие проявляется уже в интервале 15-90 минут и выражается в согласованном изменении интенсивности свободнорадикального окисления и ферментативного звена антиоксидантной системы крыс.
Адаптационные механизмы, включающиеся на ранних этапах воздействия холодом, имеют черты тканеспецифичности.
Ответная реакция крыс при кратковременном воздействии холодом зависит от возраста животного, отличается динамикой накопления продуктов ПОЛ и временем активации различных ферментов антиоксидантной системы организма.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты исследования демонстрируют наличие возрастных и тканес-пецифических различий при кратковременном воздействии холодом. Полученные результаты расширяют представление о механизмах ранней реакции анти-оксидантной системы на стресс-индуцирующее воздействие.
Возрастные различия в чувствительности антиоксидантной системы и динамике накопления продуктов ПОЛ служат основанием для рекомендации дифференцированного подхода к группам лиц разного возраста в создании оздоровительных методик, анализа результатов повреждающего действия холода в эксперименте и в клинической практике.
Материалы диссертационного исследования включены в курсы лекций физиологии человека и животных при обучении студентов-биологов университетов.
Апробация работы
Результаты исследования доложены и обсуждены на V и VI Всероссийских научных конференциях «Эколого-биологические проблемы Волжского региона» (Астрахань, 2002, 2004), на итоговых научных конференциях студентов, аспирантов и преподавателей Астраханского государственного университета (Астрахань 1998, 2003), на 3-й и 4-й международных конференциях молодых ученых и студентов (Самара 2002, 2003), в материалах 1-й и 2-й Международной практической конференции «Животные в антропогенном ландшафте» (Астрахань 2003, 2004), на XI Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2003), на Всероссийской конференции с международным участием «Нейроэндокринология-2003» (Санкт-Петербург, 2003), на научно-практической конференции с международным участием для молодых учёных «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Москва-Астрахань 2004), на 8 th Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry «Stress and Be- havior» (St. Petersburg, 2004). По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, выводов. Общий объем диссертации - 139 страница, 59 таблиц и 37 рисунков. Библиографический список включает 223 источника, из них 65 - иностранных.
Ретроспектива исследований холодовой адаптации животных и человека
Температура является одним из основных факторов окружающей среды, воздействующих на живые организмы. Физиологические исследования, проводимые в настоящее время в этом направлении, основаны на понимании взаимосвязи мембранных механизмов терморегуляции и участия в них процесса пере-кисного окислении липидов.
Данные о состоянии ПОЛ при действии холода на организм противоречивы. Во множестве работ утверждалось, что в крови людей, попадающих в условия холодного климата, резко возрастает содержание продуктов ПОЛ (Казначеев В.П, 1980; Авицин А.П. и соавт., 1985; Куликов В.Ю. и соавт., 1988; Лу-ценко М.Т. и соавт., 1989). Однако эти ранние работы и методы исследования, используемые авторами, не всегда позволяли оценить состояние процессов ПОЛ. В то же время при исследовании ПОЛ у разных групп пришлого населения Азиатского Севера с полярным стажем от 10 дней до 10 лет было установлено, что напряжение процессов адаптации у северян далеко не всегда сопровождалось увеличением содержания продуктов ПОЛ в крови (Панин Л.Е., Колосова Н.Г, 1995). Значительно чаще выявлялась повышенная окисляемость липидов эритроцитов при инициировании in vitro аскорбатзависимого ПОЛ, Даже в исключительно экстремальных условиях лыжного перехода по дрейфующим льдам Северного Ледовитого океана в условиях полярной ночи у участников экспедиции в сыворотке крови содержание продуктов ПОЛ не возрастало более, чем на 25-28 %, как и Москве под влиянием холода и физической нагрузки (Панин Н.Е., Колосова Н.Г., 1988).
Более определённо утверждать о возможности активации ПОЛ в организме при действии низких температур позволяют результаты экспериментов, вьтолненных на животных (Куликов В.Ю. и соав., 1988; Sekhar L.M. et al, 1990). Действие холода (-25-27С) на кроликов в течение месяца по 4 часа ежедневно сопровождалось увеличением содержания диеновых коньюгатов в сыворотке крови и мембранах эритроцитов и увеличением окисляемости липидов сыворотки и эритроцитов, оцениваемой по накоплению диеновых конъюгатов при инициировании ПОЛ в условиях in vitro по отношению к интактным животным. Изменения выявляются уже через несколько дней холодового воздействия и после четырёх недель были выражены сильнее, нежели после двух недель. При этом в эритроцитах, с одной стороны, увеличивается содержание токоферола и повышается активность глутатионредуктазы, с другой - снижается активность каталазы и уменьшается содержание восстановленного глутатиона. С последним коррелирует накопление метогемоглобина (Куликов Ю.В. и со-авт., 1988).
Увеличение содержания диеновых конъюгатов и флуоресцирующих продуктов ПОЛ при действии холода на кроликов характерно также для легких и печени. При этом в легких возрастает содержание токоферола, но снижается общая антиокислительная активность липидов сурфактанта, а в печени содержание токоферола уменьшается. Введение животным токоферола на фоне прерывистого действия холода, по данным авторов, предотвращает активацию ПОЛ (Куликов Ю.В. и соавт., 1988). В другой серии экспериментов, выполненных этими же авторами, изучалось влияние постоянного охлаждения (-7С) крыс в течение 8 суток, по данным измерения ректальной температуры, на реакции ПОЛ в микросомах печени. Подобная модель эксперимента не сопровождалась развитием гипотермии, но к окончанию эксперимента более половины животных погибало, по мнению авторов, в результате затянувшегося стресса, в то время как ежедневное введение животным антиоксидантов (токоферол, аскорбиновая кислота и метионин) предотвращало активацию ПОЛ.
С этим выводом согласуются и результаты исследования индийских авторов, изучавших влияние непрерывного воздействия холода (О—15С) и тепла (+39С) на ПОЛ в микросомах печени крыс по отношению к животным, содержащимся при 22-25С (Sekhar L.M. at al, 1990).
Тем не менее, далеко не все результаты исследований влияния действия низких температур на животных однозначно свидетельствуют об активации ПОЛ в этих условиях и накоплении в тканях его продуктов. Так, при исследовании кратковременного действия холода на крыс содержание продуктов ПОЛ возрастает в ткани мозга, но снижается в печени (Lomakina L.V., 1980).
Таким образом, имеющиеся в литературе сведения свидетельствуют о возможности активации процессов свободнорадикального окисления у гомойотермних организмов при холодовом воздействии в результате общей интенсификации окислительных процессов, направленной на поддержание температурного гомеостаза (Куликов В.Ю. и соавт., 1988; Панин Л.Е., Колосова Н.Г., 1995; Seckharetal., 1990).
На современном этапе представления о холоде как о стресс-индуцирующем факторе основаны на понимании взаимосвязи мембранных механизмов терморегуляции и участия в них процесса перекисного окислении ли-пидов. Биологические мембраны теплокровных, в нормальных условиях не встречающиеся с температурными сдвигами, реагируют на снижение температуры, так же как и клетки пойкилотермов, повышением непредельности липи-дов мембран (Крепе Е.М., 1981; Kuroshima A. et al., 1986). Такие изменения на фоне происходящей на холоде интенсификации окислительных процессов и связанного с этим усиления генерации активированных форм кислорода (АФК: 02, H202, НО, NO) существенно повышают вероятность активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Куликов В.Ю. и соавт., 1988, Cannio R. Et al, 2000). Активации ПОЛ на сегодня отводится роль одного из фундаментальных молекулярных механизмов патогенеза (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Меерсон Ф.З., 1981; Kretzschmar М.; Muller D, 1993). Ее рассматривают как неизменный атрибут и основное патогенетическое звено стресса, а продукты ПОЛ - как его корреляты (Kovacs P. et al, 1996) и даже первичные медиаторы (Baraboi V.A. и соавт., 1989). Нормализацию уровня продуктов ПОЛ активно используют в качестве необходимого и достаточного критерия эффективности адаптивных преобразований (Эмирбеков Э.З. и соавт., 1985). Вместе с тем на капливается все больше фактов, свидетельствующих о том, что увеличение продуктов ПОЛ не всегда отражает развитие деструктивных изменений, так же как и слабая активация ПОЛ не всегда свидетельствует о защищенности мем бранных структур (Сазонова Т.Г., Архипенко Ю.В., 1997). ПОЛ является одним из естественных механизмов модификации липид-ного состава клеточных мембран организма (Бурлакова Е.Б., 1990). Постулирован свободнорадикальный механизм регуляции клеточного метаболизма мембранами, согласно которому в систему регуляции ПОЛ входят такие важнейшие свойства биологических мембран, как жирнокислотный состав, вязкость липидов, проницаемость, трансмембранные потенциалы (Бурлакова Е.Б., 1990) - параметры, составляющие основу адаптивных перестроек на холоде. Изме няя их, ПОЛ опосредованно участвует в регуляции функций мембран: активно сти мембраносвязанных ферментов, состояния рецепторного аппарата клетки.
Характеристика антиоксидантной системы организма
Активации ПОЛ в физиологических условиях препятствует мощная антиоксидантная система тканей (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Бурлакова Е.Б. и соавт., 1990). Под термином «антиоксидант» в широком смысле слова принято понимать вещество, способное в низких концентрациях по отношению к окисляемому субстрату блокировать или существенно ингибировать окисление этого субстрата (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Бурла-кова Е.Б. и соавт., 1975). Антиоксиданти влияют на разные стадии процесса пе-рекисного окисления лилидов и проявляют свое действие посредством различных механизмов, к числу которых можно отнести следующие. 1. Снижение локальной концентрации кислорода. 2. Предупреждение инициирования перекисного окисления, улавливание радикалов, способных оторвать атомы водорода от жирокислотной цепи (например: гидроксильный радикал ОН ) 3. Улавливание и тушение синглетного кислорода, взаимодействующего непосредственно с липидом и образованием пероксидов. 4. Связывание ионов металлов переменной валентности, выступающих в роли центров радикалобразования и участвующих в разложении липид-ных перекисей. 5. Превращение перекиси липидов в продукты нерадикальной природы, например, в спирты. 6. Обрывание цепи перекисного окисления и взаимодействие с радикалами, способствующими росту цепей, например, с пероксидным радикалом. Тем самым, антиоксиданты блокируют обрыв новых атомов водорода от жир-нокислотных цепей. Вещества, обладающие подобным действием, называют истинными антиоксидантами или антиоксидантами в узком смысле этого слова. К ним относятся фенольные антиоксиданты, и в первую очередь токоферолы.
Зачастую многие антиоксиданты обладают несколькими механизмами антиоксидантного действия. К сказанному выше следует добавить, что клетка располагает механизмами «залечивания повреждений», вызванных свободнора-дикальным окислением. Так, окисленные жирокислотные цепи липидов отщепляются липазами и удаляются, что сопровождается уменьшением степени окислености оставшегося интактного липида (Каган В.Е. и соавт., 1977, 1984). Окислительно модифицированные макромолекулы «вырезаются» протеазами и нуклеазами (Davies K.J.A., Goldberg A.L., 1987).
Антиокислительная система тканей представлена различными факторами, как внутриклеточными - ферментами супероксиддисмутазой, каталазой, пероксидазами, глутатионредуктазой и восстановленным глутатионом, глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназой, так и внеклеточными - белком переносчиком железа — трансферрином и другими белками сыворотки, способными связывать ионы железа, церулопазмином, гаптоглобином, гемопексином, а также низкомолекулярными компонентами - альфа-токоферолом и аскорбиновой кислотой.
Общая сумма биоантиоксидантов создает в тканях «буферную антиоксидантную систему», обладающую определённой емкостью. Отмечено (Goroshinskaia I.A. и соавт., 1987; Соколовский В.В., 1988; Биленко М.В., 1989; Дубина Е.Е, и соавт., 1992), что у многоклеточных животных имеются тканевые отличия в степени развития этой системы, тоесть разные ткани имеют неодинаковую антиокислительную «емкость». Соотношение прооксидантных и антиок-сидантных систем в тканях определяет так называемый «антиоксидантный статус организма» (Соколовский В.В., 1988).
Супероксиддисмутаза и каталаза - важнейшие компоненты АОС всех клеток организма (Fried R. et al 1975; Brawn. К., and Fridovich, I., 1980). Супероксиддисмутаза обеспечивает превращение 02 в менее активный окислитель -Н202, каталаза - разрушает Н202 (Воскресенский О.Н. и соавт., 1982; Соколовский В.В., 1988; Кулинский В.И., Колесниченко Л.С, 1990; Болдырев А.А., 1995; Еремин А.Н. и соавт., 1997).
Ключевым ферментом АОС является СОД. Структурные свойства СОД были описаны ещё в 1938 г. известными биохимиками Кейлиным и Манном. Через 30 лет после этого открытия И. Фидорович и М.И. Мак-Корд показали, что основное свойство данного фермента - улавливание и обезвреживание 02". СОД осуществляет в клетках аэробных организмов уникальную функцию регуляции уровня супероксидных анион-радикалов. СОД принадлежит важная роль в поддрежании определённого уровня свободнорадикального окисления фос-фолипидов мембран - одного из важнейших условий клеточного гомеостаза (Дубина Е.Е., 1989; Подберезкина М.Б., Осинская Л.Ф., 1989).
Активность СОД связана с интенсивностью ПОЛ (Подберезкина М.Б., Осинская Л.Ф., 1989; Сосновский А.С. и соавт., 1993). Накопление токсичных перексидньгх продуктов (перекисей жирных кислот альдегидов, кетонов и др.) вызывает подавление СОД и других антиоксидантных ферментов (каталазы, глутатионперексидазы и глутатионредуктазы) (Дудник Д.Б. и соавт., 1981; Лан-кин В.З. и соавт., 1981). Снижение активности СОД и других ферментов-антиоксидантов может привести к увеличению содержания перекисей липидов, которое не всегда возращается к исходному уровню несмотря на нормализацию уровня СОД и антиоксидантов (Конвай В.Д. и соавт., 1982).
СОД является единственным среди известных ферментов, непосредственно обеспечивающим обрыв цепей кислородзависимых реакций в клетках аэробных организмов. СОД осуществляет рекомбинацию радикалов 02 с образованием перекиси водорода и триплетного кислорода:
Существует несколько изо ферментных форм СОД с широким диапазоном действия рН фермента - от 4,8 до 10,2. Это свидетельствует о его важной роли у аэробных организмов (Дубинина Е.Е., 1989; Поберёзкина М.Б., Осинская Л.Ф., 1989). Медь-цинковая форма СОД (Си, Zn-СОД), чувствительная к цианиду, локализована, в основном, в цитозоле, в межмембранном пространстве митохондрий эукариот (Подберезкина М.Б., Осинская Л.Ф., 1989; Зенков Н.К., Меньшикова Н.Б., 1993). Марганцевая форма СОД (Мп-СОД), цианидрези-стентная, содержится в митохондриях и бактериях (Воскресенский О.Н. и соавт., 1982; Подберезкина М.Б., Осинская Л.Ф., 1989; Зенков Н.К., Меньшикова Н.Б., 1993). Существует также железосодержащая СОД (Fe-СОД), которая обнаружена у микроорганизмов.
Динамика промежуточных продуктов перекисного окисления липидов у неполовозрелых животных
Возможно, увеличение латентного периода первого перемещения как показателя активности животного может говорить о усилении страха и тревожности (Кремневская СИ. и соавт., 1991; Буреш Я.И. и соавт., 1991).
Центральные и периферические стойки без опоры на бортик, которые характеризуют вертикальную двигательную активность (Кремневская СИ. и соавт., 1991) как у взрослых, так и у неполовозрелых животных повышались. Различия этого увеличения обнаружены в показателе — сила влиянии холодового фактора. У неполовозрелых животных сила влияния составила 26 % по показателю центральных стоек и 12 % по периферическим стойкам. Аналогичные показатели у взрослых животных составили 1 % и 12 % соответственно. Средняя масса взрослых животных - 155 грамм, а неполовозрелых - 67 грамм. Так как животные содержались в одинаковых условиях (+4С), молодые животные» имеющие меньший вес и, как следствие, меньшую возможность к самосогреванию (Гасангаджиева А.Г., 1997; Магомедова Н.Г., 2004), были более подвержены воздействию холода, что подтверждают другие исследователи (Доровский В.А. и соавт., 2001; Гусейнов ПО., Нагиев Э.Р., 2001).
Необходимо отметить, что посещение центральных квадратов как показатель локомоторной активности стрессируемых животных (Буреш ЯМ. и соавт., 1991) у группы половозрелых крыс имеет тенденцию к увеличению, в то время как у молодых животных наблюдается обратная тенденция, количество посещений уменьшается, возможно, это связано с разным уровнем стрессировано-сти животных и возможности к самосогреванию.
Интересно, что в случае половозрелых животных на всем протяжении воздействия холодового фактора наблюдается устойчивый, достоверный рост числа вертикальных стоек в периферических квадратах открытого поля, что может говорить об усилении ориентировочной доминанты в их поведении (Кремневская СИ. и соавт., 1991; Буреш Я.И. и соавт., 1991). Схожие тенденции наблюдаются у самок белых крыс при иммобилизации (Ломтева Н.А., 2003; Кондратенко Е.И., Ломтева Н.А, 2003).
Отсутствие болюсов, обнаруженное в наших опытах, свидетельствует о снижении уровня тревожности, так как дефекация отражает процесс эмоционального напряжения, включающего активацию вегетативной нервной системы (Маркель А.Л., 1981).
Повышенная настороженность и нарушение поведения по типу тревожности у животных часто связывается с гиперактивностью норадренергическои системы мозга, вызванной усилением деятельности нейронов гиппокампа - основного источника НА в мозге (Крыжановский Г.Н., и соавт., 1991; Боженов Ю.И., Михайлова Л.Р., 1990).
Исследование относительной массы надпочечников эксперементальных животных показало, что досоверные изменения возникают на 15 минуте у неполовозрелых и на 60-90 минуте у половозрелых крыс.
Анализируя результаты, полученные при изучении перекисного гемолиза эритроцитов, отображающего степень устойчивости мембран эритроцитов (Та-vazzi В. et al, 2000) к воздействию перекисью, необходимо отметить принципиально разный уровень ПГЭ у половозрелых и неполовозрелых животных. Значения степени ПГЭ в контроле и на всех временных точках холодового воздействия у половозрелых колеблются в пределах 1,7-1,8 %, в то время как у неполовозрелых это значение близко к 5,5-6 %, и все колебания перекисного гемолиза происходят на этих уровнях.
Данные наших опытов свидетельствуют о том, что ПГЭ показал различную реакцию на холодовое воздействие у исследуемых групп. Изменение уровня перекисного гемолиза эритроцитов как у взрослых, так и у молодых животных имеют разные пики значений на протяжении воздействия холодом, поэтому реакцию антиоксидантной системы организма может характеризоваться как фазная.
Исследование ГТГЭ при холодовом воздействии показывает, что наибольшую чувствительность к воздействию перекисью клетки эритроцитов проявляют на первых 15-30 минутах воздействия. У взрослых животных тенденция к повышению уровня идет сразу же после начала воздействия, и в точке 15 минут холодового воздействия наблюдается пик, после которого следует спад и возврат к контрольным значениям, а у молодых животных такой «пиковой» точкой является 30 минут экспериментального воздействия. Можно предположить, что более быстрая ответная реакция взрослых животных связана с уже сформировавшейся системой антиоксидантной зашиты (Gumuslu S. и соавт., 2002). При прооксидантном воздействии более зрелая антиоксидантная система (АОС) взрослых животных быстрее отреагировала на хол о до вое воздействие и подавляла воздействие разрушающих перекисей на оболочки эритроцитов. Пятнадцатиминутный холодовое воздействие приводит к активации перокси-дантных механизмов, более ярко выраженной у тех, у кого менее сформирована АОС, а после 15 минут воздействия АОС переходит из состояния стрессорной фазы «аларм», в фазу «резистентности».
Возможно, неодинаковая скорость развертывания ответа на стресс-индуцирующие воздействие также связана с включением различных антиокси-дантных систем организма на разных этапах ответа на охлаждение. Одними из первых в ответную реакцию АОС организма включаются ферментативные ан-тиоксиданты (Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1990). На рис. 50 кривая изменения активности супероксиддисмутазы эритроцитов половозрелых животных совмещена с уровнем ПГЭ. Можно отметить, что на первых 15 минутах происходит резкое увеличение уровня СОД, который остаётся таковым в промежутке 15-30 минут. СОД необходима для первичного ответа АОС организма (Сосновский А.С. и соавт., 1993; Подберезкина М.Б., Осинская Л.Ф., 1989). Таким образом, выполняя свою роль быстро реагирующего антиоксиданта, супер-оксиддисмутаза первой отвечает на развертывание процессов ПОЛ в организме, что сопровождается резким увеличением её активности. Далее к регуляции уровня ПОЛ подключаются другие механизмы антиоксидантной защиты, вследствие чего уровень супероксиддисмутазы снова приходит в норму (До-ровских В.А. и соавт, 2001; Gasangadzhiueva A.G., 1998). Несколько иначе реагирует СОД неполовозрелых животных, что объясняется возрастными особенностями формирования различных компонентов антиоксидантной системы организма
Динамика промежуточных продуктов перекисного окисления липидов у половозрелых животных
Данные, полученные нами в результате экспериментов, свидетельствуют о разном содержании МДА - конечного продукта ПОЛ в коре больших полушарий головного мозга, гипоталамусе и печени, что определяется специфическими особенностями метаболических процессов и согласуется с литературными данными. Из трех изучаемых тканей у неполовозрелых животных наименее устойчивой к холодовому воздействию оказалась гипоталамическая область: она в случае спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ давала увеличение уровня ПОЛ, что может говорить о различиях в реакции антиоксидантных систем и липидного спектра данной области мозга не только с печенью, но и с корой больших полушарий (Крепе Е.М., 1981).
В результате эксперимента было обнаружено несколько особенностей про-антиоксидантной системы животных разного возраста: уровень исходного ПОЛ гипоталамической области молодых животных на несколько порядков выше, чем у взрослых. В случае исходного ПОЛ в коре больших полушарий наблюдается обратная картина, уровень ПОЛ у взрослых животных выше. Увеличение уровня МДА в гипоталамической области неполовозрелых крыс может быть связана в этом случае с различной емкостью антиоксидантных систем тканей.
Используемая в эксперименте методика оценки общей антиокислительной активности плазмы, применяемая для оценки АОА половозрелых животных под воздействием холода, не показала достоверных результатов. Мы можем предположить, что эта методика не достаточно чувствительна на ранних стадиях воздействия холодовом стрессом и не улавливает изменения АОА на протяжении первых 90 минут воздействия. Руководствуясь этим фактом, мы не стали применять методику АОА к неполовозрелым животным.
Для определения активности ферментативного звена антиоксидантной защиты организма животных, подвергавшихся холодовому воздействию, нами были использованы методики определения ряда ферментов в эритроцитах и плазме крови.
При оценке ферментативного звена АОС организма необходимо обратить внимание на супероксиддисмутазу как самое активное звено антиоксидантной системы организма (Brawn К., Fridovich I., 1980; Oury T.D. et al, 1993; Гасангаджиева AT., 1997; Колосова Н.Г\, 1999,). Её активность в наших опытах достоверно увеличивалась у животных обеих возрастных групп, динамика этого увеличения зависела от продолжительности воздействия холодом. У половозрелых животных достоверные изменения активности возникают при 15— 30 минутах воздействия, в то время как у неполовозрелых животных увеличение активности СОД происходило на всем протяжении воздействии холодом, достоверность проявилась к 45 минуте холодового воздействия и сохранялась при продолжении воздействия. Выполняя свою роль первичного антиоксиданта (Гасангаджиева А.Г, 1997; Сосновский А.С. и соавт., 1993), супероксиддисму-таза первой реагирует на развертывание процессов ПОЛ в организме и даёт такое резкое увеличение активности в случае половозрелых животных. Далее к регуляции уровня ПОЛ подключаются другие механизмы (Peskin AV., 1997), и уровень супероксиддисмутазы снова приходит в норму. У неполовозрелых животных более позднее включение СОД, возможно, связано с большей ролью СОД в регулирование процессов ПОЛ в неполовозрелом организме, более поздней (за рамками 90 минутного исследования) реакции других ПОЛ-регулирующих механизмов. Также возможно, что такая динамика активности СОД связанна с незрелостью АОС организма неполовозрелых крыс.
Как показали полученные нами экспериментальные данные, активность каталазы в плазме крови у половозрелых животных не обнаружила достоверных изменений под влиянием холода и имела тенденцию к уменьшению активности. В то время как у неполовозрелых животных уменьшение активности становилось достоверной при 90 минутах воздействия холодом. Такая динамика изменений активности каталазы может быть соотнесена с накоплением перекиси водорода, являющегося одним из продуктов ПОЛ (Воскресенский О.Н. и соавт., 1982; Соколовский В.В., 1988; Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1990; Болдырев А.А., 1995; Еремин А.Н. и соавт., 1997), выступая катализатором превращения Н202 в Н20 и 02 (Менцер Д., 1980; Ленинджер А., 1985). Известно, что высокий уровень СОД служит показателем окислительного стресса (Пескин А.В., Столяров С.Д., 1994, Ноті Н.М. et al, 2002).
Активность церулоплазмина, железо-связывающего элемента АОС (Василенко В.А., 1978) достоверно увеличивалась на всём протяжении холодового воздействия. У половозрелых животных достоверность проявлялась на 30 минуте, а у неполовозрелых - на 45 минуте экспериментального воздействия. Стоит отметить, что в ответ на развертывание процессов свободно-радикального окисления при развитии холодовой адаптации происходит снижение уровня церулоплазмина.
Таким образом, ферментативное звено антиоксидантной системы обнаружило характерную для него ответа организма на стрессирующий фактор (Кулинский В.И., Колесниченко Л.С, 1990; Эмирбеков Э.З. и соавт, 1998; Воскресенский О.Н. и соавт., 1982), проявляющего в виде развертывания активности СОД и включение каталазы на более поздних сроках.
