Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Механизмы регуляции Р-адренореактивности органов и тканей (обзор литературы) 12
1.1. Адренорецепторы 12
1.1.2. Природа р2-адренорецепторов и механизм их взаимодействия с катехоламинами 13
1.2. Эндогенные модуляторы прямого и косвенного действия как компоненты (З-адренергического механизма 16
1.2.1. Эндогенные адреномодуляторы прямого (срочного) действия 16
1.2.2. Эндогенные адреномодуляторы косвенного (замедленного) действия 19
1.2.3. Стероидные и тиреоидные гормоны как адреномодуляторы прямого и косвенного действия 21
1.3. Общие механизмы регуляции синтеза белка 24
1.3.1. Инициация транскрипции 25
1.3.2. Транскрипция 25
1.3.3. Терминация синтеза мРНК 26
1.3.4. Регуляция работы оперона 27
1.3.5. Стабильность мРНК 30
1.3.6. Трансляция 30
1.3.7. Регуляция синтеза белка на уровне трансляции 33
1.4. Генетика адренорецепторов 34
1.5. Влияние стероидных и тиреоидных гормонов на синтез адренорецепторов 35
Глава 2. Объекты и методы исследования 40
2.1. Общий объем проведенных исследований 40
2.2. Характеристика объектов исследования 40
2.3. Методика регистрации сократительной активности изолированного миометрия 41
2.4. Методика оценки сократительной активности и адренореактивности изолированного миометрия 42
2.5. Комплексная оценка косвенных Р-адреномодулирующих свойств биожидкостей и БАВ 42
2.6. Комплексная оценка прямых Р-адреномодулирующих свойств гормонов и ряда лекарственных препаратов 43
2.7. Методика статистической обработки результатов исследования 44
Глава 3. Результаты собственных исследований 45
3.1. Спонтанная сократительная активность и Р-адренореактивность продольных полосок рога матки небеременной крысы - зависимость от сезона года 45
3.2. Изучение способности гидрокортизона оказывать в условиях in vitro прямое и косвенное адреномодулирующее влияние на миометрий беременных женщин и небеременных крыс 51
3.2.1. Прямое влияние гидрокортизона на ССА и адренореактивность миометрия беременных женщин 51
3.2.2. Прямое влияние гидрокортизона на ССА и Р-адренореактивность продольных полосок изолированного миометрия небеременных крыс 57
3.2.3. Косвенное влияние гидрокортизона на сократительную активность и Р адренореактивность продольных полосок изолированного миометрия небеременных крыс 63
3.3. Косвенное влияние гистидина, рондомицина и окситоцина на ССА и Р-адренореактивность продольных полосок изолированного миометрия небеременных крыс 66
3.3.1. Влияние гистидина 6 6
3.3.2.Влияние рондомицина 69
3.3.3.Влияние окситоцина 73
3.4. Исследование прямого и косвенного влияния L-тироксина и адриобластина на ССА и Р-адренореактивность изолированного миометрия крысы 77
3.4.1. Прямое влияние тироксина 79
3.4.2. Косвенное влияние тироксина 79
3.4.3. Прямое влияние адриобластина 80
3.4.4. Косвенное влияние адриобластина 81
3.4.5. Косвенное действие тироксина на фоне блокады синтеза адриобластином 81
3.4.6. Обсуждение результатов исследования 82
3.5. Изучение косвенного влияния крови, околоплодных вод и ликвора на ССА и Р-адренореактивность миометрия человека и животных 85
3.5.1. Влияние околоплодных вод на миометрий крысы 86
3.5.2. Влияние околоплодных вод на миометрий беременных женщин 93
3.5.3. Влияние сыворотки крови беременных женщин на миометрий крысы 102
3.5.4. Влияние сыворотки крови беременных женщин на миометрий беременных женщин 108
3.5.5. Влияние ликвора человека на изолированный миометрий крысы 115
Заключение 120
Выводы 141
Список литературы 143
Приложение 158
- Природа р2-адренорецепторов и механизм их взаимодействия с катехоламинами
- Комплексная оценка косвенных Р-адреномодулирующих свойств биожидкостей и БАВ
- Прямое влияние гидрокортизона на ССА и адренореактивность миометрия беременных женщин
- Влияние околоплодных вод на миометрий крысы
Введение к работе
Актуальность темы. Катехоламины и адренергические нервные структуры играют важную роль в регуляции деятельности висцеральных систем организма. Эффективность адренергической регуляции во многом определяется адренореактивностыо, т.е. способностью клеток организма реагировать на воздействие агонистов адренорецепторов (Авакян О.Н., 1988; Базян А.С., 1991; Розен В.Б., 1994; Альберте Б, Брей Б., Льюис Дж., 1994; Ткачук В.А., 1994; Циркин В.И., Дворянский С.А., 1997; Геннис Р., 1997; Шишкина Г.Т., Дыгало Н.Н., 1997). В последние годы в физиологии репродукции этой проблемы уделяется большое внимание в связи с тем, что в регуляции сократительной деятельности матки человека и животных во время беременности важное место занимает р-адренергический механизм. Именно благодаря ему происходит ингибирование спонтанной и вызванной сократительной активности миоцитов матки при беременности, а предродовое снижение степени этого влияния является необходимым этапом в индукции родовой деятельности (Дуда И.В., 1989; Абрамченко В.В, 1991, 1996; Циркин В.И., Дворянский С.А., 1997). Нарушения динамики р-адренореактивности миометрия лежат в основе патологии сократительной деятельности матки (СДМ) - угрозы прерывания беременности (Осокина А.А., 1998) и слабости родовой деятельности (Братухина СВ., 1997)
Считается, что адренореактивность миоцитов матки зависит от соотношения подтипов адренорецепторов, от плотности доминирующего подтипа этих рецепторов на поверхностной мембране клетки, а также от наличия п среде так называемых эндогенных модуляторов адренореактивности прямого и косвенного действия (Абрамченко В.В., 1991, 1996; Розен В.Б., 1994; Циркин В.И., Дворянский С.А., 1997; Шушканова Е.Г., 1997; Сизова Е.Н., 1998; Туманова Т.В., 1998; Шишкина Г.Т., Дыгало Н.Н, 1997, 1998; Дыгало Н.Н. и соавт., 1999).
Эндогенные модуляторы р-адренореактивности прямого действия (эндогенный сенсибилизатор Р-АР, или ЭСБАР, и эндогенный блокатор Р-АР, или ЭББАР) были обнаружены при исследовании различных разведений крови, ликвора, околоплодных вод, слюны, мочи человека: под влиянием первого фактора в течение нескольких минут Р-адренореактивность тест-объекта, в качестве которого использовались продольные полоски рога матки небеременных крыс, значительно возрастала, а под влиянием второго -;нижалась (Циркин В.И. и соавт., 1997, 1999; Циркин В.И., Дворянский С.А., 1997; Шушканова Е.Г., 1997; Сизова Е.Н., 1998, Туманова Т.В., 1998; Братухин. :.В., 1997; Осокина А.А., 1998; Гусева Е.В., 1999). Детальное изучение механизма действия и природы указанных факторов позволило при'"ги к включению, что они представляют собой низкомолекулярные веществз, так как физиологические эффекты ЭСБАР воспроизводятся гистидином, триптофаном ми тирозином (Туманова Т.В. и соавт., 1998), а эффекты ЭББАР - дофамином Морозова М.А., 2000). Показано, что у женщин содержание ЭСБАР и ЭББАР в їиожидкости зависит от ее вида, а также от этапа репродуктивного процесса
(Циркин В.И., Дворянский С.А., 1997). Считается, что адреномодулятор прямого действия оказывают свое влияние на адренорецепторы за сч< изменения их сродства к катехоламинам, а в целом, они играют важную роль срочной регуляции адренореактивности (Циркин В.И., Дворянский С.А., 199 Циркин В.И. и соавт., 1997,1999; Сизова Е.Н., 1998; Туманова Т.В., 1998).
Гипотеза о наличии эндогенных адреномодуляторов косвенного действі (т.е. влияющих на адренореактивность клеток-мишеней опосредованно, в то числе за счет синтеза р-адренорецепторов) была высказана на основани обнаружения способности неразведенных околоплодных вод беременнь женщин, а также сыворотки крови небеременных женщин повышать | адренореактивность изолированного миометрия небеременных крыс пр длительном (120-минутном) их воздействии на миометрий в условиях комнатнс температуры (Шушканова Е.Г., 1997; Сизова Е.Н., 1998). Не исключено, что эт факторы по своей природе являются гормонами стероидной или тиреоиднс природы, так как известно, что эти гормоны могут менять адренореактивност ряда органов и систем, в том числе за счет экспрессии или, наоборот, репресси генов, контролирующих синтез соответствующих подтипов адренорецепторс (Шишкина Г.Т, Дыгало Н.Н., 1997, 1998; Дыгало Н.Н. и соавт., 1998, 1999; На N. et al., 1995). В последние годы было показано, что гены адренорецепторс содержат в своем составе стероид- и тиреоидчувствительные сайты, пр воздействии на которые гормоны инициируют транскрипцию мРН рецепторных белков (Шишкина Г.Т., Дыгало Н.Н., 1997).
Учитывая, что до настоящего времени вопрос о наличии в жидких средг организма эндогенных модуляторов косвенного действия, о характе{ изменения их содержания при беременности и в родах, а также о природ механизмах действия и физиологической роли этих факторов остаетс открытым, и принимая во внимание клиническую значимость изучен! проблемы адренореактивности миометрия беременных женщин, в работе был поставлены следующие цель и задачи.
Цель исследования: изучить возможные механизмы долгосрочно регуляции р-адренореактивности миометрия человека и животных.
Задачи исследования:
-
Оценить способность сыворотки крови и околоплодных ВС (цельных, 50-, 100- и 500-кратно разведенных) беременных женщин оказывать | адреномодулирующий эффект косвенного действия при 15-180 минутно воздействии на изолированный миометрий небеременных крыс и беременнь женщин.
-
Изучить способность тироксина (10'7 г/мл), гидрокортизона (10"" 10'5 г/мл), адриобластина (10"7 г/мл) оказывать Р-адреномодулирующее влияні прямого действия на миометрий небеременных крыс и гидрокортизона (10' 10"5 г/мл) на миометрий беременных женщин.
-
Исследовать способность тироксина (10"' - 10"7 г/мл), гидрокортизої (10'7 г/мл), рондомицина (10"8 г/мл) адриобластина (10'7 г/мл), окситоцина (5x1 С МЕ/мл) и гистидина (10"8 г/мл) оказывать Р-адреномодулирующий зффеї
косвенного действия при 15-180 минутном их воздействии на изолированный миометрий небеременных крыс
4. Изучить механизм, лежащий в основе способности тироксина (10"7 г/мл) повышать Р-адренореактивность миометрия при длительном воздействии на него.
Научная новизна. Впервые в опытах с продольными полосками рога матки крысы установлено, что при прямом воздействии тироксин (10"7 г/мл) не влияет на р-адренореактивность тест-объекта, а гидрокортизон (10"7 и 10"8 г/мл) и адриобластин (10"7 г/мл) снижают ее. Гидрокортизон (10'7г/мл), гистидин (10'8 г/мл), адриобластин (10"7 г/мл) сам по себе или совместно с тироксином (10"7 г/мл), а также ликвор мужчин и женщин (1:50) при 15-, 120- и 180-минутном воздействии не влияют на р-адренореактивность изолированного миометрия небеременных крыс; окситоцин (5x10"3 МЕ/мл при 120-180 минутном воздействии) снижает ее, в то время как тироксин (108, 10"7 г/мл при 180-минутное воздействии), а также сыворотка крови женщин с неосложненным течением беременности (цельная и в разведении 1:50 при 60-, 120 и 180-минутном воздействии) и околоплодные воды (1:50, 1:100 при 180-минутном воздействии) - повышают ее. Способность тироксина повышать р-адренореактивность тест-объекта полностью исчезает при блокаде синтеза белка адриобластином (10"7 г/мл).
В опытах с изолированным миометрием беременных женщин установлено, что сыворотка крови женщин с неосложненным течением беременности при длительном воздействии на тест-объект не оказывает влияние на его адренореактивность, в то время как сыворотка крови женщин с гестозом (цельная, 1:50, 1:100 при 120-180-минутном воздействии) и околоплодные воды (цельные, 1:50, 1:100 при 180-минутном воздействии) повышают его 0-адренореактивность. 180-минутная экспозиция полосок в цельных околоплодных водах приводит к снижению параметров СА тест-объекта.
Таким образом, удалось показать, что сыворотка крови и околоплодные воды беременных женщин содержат фактор, способный при длительном (120-180 минут) воздействии значительно повышать Р-адренореактивность миоцитов матки крысы и человека. С учетом того, что его физиологический эффект полностью воспроизводится тироксином (чему препятствует блокада синтеза эелка), предлагается рассматривать этот эндогенный р-адреномодулятор косвенного действия как эндогенный активатор синтеза Р-адренорецепторов, играющий важную роль в реализации р-адренергического механизма у эеременных женщин. С учетом данных литературы обосновано представление о том, что действие этого фактора, вероятно, заключается в связывании со лтецифическими сайтами генов, контролирующих синтез Р-адренорецепторов, в результате которого происходит экспрессия этих генов, что в конечном итоге ювышает плотность Р-адренорецёпторов в миоцитах матки.
Практическая значимость. Результаты исследования демонстрируют юзможность изучения природы и механизма действия Р-адреномодуляторов сосвенного действия. Они показывают, что в экспериментальной и клинической
практике тироксин может быть использован как активатор синтеза р адренорецепторов миоцитов матки и других органов. С этой точки зрени большой интерес может представить разработка вопроса об использованиі тироксина при лечении угрозы преждевременных родов, при которой, ка показано (Осокина А.А., 1998), снижается р-адренореактивность миометрия. Н менее перспективно изучение эффективности использования тироксина дл, лечения депрессивных состояний, например, у женщин в климактерическо* периоде, когда, как это предполагается (Циркин В.И., Дворянский С.А., 1997] снижена р-адренореактивность нейронов мозга.
Внедрение. Результаты диссертационного исследования используются і научной и учебной работе кафедры анатомии и физиологии человека і животных Вятского государственного педагогического университета, кафедрь нормальной физиологии и кафедры акушерства и гинекологии Кировскоі государственной медицинской академии. Получено 3 удостоверения ні рационализаторские предложения.
Апробация работы. Материалы исследования доложены и обсуждены ні Всероссийской конференции физиологов с международным участием посвященной 150-летию со дня рождения И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 1999) на 1-й международной научной конференции «Хроноструктура и хроноэкологш репродуктивной функции» (Москва, 2000), на заседании Кировского отделеню Российского общества физиологов им. И.П. Павлова (Киров, 2000), на научны? конференциях Вятского государственного педагогического университета (Киров 1998,1999,2000).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, список которые приведен в конце автореферата.
Положения, выносимые на защиту.
-
Сыворотка крови и околоплодные воды (цельные, а также 50-, и 100-кратно разведенные) беременных женщин при длительном (180-минутном' воздействии способны повышать Р-адренореактивность миометрия. Этс объясняется наличием в них фактора, влияющего на синтез р-адренорецепторов; условно названного эндогенным активатором синтеза р-адренорецепторов.
-
Гидрокортизон (10'7 г/мл) оказывает прямое утероингибирующее и р-адреносенсибилизирующее влияние на изолированный миометрий беременных женщин, что позволяет рассматривать глюкокортикоиды как компонент системы ингибирования сократительной деятельности матки.
3. Тироксин (1С8 и 10"7 г/мл) при длительном (до 180-минутном)
воздействии на продольные полоски рога матки крысы повышает их р-
адренореактивность. Этот эффект не реализуется в условиях блокады синтеза
белка адриобластином (10'7г/мл) и следовательно, обусловлен активацией
синтеза Р" адренорецепторов.
Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, библиографического указателя (170 источников) и приложения, содержащего 43 таблицы и 34 рисунка.
Природа р2-адренорецепторов и механизм их взаимодействия с катехоламинами
Известно (75, 79, 80, 129, 138, 157), что р2-адренорецептор является белком, состоящим из 413 аминокислотных остатков, которые объединены в две субъединицы. Он содержит 7 гидрофобных а- спиралей (трансмембранных доменов), которые связанны гидрофильными вне- и внутриклеточными петлями. N- концевой участок р2-АР расположен вне клетки. Он служит для фиксации и ориентации рецептора. С-концевой участок свободно погружен в цитозоль и может подвергаться фосфорилированию (с участием киназы р2-АР), что приводит к инактивации рецептора. Дефосфорилирование этого участка (с помощью фосфатазы) реактивирует рецептор. Адреналин, норадреналин и другие адренергические агонисты связываются с р2-АР (путем образования двух водородных связей с серином-204 и серином-207) со стороны внеклеточной поверхности в области 3-6 трансмембранных доменов. Под влиянием агониста происходит конформационное изменение Р2-АР, в результате чего в третьей цитоплазматической петле, соединяющей 5-й и 6-й домены, возрастает сродство к Gs- белку (68, 69, 80, 149, 150, 153). Дальнейший каскад реакций можно представить в виде следующей схемы (88):
Образование комплекса «р2-АР + Gs-белок» — рост сродства ос-субъединицы G-белка к ГТФ - обмен сорбированного на Gs-белке ГДФ на ГТФ — (при наличии в среде ионов Mg ) диссоциация Gj-белка на ос-субъединицу и комплекс «Р-субъединица + у-субъединица» — присоединение а-субъединицы к аденилатциклазе — активация аденилатциклазы — рост внутриклеточной концентрации цАМФ - рост ГТФазной активности сс-субъединицы — расщепления ГТФ до ГДФ — диссоциация комплекса "а 14 субъединица - аденилатциклаза" — снижение активности аденилатциклазы и образование исходного Gg-белка за счет объединения а-субъединицы (связанной с ГДФ) с Ру-комплексом. В результате повышения внутриклеточной концентрации цАМФ возрастает активность протеинкиназ, а в гладких мышцах благодаря этому происходят процессы, приводящие к снижению сократительной активности миоцитов. В частности, повышается деятельность кальциевых насосов, что уменьшает концентрацию ионов Са2+ в клетке. Этот процесс может происходить по следующим двум схемам (9, 88): 1) активация протеинкиназы А — фосфорилирование регуляторного белка кальциевого насоса (фосфоламбана) — повышение активности Са-АТФазы -» рост скорости удаления ионов Са из клетки - снижение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ — уменьшение сократительной активности ГМК; 2) активация комплекса «Са +кальмодулин» — активация протеинкиназы С - фосфорилирование фосфоламбана — и далее по схеме (1) Кроме того, при повышении внутриклеточной концентрации цАМФ активируется протеинкиназа киназы легких цепей миозина (КЛИМ), что приводит к фосфорилирование КЛЦМ, а тем самым - к снижению способности миозина образовывать комплекс с актином, что в конечном итоге уменьшает сократительную активность миоцитов (9, 12, 20, 22). Повышение цАМФ также приводит к временному ингибированию фосфатазы, что снижает процесс реактивации Р-АР (135, 151). Прекращение действия катехоламинов осуществляется за счет их разрушения моноаминоксидазой или катехоламин-О-метилтрансферазой, за счет нейронального и экстранейронального захвата и пассивной диффузии катехоламинов, а также за счет активной терминации процесса. Последнее, проявляется снижением активности аденилатциклазы, повышением активности цАМФ-фосфодиэстеразы, инактивации р2-АР и Gs-белка. Инактивация р2-АР заключается в его фосфорилировании и в присоединении к нему ингибиторного белка р-аррестина (115, 126). При низких концентрациях агониста фосфорилирование совершается активированной протеинкиназой А - она фосфорилирует участки р2-АР, прилегающие к месту связывания Gs-белка (третья цитоплазматическая петля рецептора), и тем самым нарушает связывание р2-АР с Gs-белком (123). При высоких концентрациях агониста дополнительно активируется киназа Р2-АР, которая совершает транслокацию с клеточной поверхности мембраны в цитоплазму и фосфорилирует С- концевой участок Рг-АР; в этом случае создаются условия для блокирования Р-аррестином участка связывания р2-АР с Gs-белком (135). При длительном воздействии катехоламинов на р2-АР эти рецепторы, подвергнутые фосфорилированию, погружаются в цитоплазму, где часть из них под влиянием фосфатазы дефосфорилируется и вновь встраивается в мембрану, а часть -разрушается ферментами лизосом. Восполнение рецепторов осуществляется за счет их синтеза. Не исключено (46, 47, 48), что еще одним источником р2-АР для клетки служат так называемые плавающие, или циркулирующие в крови адренорецепторы, которые встраиваться в поверхностную мембрану клеток, увеличивая тем самым пул активных р2-АР клетки. В целом, фосфорилирование Р2-АР, присоединение к нему Р-аррестина нарушают способность этого рецептора активировать Gs-белок и вызывать физиологический эффект. Это порождает десенситизацию (десенсибилизацию). Поэтому скорость процесса «фосфорилирование р2-АР- дефосфорилирование Р2-АР», а также скорость синтеза р2-АР и их разрушения определяет р-адренореактивность клетки-мишени. По своей структуре Pi-AP, ссрАР и а2-АР, в определенной степени, подобны р2-АР (107). Под влиянием агониста они связываются с G-белком (Gj, Gp), в результате чего происходит активация этого белка, его диссоциация на отдельные субъединицы, изменение активности аденилатциклазы или фосфолипазы С, внутриклеточной концентрации других вторичных посредников, а в конечном итоге - изменение физиологической активности клетки - мишени.
Известно (107, 126, 130, 134, 140), что основная масса адренорецепторов клеточной мембраны синтезируется de novo. Это происходит за счет экспрессии генов, несущих информацию отдельно в отношении всех подтипов ар, а2-, Рг, р2- и Рз- адренорецепторов (146, 148). Синтез адренорецепторов, а также его внутриклеточных посредников (G-белков, протеинкиназ) идет с участием рибосом в эндоплазматическом ретикулюме клетки (80). После «дозревания» в аппарате Гольджи адренорецепторы транслоцируются в плазматическую мембрану (44, 75).
Комплексная оценка косвенных Р-адреномодулирующих свойств биожидкостей и БАВ
Изучение адренореактивности и спонтанной сократительной активности проводили на продольных полосках рога матки небеременных крыс и полосках изолированного миометрия беременных женщин. Забой крыс производили механическим повреждением дыхательного центра (без использования обезболивающих веществ). Фазу астрального цикла определяли по картине влагалищного мазка (42). После извлечения матки из каждого рога вырезали продольные полоски длиной 6-8 мм и шириной 2-3 мм.
Миометрий беременных женщин получали при биопсии во время кесарева сечения на сроках гестации 19-28 и 35-42 недели: биоптат иссекался из верхнего края операционного разреза, обычно проводимого в области нижнего сегмента матки. Поводом для оперативного родоразрешения служили рубец на матке после кесарева сечения, миопия высокой степени, раннее отхождение околоплодных вод и другие виды акушерской патологии. Биоптаты до начала эксперимента хранились в растворе Кребса в течение 4-10 часов при температуре 4-6С (кроме периода транспортировки); из них вырезали полоски длиной 8-10 мм, шириной 3-4 мм. Кровь для исследования взята (с их личного согласия) у 68 беременных женщин со сроком гестации 18-40 недель, в том числе у 27 женщин с гестозом различной степени тяжести. Околоплодные воды получены от 36 женщин при амниоцентезе, проводимом с целью прерывания беременности на сроке 17-31 неделя. Ликвор для исследования получен от 4 женщин и 8 мужчин; во всех случаях он был прозрачным и не имел примеси крови. Клинические данные о дойо р еРт кже объем выполненных исследований приведен в таблицах 2.1а. и 2.16. Порцию крови (5-7 мл) из локтевой вены собирали в стеклянную пробирку без добавления гепарина, околоплодные воды забирали при амниоцентезах катетером. Ликвор получен при люмбальной пункции. Биожидкости исследовали через 3-6 часов от момента забора, при этом кровь и околоплодные воды предварительно подвергали 15-20 минутному центрифугированию при 2000 об/мин.
Регистрацию спонтанной и вызванной сократительной активности полосок проводили по принятому в нашей лаборатории методу (101, 102) на 6-канальном «Миоцитографе» конструкции А.Г. Гусева и В.И. Циркина в стандартных условиях (температура 38С, скорость перфузии 0.7 мл/мин, пассивная аэрация рабочей камеры). Прибор, изготовленный фирмой «Норис» (Решение о выдаче патента на изобретение от 29.06.94 по заявке №5065631/14/045781 от 08.10.92. «Устройство для исследования гладких мышц «Миоцитограф»), состоит из двух термостатов, содержащих по три вертикальные рабочие камеры объемом 1 мл. Каждая камера предназначена для размещения одной полоски и независимо от остальных омывается раствором Кребса (или любым другим) с помощью шприцевого дозатора. Сократительная активность полосок регистрируется механоэлектрическим преобразователем, состоящим из механотрона типа 6МХ1С и самопишущего прибора типа Н-3020. Исходная нагрузка для полосок, задаваемая микровинтом держателя механотрона, составляла обычно 200 мг.
Раствор Кребса (рН-7.4) имел следующий состав (в мМ): NaCl-136, КС1-4.7, СаС12-2.52, MgCl2-1.2, КН2РО4-0.6, NaHC03-4.7, С6Н1206 - 11. Он применялся во всех опытах для хранения и перфузии полосок, а также для приготовления рабочих растворов веществ.
В работе использовали адреналина гидрохлорид (Московский эндокринный завод, Россия), адриобластин (UPJOHN, США), тироксин (Берлин-Хеми, Германия), гидрокортизон ацетат (Никомед, Австрия), окситоцин (Гидеон Рихтер, Венгрия), рондомицин (KRKA, Югославия) и гистидин (Ренал, Венгрия).
Спонтанную сократительную активность оценивали при анализе механограмм по трем параметрам - частоте фазных сокращений (по их числу на 10- минутном интервале), их средней амплитуде (мН) и суммарной сократительной активности (сумма всех амплитуд на 10-минутном интервале, мН/10 мин). Параметры исходной сократительной активности определяли после достижения устойчивых сокращений, но до начала воздействия адреналина или другого исследуемого агента.
Адренореактивность изолированного миометрия человека и крысы оценивали по изменению (в % к фоновому уровню) частоты, амплитуды и суммарной сократительной активности полосок в ответ на 10-минутные воздействия различных концентраций адреналина, используемых в порядке их возрастания. Каждая полоска подвергалась 3-4 кратному воздействию адреналина. Очередное тестирование проводили после восстановления исходных параметров спонтанной активности на фоне раствора Кребса.
Она проводилась по разработанному в нашей лаборатории методу (102). Тест-объектом служили полоски изолированного миометрия беременных женщин и продольные полоски рога матки небеременных крыс. Сыворотку крови и околоплодные воды после центрифугирования разводили в 50, 100 или 500 раз, а также использовали в не разведенном виде. БАВ растворяли в Кребсе до необходимых для исследований концентраций. Методика исследований заключалась в том, что полоски миометрия беременных женщин или продольные полоски рога матки небеременных крыс после иссечения и укрепления на фиксаторах подвергали экспозиции в течение 15, 60, 120 или 180 минут соответственно при 38С в цельной или разведенной в определенное число раз биожидкости или растворе Кребса, содержащем исследуемое вещество. Во всех случаях объем среды, в которой проводилась экспозиция полосок, был в пределах 2 мл. В каждом эксперименте исследовались и контрольные полоски, которые находились в аналогичных (по времени, температуре и объему) условиях в растворе Кребса. По окончании экспозиции опытные и контрольные полоски переносили в рабочие камеры «Миоцитографа», где регистрировали их спонтанную сократительную активность, а также оценивали их (3-адренореактивность, для чего полоски подвергались трехкратному воздействию (после установления стабильной СА) адреналина по схеме: адреналин 10"9 г/мл (10 мин) - раствор Кребса (10- 15мин) —» адреналин 10" г/мл (Юмин) —» раствор Кребса (10-15 мин) — адреналин 10" г/мл (Юмин) - раствор Кребса (10-15 мин). Такая процедура исследования была использована в сериях 1, 4-7, 9, 11-28.
Прямое влияние гидрокортизона на ССА и адренореактивность миометрия беременных женщин
Все полоски обладали ССА (табл.3.5.-3.6., рис.3.5.-3.6.) На 10-минутном интервале генерировалось в среднем 4.11 сокращения, амплитуда которых составляла 26.35 мН, суммарная СА - 103.79 мН/10 мин. Эти показатели согласуются с данными других авторов (60, 82, 96, 112). Адреналин в концентрации 10" г/мл на интактных полосках вызывал достоверное повышение ССА. В среднем, в 70 опытах частота спонтанных сокращений повышалась на 27.77+7.96% от исходного уровня спонтанной активности, амплитуда - на 39.50±9.45% , суммарная СА - на 41.2819.37% , (здесь и далее по тексту означает, что указанное значение достоверно отличается от исходного). Эти результаты свидетельствуют о том, что для изолированного миометрия женщин, прооперированных на сроке 20-28 недель беременности, характерно доминирование а-адренорецепторов, т.е. низкая Р адренореактивность. Полученные результаты, в определенной степени, противоречат данным (97, 98), согласно которым, при этом сроке гестации адреналин в концентрациях 10"7, 10"6 г/мл угнетает ССА миометрия женщин, что указывает на доминирование {3-адренорецепторов. В то же время, результаты наших исследований согласуются с данными, полученными Gunn I., Russel С, (128), Сизовой Е.Н. (82) - по их наблюдениям адреналин повышал ССА изолированного миометрия беременных женщин, прооперированных в первом и втором триместре беременности.
Наши эксперименты показали, что перфузия полосок гидрокортизоном в концентрации 10"11 г на мл раствора Кребса (табл. 3.6., рис. 3.6., 3.7.) не изменяла их ССА и адренореактивность, т.е. не снижала стимулирующий эффект адреналина (10" г/мл). Об этом свидетельствуют данные, характеризующие изменения параметров ССА под влиянием адреналина, выраженных как в абсолютных значениях (табл. 3.6.), так и в относительных (табл. 3.7.). Так, при 1-м тестировании, т.е. до введения гидрокортизона, в присутствие адреналина (10" г/мл) частота, амплитуда и суммарная СА составляла соответственно 106.84±13.05%, 117.32±11.367% и 147.22±12.65% от исходного уровня, при 2-м тестировании, т.е. на фоне гидрокортизона -соответственно 99.97±10.88%, 106.55±12.18%, и 156.96±12.27 % от уровня активности на фоне гидрокортизона, а при 3-м тестировании, т.е. после удаления гидрокортизона - соответственно 178.43±14.29% , 105.13±7.93% и 182.12±10.92% от исходной СА. Повышение частоты ССА в ответ на воздействие тестовой концентрации адреналина указывает на рост а-адренореактивности, который наблюдается после удаления гидрокортизона.
В концентрации 10"10 г/мл гидрокортизон не влиял на ССА полосок: частота спонтанных сокращений в его присутствии составляла 97.12±9.52% от исходного уровня, амплитуда - 96.73±10.73%, а суммарная СА -93.18±10.03%. В концентрации 10"9 г/мл гидрокортизон частично снижал параметры ССА: частота сокращений в его присутствии составляла 86.92±7.66% от исходной спонтанной активности, амплитуда 95.67±9.86%, а суммарная активность - 71.62+7.88% . Одновременно гидрокортизон в этих концентрациях (10"1 и 10"9 г/мл) обратимо снижал стимулирующий эффект адреналина, т.е. оказывал сс-адреноблокирующий эффект, или Р-адреносенсибилизирующий эффект. Так, в опытах с гидрокортизоном в концентрации 10"9 г/мл при 1-м тестировании адреналин повышал частоту, амплитуду и суммарную СА соответственно до 141.43±11.52% , 139.85±9.23% и 167.05±11.33% от исходного уровня, в то время как при 2-м тестировании, т.е. на фоне гидрокортизона (10"9 г/мл) он уже не вызывал достоверных изменений этих параметров - частота сокращений составляла 100.23±9.10% от уровня активности на фоне гидрокортизона, амплитуда сокращений - 86.74±10.11%, а суммарная СА - 102.10+9.34%. При 3-м тестировании, т.е. после удаления гидрокортизона адреналин вновь оказывал стимулирующий эффект - частота сокращений составляла 122,45+10.33% от исходного уровня СА, амплитуда - 103.67+9.65%, а суммарная активность 152.23+10.45% (табл. 3.5).
В концентрации 10" г/мл гидрокортизон снижал частоту, амплитуду и суммарную СА (соответственно до 92.24±9.17%, 70.72+10.12% и 58.26+9.24% ) и также, как в концентрациях 10"10 и 10"9 г/мл, проявлял сс-адреноблокирующий, или (3-сенсибилизирующий эффект. Например, при 1-м тестировании адреналин (10" г/мл) повышал частоту, амплитуду и суммарную СА соответственно до 106.44+10.38%, 135.57+9.84% и 199.78+10.22% от исходной спонтанной активности, при 2-м тестировании, т.е. на фоне гидрокортизона (10"8 г/мл) он не вызывал достоверных изменений этих параметров - частота сокращений составляла 100.33±10.04% от уровня активности на фоне гидрокортизона, амплитуда - 124.72±11.33%), а суммарная СА - 113.45+10.08%. При 3-м тестировании, т.е. после удаления гидрокортизона адреналин вновь оказывал стимулирующее воздействие -частота сокращений составляла 107,56±10.22% от исходной спонтанной активности, амплитуда- 131.58±9.77% , а суммарная СА 141.63+9.63% (рис. 3.6.).
В концентрациях 10" , 10" и 10" г/мл гидрокортизон вызывал выраженное угнетение ССА полосок. На этом фоне существенных изменений адренореактивности не наблюдалось. Так, в опытах с использованием гидрокортизона в концентрации 10" г/мл показано, что при 1-м тестировании адреналином частота, амплитуда и суммарная СА составили соответственно 101.34±9.98%, 126.96+10.00% и 142.69±9.39% от исходной СА, а при 2-м тестировании, т.е. на фоне гидрокортизона частота сокращений составляла 165.33±9.92% от уровня активности на фоне гидрокортизона, амплитуда сокращений - 108.25±10.57%, а суммарная СА - 187.56±9.87% . При 3-м тестировании, т.е. после удаления гидрокортизона адреналин не оказывал стимулирующего воздействия - частота сокращений составляла 88.66±9.95% от исходной спонтанной активности, амплитуда - 95.47±9.39%, а суммарная СА - 99.74±10.84% (табл. 3.5.).
Влияние околоплодных вод на миометрий крысы
Ранее было показано (112), что 120- минутная экспозиция продольных полосок рога матки небеременных крыс при комнатной температуре в цельных (неразведенных) околоплодных водах, полученных при амниоцентезе у женщин на 18-31 неделе беременности, повышает их р-адренореактивность. Это явление объяснялось наличием эндогенного сенсибилизатора (3-адренорецепторов косвенного действия.
Целью данного раздела работы являлось, дальнейшее изучение вопроса о наличии в околоплодных водах беременных женщин эндогенного Р-адреномодулятора косвенного действия, в том числе 1) возможность воспроизведения данного эффекта при экспозиции полосок в околоплодных водах в условиях 38С, 2) определение предельного разведения околоплодных вод, при котором проявляется адреномодулирующий эффект косвенного действия, также определение минимального времени экспозиции, необходимого для этого. В связи с этим были проведены четыре серии исследований (серии 13-16). В серии 13 изучалось влияние 15-, 60-, 120- и 180 минутной экспозиции (соответственно подгруппы 13.1, 13.2, 13.3 и 13.4.) продольных полосок рога матки небеременных крыс в цельных околоплодных водах на ССА и Р-адренореактивность миоцитов. Остальные три серии (14, 15 и16) проведены по аналогичному образцу соответственно с 50- , 100- и 500-кратными разведениями (раствором Кребса) околоплодных вод, полученных на том же сроке; в каждой из них также были выделены по четыре подгруппы соответственно (14.1, - 14.4; 15.1, - 15.4, 16.1, - 16.4.). Всего в четырех серия использовано 512 продольных полосок рога матки 71 небеременной крысы. Околоплодные воды были взяты у 30 женщин при амниоцентезе, проводимом с целью прерывания беременности на сроках 18-31 неделя по социальным (18 женщин) или медицинским (12 женщин) показаниям. В каждой подгруппе во всех четырех сериях одновременно проводились контрольные эксперименты
В серии 13 установлено (табл. 3.19.-3.20., рис. 3.24.), что 15-, а также 60-, 120- и 180-минутные экспозиции продольных полосок рога матки небеременных крыс в цельных околоплодных водах приводят к полной утрате у полосок способности генерировать спонтанные сокращения и реагировать развитием калиевой контрактуры на гиперкалиевый (60 мМ КС1) раствор. ССА всех исследованных полосок не восстановилась даже после 120-минутного их отмывания раствором Кребса в рабочей камере «Миоцитографа». В тоже время у контрольных полосок (все четыре подгруппы) ССА и (3-адренореактивность (т.е. способность адреналина угнетать ССА) не претерпевали существенного изменения.
В серии 14 показано (табл. 3.21.-3.22., рис. 3.24., Б), что все опытные полоски (как и контрольные) после 15-, 60-, 120- и 180- минутной экспозиции в 50-кратно разведенных околоплодных водах в условиях рабочей камеры «Миоцитографа» обладают ССА, но параметры этой активности у них по сравнению с контрольными были ниже; с увеличением времени экспозиции эти различия нарастали. Так, например, суммарная СА у опытных полосок после 60- и 120- минутной экспозиции составила соответственно 113.36+13.77мН/10мин и 58.6±3.17мН/10мин, а у контрольных -224.34±13.81 мН/10мин и 153.44±13.60 мН/10мин (р 0.05).
После 15-минутной экспозиции, при которой ССА опытных и контрольных полосок была относительно одинаковой, р-адренореактивность опытных полосок была такой же, как и у контрольных. Например, адреналин в концентрации 10"8 г/мл в одинаковой степени снижал суммарную СА контрольных и опытных полосок (соответственно до 58.50+7.66% и 61.52+7.54% ; знак показывает, что различие с исходной СА достоверно; р 0,05). Р-адренореактивность опытных полосок после 60- минутной экспозиции в околоплодных водах, при которой суммарная СА снижается на 47.5%о по сравнению с контролем), сохраняется такой же, как у контрольных полосок (табл. 3.21.-3.22.). Подобная закономерность характерна и для опытных полосок, подвергнутых 120-минутной экспозиции. 180-минутная экспозиция в 50- кратно разведенных водах вызывала почти полное угнетение способности полосок к спонтанной активности (она составляет 1.89%) от активности контрольных полосок), в связи с чем оценить изменение Р" адренореактивности не представляло возможным.
Итак, 50-кратное разведение околоплодных вод (вероятно, в силу снижения возбудимости миоцитов) вызывает зависимое от времени экспозиции угнетение параметров ССА полосок (расчеты показывают, что время экспозиции, при котором суммарная С А снижается на 50%, составило 63 минуты). При этом во всех случаях, при которых еще можно наблюдать спонтанную активность, (3-адренореактивность не уменьшалась
В серии 15 показано (таб. 3.23.-3.24., рис. 3.24., В), что после 15-, 60-, 120-и 180-минутной экспозиции в 100-кратно разведенных околоплодных водах все опытные полоски обладали стабильной ССА, параметры которой не отличались от параметров ССА контрольных полосок. Например, суммарная СА у опытных полосок составила соответственно - 279.7, 184.30, 214.30 и 234.28мН/10мин, а у контрольных - соответственно - 293.01, 198.40, 227.20 и 268.55 мН/Юмин (р 0.5). Это означает, что при 100-кратном разведении околоплодные воды утрачивают способность снижать возбудимость, сократимость и пейсмекерную активность миоцитов продольной мускулатуры рога матки небеременных крыс.
