Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Центр лимфатических сердец - спинальный центр автоматизации 8
I. Из истории вопроса о лимфатическом центре 8
2. Структурно-функциональная организация лимфатического центра 10
3. Функциональные особенности лимфатического центра 12
4. Рефлекторная регуляция деятельности лимфатического центра 14
5. Механизмы, регулирующие эндогенную спонтанную ритмику лимфатического центра... 16
Глава II. Роль системы циклических нуклеотидов в эндогенной регуляции авторитмичной активности нейрона 20
Глава III. Гамма-аминомасляная кислота - медиатор торможения в спинном мозге 30
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Методика исследования 36
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Часть I. Влияние циклических нуклеотидов на ритмогенез лимфатического центра 41
Глава I. Повышение уровня эндогенных циклических нуклеотидов 42
I. Действие ингибиторов фосфодиэстераз... 43
2. Активация циклаз фторидом натрия 51
Глава П. Действие екзогенно добавляемых циклических нуклеотидов 54
I. Циклический аденозинмонофосфат 54
2, Циклический гуанозинмонофосфат 58
3. Обсуждение экспериментальных данных I части - 62
Часть П. О возможности существования ГАМК-ергического афферентного тормозного нейрона в структуре лимфатического центра лягушки 64
Глава 1 Изучение медиаторной природы афферентного торможения активности лимфатического центра.. 66
I, Содержание эндогенной ГАМК, определенное в IX-XI-ых сегментах спинного мозга... 66
2. Афферентное торможение ритмической активности лимфатического центра. 68
3. Снятие афферентного торможения бикукуллином и пикротоксином 69
4. Снятие афферентного торможения фуросемидом и хлористым аммонием 75
Глава II. Влияние гамма-аминомасляной кислоты на авторитмичную активность лимфатического центра... 81
I. Тормозное действие гамма-аминомасляной кислоты на авто ритмичную активность лимфатического центра 81
2. Влияние бикукуллина и пикротоксина на торможение лимфатического центра, вызванное действием гамма-аминомасляной кислоты 93
3. Влияние хлористого аммония и фуросемида на торможение лимфатического центра, вызванное действием гамма-аминомасляной кислоты 97
4, Обсуждение экспериментальных данных
П части 100
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104
ВЫВОДЫ 109
- Из истории вопроса о лимфатическом центре
- Роль системы циклических нуклеотидов в эндогенной регуляции авторитмичной активности нейрона
- Гамма-аминомасляная кислота - медиатор торможения в спинном мозге
- Влияние циклических нуклеотидов на ритмогенез лимфатического центра
Введение к работе
Одной из актуальных проблем современной физиологии является расшифровка механизмов работы ритмически работающих нейрональных структур. Работы последних лет в этом направлении привели к принципиально важным представлениям о том, что нервная клетка является не просто передатчиком нервного сигнала, а способна сама управлять изменениями своей активности и трансформировала поступающие к ней сигналы с поющью эндогенных нейрохимических механизмов, В свою очередь, развитие этих представлений открывает новые подходы к пониманию принципов работы ЦНС как в норме, так и при патологии (Костюк, Крышталь, 1981). Практическая значимость исследований механизмов работы структур с ритмической активностью связана также с тем, что эти структуры обеспечивают ряд жизненно важных функций. Известными структурами такого рода являются дыхательный центр позвоночных животных, центры сердечной автомати ки ракообразных, центры локомоции позвоночных и беспозвоночных животных (Введенский, 1882; Миславский, 1885; Бреслав, Глебовский, 1981; Кедер-Степанова, 1981; Свидерский, 1979; Орловский и др., 1966; Фельдман, 1980; Ten Cate , 1965; мауегі , 1973; Tazaki , 1973;).
Одним из интересных объектов, обладающих нейрогенной авто-матией, является спинальный центр амфибий, управляющий сокращениями лимфатических сердец - лимфатический центр. Эта структура, по-видимому, является единственным спинальным центром ЦНС позвоночных, где существование истинно пейсмекерных клеток с эндогенным механизмом ритмогенеза можно считать установленным. Работами группы Ц.В.Сербенюк (Сербенюк, 1969; 1973; 1975; 1976; - 5 -1980-1983) структура этого центра достаточно подробно исследована. Так известно, что в пределах ЗХ-х - Х1-х сегментов спинного юзга лягушки локализованы пейсмекерные нейроны, обеспечивающие периодические залпы импульсов в постсиваптических мотонейронах. Мотонейроны, в свою очередь, вызывают сокращение лимфатических сердец. Активность пейсмекерных нейронов регулируется активирующими и тормозными связями через вышележащие уровни ЦНС (Балезина, 1975; Сербенюк, Балезина, 1980). Установлены также тормозные рефлекторные связи лимфатического центра, афферентные волокна которых проходят в П-ом - XI-ом дорсальных корешках (Ручинская, 1975), Природа эндогенного механизма ритмогенеза пейсмекерных нейронов лимфатического центра и его рефлекторной регуляции не исследованы. Представлялось интересным изучить возможные внутриклеточные механизмы ритмогенеза и регуляции активности лимфатического центра и сопоставить их с данными, полученными на пейсмекерах беспозвоночных, где эти механизмы достаточно хорошо изучены (Либерман и др., 1976-77; Кононенко, 1980-83; Smith е.а. $ 1975; Treistman, Levi tan , 1976; Drake, Treistman f 1981).
Целью работы было выявление нейрохимических основ активности нейронной сети лимфатического центра, локализованной в К-х -Х1-х сегментах спинного мозга. Исходя из данных последних лет о возможной ведущей роли циклических нуклеотидов в организации ритмической деятельности пейсмекерных структур у беспозвоночных, мы попытались выяснить, нельзя ли путем воздействия на внутриклеточный обмен циклических нуклеотидов направленно изменить характер залповой активности пейсмекерных структур лимфатического центра. С этой целью были проведены эксперименты, в которых изменяли активность ферментов, участвующих в синтезе как циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), так и циклического гуа-нозинмонофосфата (цШ?). Это и составило задачу первой части работы.
Во второй части работы мы попытались установить связь внутриклеточных механизмов ритмогенеза пейсмекера лимфатического центра с рефлекторным торможением этого процесса. Для решения этого вопроса существенным было выяснить» какой нейромедиатор участвует в передаче рефлекторного торможения на пейсмекер на уровне изучаемых сегментов» Ранее, Т.Ю.Ручинской (1975) на спи-нальной лягушке было показано, что афферентное торможение, вызванное раздражением П-го, Х-го дорсальных корешков, снимается пикротоксином. Дальнейшему доказательству ГАМК-ергической природы указанного торможения посвящена вторая часть нашей работы.
Впервые на пейсмекерных нейронах позвоночных показано, что в основе эндогенных механизмов ритмогенеза может лежать внутриклеточный метаболизм циклического аденозинмонофосфата. Установлено, что повышение цитоплазматического уровня цАМФ непосредственным добавлением в перфузат или путем ингибирования фосфо-диэстераз или активацией циклаз, приводит к учащению ритмической активности лимфатического центра. На основании экспериментального материала и литературных данных предполагается, что в основе ритмогенеза пейсмекера лимфатического центра лежат периодические изменения внутриклеточной концентрации цАМФ. Сопоставление с литературныш данными, полученными на нейронах беспозвоночных, свидетельствует о том, что связь циклических нуклеотидов с эндогенными механизмами ритмогенеза, по-видимому, является общим принципом работы пейсмекерных клеток.
Впервые получены данные о наличии в рефлекторной цепи лимфатического центра тормозного ГАМК-ергического нейрона, осу- - 7 -ществляющего торможение пеисмекерного звена. На основании полученного экспериментального материала и существующих литературных данных о зависимости системы ГАЖ от обмена циклического гуано-зинмонофосфата, предполагается, что регуляторное действие тормозного нейрона на активность лимфатического центра реализуется через изменение внутриклеточного уровня цІ№ в пейсмекерной клетке.
Из истории вопроса о лимфатическом центре
Лимфатические сердца, открытые Мюллером ( Mulier , 1832) и Паница (Panizza t 1832), принадлежат к числу жизненно необходимых органов амфибий. Прекращение их активности приводит к гибели (Moore f 1964). Это связано с особенностями сердечнососудистой системы амфибий - низким артериальным давлением и высокой проницаемостью сосудов ( conkiin » 1930), а также привязанностью обитания к водной среде. Лимфатические сердца перекачивают лимфу в венозную систему из лимфатических полостей, тем самым поддерживая объем циркулирующей крови на стабильном уровне.
Активность лимфатических сердец определяется нервными центрами, вынесенными за пределы сердца и находящимися в спин ном мозге. Это установлено в опытах с перерезкой передних спино М03Г0ВЫХ корешков ( Volkman , 1844; Ecichard , 1855; Priestley , 1978), методом локального раздражения спинного мозга слабыми токами (Великий, 1884), при регистрации электри ческой активности лимфатических сердец (Итина, Скоробовичук, 1964; Шалатонин, 1967; Вгшсе, Umrath , 1930;оъага , 1962).
У лягушки, как и у жабы, две пары спинномозговых центров - нижние и верхние, каждый из которых управляет сокращениями соответствующего сердца ( Morita , 1937).
Спинальные центры передних сердец располагаются в области выхода 4-5 передних корешков. Центры задних сердец - локализованы в пределах трех последних сегментов спинного мозга.
Есть основания считать, что существуют связи, синхронизующие активность верхних и нижних сердец. Прат и Рейд ( pratt
Reid , 1931; 1939) показали синхронную деятельность лимфатических сердец одной и той же стороны. Результаты опытов А.Й.Еса-кова (1958), В.Т.Шалатонина (1967), Шуха ( Such , 1964; 1968), также указывают на наличие интраспинальных путей, связывающих центры верхних и нижних лимфатических сердец. В то же время, при изучении работы нижних лимфатических сердец была показана их независимость от работы центра верхних лимфатических сердец (Ручинская, 1975).
Роль системы циклических нуклеотидов в эндогенной регуляции авторитмичной активности нейрона
Одним из существенных результатов в изучении процессов электрической возбудимости в соме нервной клетки было открытие периодических изменений мембранного потенциала, не связанных непосредственно с поступлением к ней синаптических влияний» Эти колебания могут приобретать размах, превышающий критический уровень потенциала, необходимый для активации механизма элект рической возбудимости. Наличие в соме клетки таких волн мемб ранного потенциала было обнаружено на нейронах моллюсков (таис, 1955; Arvanitaki, Chalazonitis , 1955 ). Они были расце нены как проявление спонтанной, или ауторитмическои, активности клетки. Аналогичные явления были описаны и в других типах ней ронов. Способность к длительной ауторитмическои активности сохраняется у некоторых клеток в течение длительного времени после их выделения ( Baumgarten е.a. f 1971). Тауц и Гершенфельд ( а«с, Gerchenfeld , i960; Gerchenfeld, таис f 1961) обнаружили, что соматическая мембрана нейронов моллюсков, не имеющая на своей поверхности синаптических окончаний, тем не менее обладает высокой чувст вительностью к медиаторным веществам и имеет, следовательно, молекулярные хемоуправляемые структуры, обычно свойственные постсиналтической мембране. Наличие чувствительности к медиа торным веществам было затем показано и у лишенных синаптиче ских окончаний мембраны сомы нейронов спинальных ганглиев позвоночных ( Peltz, Rasminsky , 1974). По-видимо му, это распространенное явление указывает на возможность - 21 диффузного действия выделяющихся в нервную систему медиаторных веществ, которое может сочетаться с внутрисоматическими ауто-ритмическими процессами и модулировать возникающую активность. Последующие исследования обнаружили, что соматическая мемб рана может быть подвержена действию химических факторов, вызы вающих более длительные колебания мембранного потенциала клетки.
Влияние циклических нуклеотидов на ритмогенез лимфатического центра
В 1976 г. Николь с сотрудниками ( Nicoll е.а. ,1976) изучали действие ГАМК на мотонейроны изолированного рассеченного мозга лягушки. Регистрируя мембранный потенциал в вентральных корешках, они обнаружили падение мембранного сопротивления в момент аппликации ГАМК» С этого момента эффект ГАМК на дорсальные корешки спинного мозга амфибий может быть определен как деполяризующий, а принципиальный эффект ГАМК на вентральные корешки (мотонейроны) может быть характеризован как гиперполяризующий.
ГАМК представляет собой продукт декарбоксилирования L глутаминовой кислоты. Фермент, катализирующий эту реакцию - глу таматдекарбоксилаза, специфический для нервной ткани. Он кон центрируется в терминалях ГАМК-ергических нейронов ( Kudo , 1978). ГАМК и глутаматдекарбоксилаза неравномерно распределены в ЦНС, В спинном мозге самый высокий уровень ГАМК и глутамат декарбоксилазы находится в дорсальном роге ( Miyata, otsuka, 1972, 1975; Otsuka , Konishi , 1976; Mc Geer е. a. , 1982). Такие же результаты дали исследования распределения ГАМК в спинном мозге лягушки с помощью -селективных электро дов ( Kudo , Fukuda , 1976). Определенная биохимическими методами активность глутамат-декарбоксилазы в спинном мозге жабы оказалась равной 0,98 + 0,07 нМ продукта на мг белка/мин ( Kudo , 1978). Было замечено, что ГАМК накапливается не только в тормоз - 32 ных нейронах, но и в глиальных клетках тех областей мозга, где она играет роль медиатора ( Schon , Kelly , 1974; Schubert , 1975). Клетки глии могут выступать как фактор, регулирующий уровень медиатора в межклеточном пространстве. ГАМК разрушается ферментом аминотрансфераза (ГАМК-трансаминаза или ГАМК-Т). Этот фермент катализирует перенос аминогруппы ГАЖ на альфакетоглутаровую кислоту (трансаминация), в результате чего последняя превращается в глутамат, а ГАМК - в полуальдегид янтарной кислоты (Сытинский, 1977).
Активность ГАМК-Т также достаточно велика в спинном мозге амфибий, что было подтверждено при использовании ингибиторов ГАЖ-Т-оксиаминоуксусной кислоты и гидроксиламина ( Mitchell е.а. 1974; Davidoff е.а. , 1973). Добавление этих ингибиторов значительно увеличивает уровень содержания ГАМК.
