Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Общие сведения о туберкулезной инфекции .13
1.1.1. Этиология и эпидемиология туберкулезной инфекции 13
1.1.2. Характеристика основных клинических форм туберкулеза легких 18
1.2. Иммунопатогенез туберкулезной инфекции 24
1.2.1. Особенности иммунитета при туберкулезе легких .24
1.2.2. Роль цитокинов в иммунопатогенезе туберкулезной инфекции 31
1.3. Молекулярно-генетические аспекты туберкулеза легких 45
1.3.1. Структурные основы функционального полиморфизма генов цитокинов 45
1.3.2. Связь полиморфизма промоторных регионов генов цитокинов с развитием заболеваний .48
Глава 2. Характеристика клинического материала и методы исследования 56
2.1. Характеристика больных туберкулезом легких 56
2.2. Материал исследования .58
2.3. Методы исследования 59
2.3.1. Определение содержания лейкоцитов в периферической крови 59
2.3.2. Определение фенотипической принадлежности лимфоцитов периферической крови .59
2.3.3. Выделение мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови .60
2.3.4. Иммуноферментный анализ для оценки секреции in vitro цитокинов 61
2.3.5. Выделение ДНК 62
2.3.6. Исследование полиморфизма генов цитокинов 63
2.4. Статистический анализ результатов .66
Глава 3. Результаты исследований .68
3.1. Общее количество лейкоцитов и уровень лимфоцитов периферической крови 68
3.2. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови 69
3.3. Секреция цитокинов in vitro мононуклеарными лейкоцитами периферической крови у больных туберкулезом легких 71
3.4. Анализ распределения генотипов и аллельных вариантов генов цитокинов у больных туберкулезом легких .76
3.5. Связь аллельного полиморфизма иммунорегуляторных генов с цитокинопродукцией in vitro .88
Глава 4. Обсуждение результатов 107
Выводы .130
Список литературы 132
- Этиология и эпидемиология туберкулезной инфекции
- Связь полиморфизма промоторных регионов генов цитокинов с развитием заболеваний
- Исследование полиморфизма генов цитокинов
- Связь аллельного полиморфизма иммунорегуляторных генов с цитокинопродукцией in vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на существенные достижения отечественной и зарубежной медицины и фармакологии, туберкулез, ежегодно уносящий жизни около 2 млн. человек во всем мире, остается одной из ведущих проблем современной медико-биологической науки [Kumar V. et al., 2007; Шкарин А.В., 2008; Филиппова Т.П. и соавт., 2009]. В иммунопатогенезе туберкулеза принципиальны два основных фактора: генетическая организация инфицирующего штамма Mycobacterium tuberculosis и характер иммунного ответа макроорганизма [Henao M.I., 2006; Ates О., 2008].
Решающий момент специфического иммунного ответа при туберкулезной инфекции - ответ CD4+ ThO-клеток на распознавание антигена. На данном этапе определяется форма иммунного ответа: с преобладанием антител или клеточных реакций, что зависит от множества факторов: качества и дозы антигена, цитокинового фона микроокружения, наличия или отсутствия цитокинсвязывающих рецепторов и других мембранных молекул на иммунокомпетентных клетках. Показано, что ТЫ- и Тп2-лимфоциты отличаются не только фенотипически, но и по спектру продуцируемых ими цитокинов, однако общей чертой этих двух альтернативных субпопуляций является высокая чувствительность к стимулирующему пролиферацию действию интерлейкинов (IL)-2 и IL-4 [Фрейдлин И.С., 1998; Henao M.I., 2006; Шкарин А.В., 2008; Каралян М.А., 2010; Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2010; Сахно Л.В. и соавт., 2010]. IL-2 играет ключевую роль в иммунопатогенезе туберкулезной инфекции, что связано с его способностью оказывать аутокринное (на ТЫ) и паракринное (на ТЪ2) воздействие, вызывать смещение баланса Thl/Th2 в направлении Т-клеточных реакций, регулировать рост и активность Т- и В-лимфоцитов, натуральных киллеров, моноцитов/макрофагов, определять интенсивность реакций гиперчувствительности замедленного типа [Хаитов P.M., 2006; Сахно Л.В. и соавт., 2010].
В структуре цитокинов, секретируемых регуляторними Т-клетками, IL-10 и трансформирующий фактор роста (TGF)-fS проявляют иммуносупрессорное действие [Henao M.I., 2006; Kumar V. et al., 2007; Корженевская K.B. и соавт., 2010]. Противовоспалительный IL-4, являясь продуктом CD4+ Т-лимфоцитов/хелперов с фенотипом Th2, выступает в качестве антагониста ТЫ-ассоциированных цитокинов, способствуя тем самым поляризации иммунного ответа в направлении гуморального типа реагирования [Хаитов P.M., 2001; Кучер А.Н. и соавт., 2009; Коненков В.И. и соавт., 2010]. Основная функция 1L-4 - контроль пролиферации, дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки и антителогенеза, в том числе за счет угнетения продукции провоспалительных цитокинов: IL-1, IL-6, IL-8, фактора некроза опухолей (TNF)-a [Фрейдлин И.С., 1998; Сахно Л.В. и соавт., 2010].
Характер течения воспалительного ответа, направленность противоинфекционного иммунитета при туберкулезной инфекции в значительной мере определяются особенностями межклеточной кооперации иммуноцитов, как модулируемыми в ответ
на воздействие М. tuberculosis, так и генетически детерминированными. Это влияние может быть опосредовано через изменение продукции и связывания иммунорегуляторных цитокинов иммунокомпетентными клетками [Сенников СВ. и соавт., 2002, 2005; Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2010]. В настоящее время высказывается предположение о связи генетически детерминированной гипер- или гипопродукции цитокинов с качеством иммунного ответа, ассоциативности аллельных вариантов генов цитокинов с тяжестью и продолжительностью инфекционных заболеваний [Рудко А.А., 2004; Коненков В.И. и соавт., 2009, 2010; Шевченко А.В. и соавт., 2010].
Структурные особенности белковых продуктов полиморфных генов цитокинов обуславливают дифференциацию иммунного ответа организма на бактериальную агрессию, определяющую течение и исход инфекционных заболеваний [Сенников СВ. и соавт., 2002; Гончарова И.А. и соавт., 2006]. Гены цитокинов имеют аллельные варианты, характеризующиеся большей или меньшей активностью белка либо различным уровнем его экспрессии. Показано, что полиморфные сайты T-330G гена IL2, С-590ГтетК4, С-592А геиаШО, G-308A гена TNFA, +874А/Т гена IFNG, С-509Т гена TGFB ассоциированы с уровнем продукции соответствующих цитокинов [Симбирцев А.С., 1998; Tso H.W. et al., 2005; Авдошина В.В. и соавт., 2006; Гончарова И.А. и соавт., 2006; Henao M.I., 2006; Ates О., 2008; Осташкин А.С. и соавт., 2008].
В свете вышеизложенного представляется весьма актуальным изучение секреции in vitro про- и противовоспалительных цитокинов в ассоциации с анализом полиморфизма их генов при туберкулезной инфекции, что в свою очередь может быть положено в основу разработки новых подходов к прогнозированию ее клинического течения, а также патогенетически оправданных способов профилактики и иммунокоррекции при данной патологии.
Цель исследования. Оценить модулирующее влияние аллельного полиморфизма иммунорегуляторных генов на секрецию про- и противовоспалительных цитокинов in vitro у больных туберкулезом легких.
Задачи исследования:
-
Изучить распространенность полиморфных сайтов T-330G гена IL2, С-590Т гена IL4, С-592А гена IL10, G-308A гена TNFA, +874А/Т гена IFNG, С-509Т гена TGFB среди больных туберкулезом легких г. Томска и Томской области.
-
Оценить особенности CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови и секреции in vitro про- и противовоспалительных цитокинов в ассоциации с аллельным полиморфизмом иммунорегуляторных генов у больных туберкулезом легких г. Томска и Томской области.
-
Изучить связь аллельных вариантов T-330G гена/L2, С-590Т гена IL4, С-592А гена IL10, G-308A гена TNFA, +874А/Т гена IFNG, С-509Т гена TGFB с клиническими формами (инфильтративная и диссеминированная) туберкулеза легких.
Научная новизна. С привлечением современных молекулярно-генетических и иммунологических методов исследования охарактериризована секреция in vitro про- и противовоспалительных цитокинов и оценена роль аллельного полиморфизма их генов (JL2, TNFA, IFNG, IL4, ILW, TGFB) при отдельных клинических формах туберкулезного процесса. Показано, что частота встречаемости аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена IL2, генотипа ТТ (C-59DT) гена IL4 и генотипа АА (G-308A) гена TNFA значимо выше при диссеминированном, чем при инфильтративном туберкулезе легких. Риск развития туберкулеза легких ассоциирован с генотипами GG (T-330G) гена IL2; СТ и ТТ (С-590Т) гена IL4, АА (С-592А) гена IL10; GA и АА (G-308A) гена TNFA; ТТ (С-509Т) гена TGFB и АА (+874А/Т) гена IFNG.
Выделены ключевые генетические факторы, опосредующие изменения секреции основных цитокинов иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis и связанный с ними дисбаланс CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови при туберкулезе легких. Установлено, что Т-клеточный дефицит у больных туберкулезом легких сочетается с гипосекрецией IL-2 и увеличением продукции IL-10 in vitro, которые в свою очередь связаны с носительством аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена IL2 и аллеля А и генотипа АА (С-592А) гена IL10. При этом повышенное содержание CD20+ В-лимфоцитов в крови сопряжено с гиперсекрецией 1L-4 in vitro в связи с носительством «патологического» аллеля Т и генотипа СТ (С-590Т) гена IL4.
Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные фундаментального характера раскрывают новые молекулярно-генетические аспекты развития туберкулеза легких. Результаты исследования CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови и секреции in vitro про- и противовоспалительных цитокинов в ассоциации с аллельным полиморфизмом иммунорегуляторных генов (IL2, IL4, IL10, TNFA, IFNG и TGFB) представляются важными для формирования знаний о взаимосвязи особенностей генофондных параметров популяции с закономерностями развития туберкулезной инфекции, позволяют глубже проникнуть в молекулярные механизмы данной патологии. Положения исследования могут служить базисом не только для дальнейшего изучения патогенетических механизмов туберкулезного процесса, но и для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения и исхода туберкулеза легких.
Положения, выносимые на защиту: 1. Среди аллельных вариантов генов цитокинов у больных туберкулезом легких чаще, чем у здоровых доноров обнаруживаются аллель G и генотип GG (T-330G) гена IL2, аллель Т и генотип СТ (С-590Т) гена IL4, аллель А и генотип АА (С-592А) гена IL10, аллель А и генотипы GA и АА (G-308A) гена TNFA, аллель Г и генотип ТТ (С-509Т) гена TGFB и аллель А и генотип АА (+874А/Т) гена IFNG. У пациентов с инфильтративной формой туберкулеза легких также преобладают генотипы СТ (С-590Т) гена IL4 и GA (G-308A) гена TNFA, а у больных диссеминированным туберкулезом легких - ТТ (С-590Т) гена IL4 и генотип АА (G-308A) гена TNFA.
2. Гипосекреция IL-2 и гиперсекреция IL-4, IL-10 in vitro и связанный с ними Т-
клеточный дефицит у больных туберкулезом легких сопряжены с аллельным
полиморфизмом генов 1L2 (T-330G), IL4 (С-590Т), IL10 (С-592А).
3. Генотипы GG (T-330G) гена IL2, СТкТТ (С-590Т) гена IL4, АА (С-592А) гена IL10,
GA и АА (G-308A) гена TNFA, ТТ (С-509Т) гена TGFB и АА (+874А/Т) гена IFNG ассоциированы с риском заболевания туберкулезом легких. К развитию диссеминированной формы туберкулеза легких предрасполагает носительство «патологических» генотипов GG (T-330G) гена IL2, ТТ (С-590Т) гена 114 и АА (G-308А) гена TNFA.
Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии» (Томск, 2009), научной конференции с международным участием «Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных органов и систем в норме и при патологии» (Томск, 2009), Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010), XV и XVI межгородских конференциях молодых учёных «Актуальные вопросы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009, 2010), VIII Российско-германской научно-практической конференция «Инновации в медицине. Социально значимые инфекции» (Новосибирск, 2009), X и XI международных конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009, 2010), научных семинарах кафедры патофизиологии ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (Томск, 2008-2011).
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по образованию РФ в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (государственный контракт П718 «Поиск факторов риска и прогнозирования течения и исходов социально значимых заболеваний на основе полиморфных ДНК-маркеров») и Министерства образования и науки РФ по ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (государственный контракт №16.512.11.2046 «Разработка комплекса молекулярно-генетических маркеров дизрегуляции иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis для оптимизации диагностики и коррекции вторичной иммунологической недостаточности при туберкулезе легких»).
Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре патофизиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Воспаление») ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России.
Публикации. По теме диссертации опубликована 21 работа, из них 10 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка
литературы. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 32 таблицами. Библиографический указатель включает 250 источников, из них 149 отечественных и 101 зарубежных авторов.
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации.
Соискателем лично были выполнены анализ данных литературы по теме диссертации, планирование исследования, постановка цели и задач исследования, пробоподготовка, CD-типирование, иммуноферментный анализ, выделение ДНК, аллель-специфическая полимеразная цепная реакция, статистический анализ результатов, написание и оформление диссертации.
Этиология и эпидемиология туберкулезной инфекции
Туберкулез – одно из наиболее распространенных инфекционных заболеваний, характеризующееся длительным периодом выделения возбудителя из организма человека, многообразием клинических проявлений и поражением различных органов и тканей. Известно, что более 2 миллиардов человек во всем мире являются носителями туберкулезной инфекции. Ежегодно в мире возникает 8-12 миллионов новых случаев заражения активной формой туберкулеза и около 3 миллионов человек умирают от данной патологии [Имангулова М.М. и соавт., 2005; Каралян М.А., 2010].
Наиболее часто встречается легочная форма туберкулеза, хотя наряду с этим также обнаруживается поражение мочеполовой и костно-суставной систем, периферических лимфатических узлов, кожи, глаз [Huebner R.E. et al., 1995; Gardy J.L. et al., 2011]. В настоящее время известно около 100 видов микобактерий, из которых более 20 являются патогенными для человека. Особый интерес представляет группа медленно растущих микобактерий туберкулезного комплекса – Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum и Mycobacterium microti, относящихся к роду Actinomycetalis класса Mycobacteriacae. Они являются основными возбудителями туберкулеза человека. В то же время 90% случаев туберкулеза, как хронического инфекционного заболевания, обусловлено M. tuberculosis [Хоменко А.Г., 1997; Лиманский А.П., 2004; Филиппова Т.П. и соавт., 2009; Ерохин В.В., 2009]. M. tuberculosis представляет собой тонкую прямую или слегка изогнутую палочку длинной 3-5 микрон и шириной 0,5 микрон. Микобактерии туберкулеза (МБТ) относятся к прокариотам (в их цитоплазме нет высокоорганизованных органелл аппарата Гольджи, лизосом). Микобактерии являются факультативными внутриклеточными паразитами, они неподвижны, не образуют капсулы, эндоспор. Не характерно для данного возбудителя также синтезирование экзотоксина. Отравляющее действие на организм обусловлено наличием токсических веществ, входящих в состав тела микобактерий и высвобождающихся при их разрушении [Урсов И.Г., 1997]. Микобактерии туберкулеза (МБТ) резистентны ко многим факторам внешней среды. Они являются кислото-, спирто-, щелочеустойчивыми палочками, чувствительными к прямым солнечным лучам, хлорсодержащим препаратам. Различные штаммы МБТ обладают неодинаковой патогенностью. Их вирулентность зависит от содержащегося в наружной части клеточной стенки, так называемого, корд-фактора, который способствует развитию ряда патологических процессов на клеточном уровне: препятствует слиянию фагосомы с лизосомой в макрофагах, угнетает энергопроцессы в митохондриях, ингибирует продукцию цитокинов. Еще одним компонентом клеточной стенки микобактерий является липоарабиноманнан. Он находится на плазматической мембране и имеет способность пронизывать клеточную стенку. Представляет собой гетерогенную смесь высокомолекулярных липополисахаридов, углеводным компонентом которых служат разветвленные полимеры арабинозы и маннозы, а липидная часть представлена производными пальмитиновой и туберкулостеариновой кислот. Маннозные радикалы липоарабиноманнана участвуют во взаимодействии микобактерий с макрофагами [Ерохин В.В., 2002].
Попадая в организм человека, МБТ ведет паразитический образ жизни. Благодаря наличию трехслойной мембраны и присутствию в её составе до 40% липидов, к которым относится и корд-фактор, микобактерия чрезвычайно устойчива к факторам внутренней среды, а также к противотуберкулезным препаратам. Персистируя в макрофаге, она отделена от иммунной системы сначала мембраной макрофага, затем мембраной фагосомы, а затем и собственной трехслойной фосфолипидной стенкой, что делает её очень устойчивой к неблагоприятным воздействиям со стороны макроорганизма [Маянский А.Н., 2001]. Филогенетические исследования позволили разделить микобактерии туберкулезного комплекса на ряд семейств. Семейство W-Beijing одно из распространенных клональных вариантов M. tuberculosis, наиболее часто вызывающий эпидемические проявления [Сурикова О.В. и др., 2005]. Этот штамм микобактерий был выделен и описан в Пекине [Van Soolingen et al., 1995]. Он широко распространен во всем мире и особенно в странах Юго-Восточной Азии. Согласно данным, приведенным в ряде публикаций [Медведева Т.В. и соавт., 2004; Степашина В.Н. и соавт., 2006], в некоторых регионах России (в Северо-Западном федеральном округе и в Восточной Сибири) среди микобактерий, выделяемых больными туберкулезом, преобладают штаммы семейства Beijing. Штаммы семейства W-Beijing характеризуются способностью вызывать тяжелые, трудно поддающиеся лечению случаи туберкулеза легких с высоким уровнем смертности [Лихошвай Е.Ю. и соавт., 2006]. Так же широко, как штамм Beijing, в России распространены штаммы семейства А1, часто являющиеся причиной туберкулезного поражения легких у больных, проживающих в центральном регионе России. В этом семействе с высокой частотой встречаются лекарственно-устойчивые штаммы. Штаммы семейства А1 проявляют тенденцию к клональному распространению и имеют высокий уровень кластеризации [Степашина В.Н. и соавт., 2006].
Причинами эпидемиологического неблагополучия по туберкулезу является ухудшение социально-экономических условий, снижение жизненного уровня населения, рост числа лиц без определенного места жительства, активизация миграционных процессов. Позднее выявление больных и недостаточное выделение средств на лекарственное обеспечение снижают эффективность лечения [Мокеева А.В. и соавт., 2005].
Особую остроту проблема туберкулеза приобрела из-за широкого распространения штаммов возбудителя туберкулеза с моно- и полирезистентностью к основным антибиотикам, на протяжении многих лет используемых для лечения, а также пандемии инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), образующей смертельную комбинацию с туберкулезом [Карягина А.С. и соавт., 2004].
Начиная с 1992 г., эпидемическая ситуация по туберкулезу резко ухудшилась во всем мире, наблюдается рост заболеваемости и смертности как среди взрослых, так и среди детей. Неблагоприятные изменения социально-экономических условий, резкое увеличение миграционных потоков, снижение качества противотуберкулезной службы и объема профилактических обследований способствовало росту заболеваемости туберкулезом и в России [Петрухина М.И., 2003, Филиппова Т.П. и соавт., 2009]. Характерной особенностью современной пандемии туберкулёза является повышение удельного веса обширных деструкций в поражаемых туберкулезным процессом тканях [Graham S.M., 2003; Mouzinho A., 2004; Филиппова Т.П. и соавт., 2009], что в значительной степени обусловлено катастрофическим увеличением числа больных с ВИЧ-ассоцированным туберкулёзом [Ерохин В.В. и соавт., 2005; Фролова О.П. и соавт., 2005; Vaz P. et al., 2003; Kalou M. et al., 2005] и возрастанием количества генетических мутантов микобактерий, резистентных к антибактериальным препаратам [Koeck J.L. et al., 2002; Murray M., 2002]. В настоящее время эпидемическая обстановка по туберкулезу в Российской Федерации характеризуется как крайне неблагоприятная, в структуре впервые выявленного туберкулеза легких преобладает инфильтративная и диссеминированная форма заболевания, а наибольшую опасность представляет фиброзно-кавернозный туберкулез легких [Шилова М.В., Лебедева Л.В., 2010; Томашевский А.Ф. и соавт., 2010].
Связь полиморфизма промоторных регионов генов цитокинов с развитием заболеваний
Поскольку восприимчивость к инфекционным агентам является генетически детерминированной, то характер наследования подверженности и резистентности к туберкулезу различается. Самые убедительные доказательства влияния наследственности на чувствительность к туберкулезу продемонстрировано в исследованиях монозиготных близнецов, у которых конкордантность возникновения клинически выраженного туберкулеза достоверно выше, по сравнению с дизиготными близнецами [Блум Б., 2002; Bellamy R., 2003; Игманулова М.М., 2005]. Попытки установить факторы, определяющие подверженность того или иного индивида к развитию инфекционно-воспалительного заболевания, или его устойчивость к развитию болезни при контакте с возбудителем, до сих пор остаются полностью не выясненными, несмотря на значительные успехи в разработке прогностических программ на основе генетических данных [Авдошина В.В. и соавт., 2006]. Полиморфизмы генов, белковые продукты которых вовлечены в механизмы иммунологической защиты, определяют степень резистентности к инфекциям. Одним из ключевых цитокинов вовлеченных в патогенез туберкулезного процесса, как отмечалось ранее, является IL-2. У человека ген IL2 находится в регионе 4 хромосоме (q24-q26) и состоит из 6684 пар нуклеотидов, включая 5 - и 3 -последовательности. Контроль транскрипции гена IL-2 связан с определенными зонами в 5 -области, где расположены участки связывания энхансеров транскрипции NFAT-1, NF-B, AP-1 [Симбирцев А.С., 1998; Кетлинский С.А., 2008].
Полиморфизм гена этого интерлейкина определяется двумя точечными мутациями в положениях -330 и +166 относительно стартовой точки транскрипции. SNP в регионе +166 локализована в лидерном пептиде и не влияет на аминокислотную последовательность (молчащая мутация), а замена Т-330G (замена тимина на гуанин) в промоторном регионе может влиять на уровень продукции IL-2. Так, показано, что аллель -330G ассоциирован со сниженной способностью активированных клеток к продукции IL-2 [Коненков В.И., 2003; Авдошина В.В. и соавт., 2006].
Следует отметить, что аллельный полиморфизм Т-330G промотора гена IL2 еще недостаточно изучен. В настоящее время ведутся исследования ассоциаций этого полиморфизма с различными инфекционными и онкологическими заболеваниями [Hollegaard M.V., 2005]. Также SNP Т-330G гена IL2 является кандидатным маркером для поиска ассоциаций с аутоиммунными заболеваниями, что связано с возникающим при его недостатке аутоиммунными расстройствами [Коненков В.И., 2003].
Еще одним значимым в патогенезе туберкулезной инфекции провоспалительным цитокином является IFN-, который кодируется геном IFNG, локализованным на хромосоме 12q24.1 и содержит 4 экзона и 3 интрона [Losana G. et al., 2002]. Полиморфный сайт +874A/T расположен в первом интроне гена IFNG и также относится к SNP-заменам [Ананько Е.А., 2008]. Выявлено, что наличие аллеля +874T в гене IFNG ассоциировано с повышенной экспрессией гена и, следовательно, с изменением продукцией этого цитокина клетками иммунной системы [Bream J.M. et al., 2000; Соколова Ю.В., 2007]. По данным литературы, полиморфизм +874A/T гена IFNG (замена аденина на тимин) связан с восприимчивостью к атипичной пневмонии, с тяжелым острым респираторным синдромом, туберкулезом и гепатитом В [Pereira C.B. еt al., 2004; Tso H.W. et al., 2005; Henao M.I. et al., 2006]. Также данный полиморфизм, по-видимому, является маркером проявления артрита при системной красной волчанке [Quesniaux V. et al., 2004].
Наиболее активно изучаемым является ген провоспалительного цитокина TNF- [Ates O. et al., 2008]. Он находится на 6 хромосоме (6p21.3) человека, в локусе, кодирующем молекулы главного комплекса гистосовместимости (HLA), и содержит несколько сайтов однонуклеотидного полиморфизма, которые модифицируют экспрессию гена [Рыдловская А.В., 2005; Пай Г.В. и соавт., 2006; Осташкин А.С. и соавт., 2008]. В локусе гена TNFА обнаружено, по различным данным, от 13 [Пай Г.В. и соавт., 2006] до 80 [Черкашина И.И. и соавт., 2009] полиморфных сайтов в промоторной области. В процессе многочисленных исследований возможных ассоциаций с генетической вариабельностью TNFA установлено, что функционально значимый полиморфизм данного гена регистрируется только для двух полиморфных сайтов: -308 и -238 в промоторной области. Это единичные нуклеотидные замены гуанина на аденин [Kim Y. J. et al., 2003; Пай Г.В. и соавт., 2006; Плотников В.Я. и соавт., 2007]. Установлено, что полиморфизм G-308A повышает транскрипционную активность гена TNFА и, соответственно, продукцию цитокина (как конститутивную, так и индуцированную). В случае же полиморфизма G-238A замена гуанина на аденин приводит не к повышению, а к понижению продукции белка [Barber R.C. et al., 2004; Wang S. et al., 2008]. По литературным данным, наличие аллеля -308А приводит к увеличению эффективности транскрипции гена и продукции TNF- в 3-6 раз, тогда как присутствие аллеля -238А приводит к снижению синтеза TNF- в 2-3 раза по сравнению с нормальным вариантом. Степень повышения (в случае полиморфизма -308А) или снижения (в случае SNP -238А) продукции этого цитокина зависит от вещества, воздействующего на клетку, а также от типа самой клетки [Коненков В.И., 2003; Рыдловская А.В., 2005; Осташкин А.С. и соавт., 2008; Черкашина И.И. и соавт., 2009]. Исследования гена TNFА в качестве гена-кандидата различных МФЗ активно проводятся учеными многих стран. На сегодняшний день имеется более 1000 исследований гена TNFА в генетике онкологических, эндокринных, бронхолегочных, кожных, нервно-психических заболеваний, гематологии, патологии опорно-двигательного аппарата, желудочно-кишечного тракта и мочевыделительной системы [Сеитова Г. Н. и др., 2008]. Например, при таких злокатчественных онкологических заболеваниях как рак матки, рак молочной железы, при гиперклеточной и базальноклеточной карциномах, при раке желудка и слизистой оболочки полости рта, а также при неходжкинской лимфоме и хронической лимфоцитарной лейкемии присутствие высокопродуцирующего аллеля -308A в генотипе человека служит негативным фактором, сказывающимся в более агрессивном протекании заболевания и высокой смертности пациентов [Рыдловская А.В., 2005; Пай Г.В. и соавт., 2006; Hohler T. A. et al., 2008].
Также показана связь между высокопродуцирующим вариантом гена данного цитокина и такими аутоиммунными заболеваниями, как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, сахарный диабет и рассеянный склероз [Герцог О.А и соавт., 2005; Рыдловская А.В., 2005; Черкашина И.И. и соавт., 2009].
Относительно роли полиморфного аллеля -308A в патогенезе туберкулезной инфекции существуют различные мнения. Большинство авторов указывают на то, что аллель -308A значительно чаще встречается среди больных легочным туберкулезом по сравнению со здоровыми донорами, то есть является фактором риска при данной патологии [Cabantous S. et al., 2006; Henao M.I. et al., 2006; Ates O. et al., 2008]. Другие говорят о протективной роли данного аллеля, но только на первых этапах заболевания легочным туберкулезом, однако на стадии иммунного ответа наличие такого высокопродуцирующего аллеля способствует ухудшению состояния и возникновению рецидивов [Selvaraj P. et al., 2001]. Так, при развитии хронической инфекционной патологии, такой как туберкулез, генетически обусловленная высокая продукция TNF- может иметь протективное значение, что указывает на важнейшую роль данного цитокина в защите от МБТ. Эти данные подтверждаются и результатами анализа последствий длительного назначения антицитокиновой терапии у больных ревматоидным артритом, получавших лечение препаратами, блокирующими TNF-. У таких больных подавление биологической активности эндогенного TNF- приводило к затуханию аутоиммунного процесса, однако сопровождалось увеличением частоты развития и генерализацией туберкулеза [Рыдловская А.В., 2005; Saliu O.Y. et al., 2006; Некрасов Е.В. и соавт., 2009]. Не меньший интерес представляют данные по исследованию аллельных полиморфизмов генов противовоспалительных цитокинов, а именно IL-4, IL-10 и TGF- [Барри Р. Блум, 2002; Коненков В.И., 2003; Игманулова М.М., 2005].
Исследование полиморфизма генов цитокинов
Исследование полиморфных участков генов цитокинов проводили с использованием аллельспецифической амплификации специфических участков генома.
Принцип метода. Исследуемые аллельные варианты генов относятся к SNP-полиморфизмам, т.е. характеризуются заменой одного нуклеотида. Для детекции используется аллельспецифическая полимеразная цепная реакция. По наличию или отсутствию продукта амплификации делают заключение о характере полиморфизма.
Ход работы. Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к набору «АмплиСенс-200-1» («ИнтерЛабСервис», Россия), в пробирках типа «Эппендорф» путём ПЦР, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе с применением амплификатора «Терцик МС2» («ДНК-технология», Россия). Было исследовано шесть полиморфных варианта шести цитокинов T-330G гена IL2 (rs2069762), C-590T гена IL-4 (rs2243250), C-592A гена IL10 (rs1800872), G-308A гена TNFА (rs1800629), С-509Т гена TGFВ (rs1800469), +874А/Т гена IFNG (rs2340561). Общая реакционная смесь для аплификации объёмом 25 мкл содержала: «нижнюю» смесь, состоящую из смеси праймеров («Синтол», Россия) и смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов 2мМ (dNTP-mix) в равных частях в отдельных пробирках на каждую пару праймеров; «верхнюю» смесь в конечной концентрации Mg2+ 2,5, 10 мкл ПЦР-буфера, 2,5 мкл 50мМ MgSO4, 6,5 мкл Н2О и 1,0 мкл Tag-полимеразы (из расчёта на одну пробирку). Раскапывали в микропробирки для ПЦР по 5 мкл «нижней» смеси и по 10 мкл «верхней» смеси. Сверху капали по 1 капле масла для ПЦР. Вносили сверху на масло по 10 мкл исследуемой ДНК.
Программа амплификации включала в себя предварительную денатурацию при 96С в течение 1 мин, с последующими 10 циклами, каждый из которых состоял из денатурации при 96С (15 с), отжига при специфической для каждой пары праймеров температуре (50 с), элонгации цепи при 72С (40 с). Затем 20 циклов, состоящих из денатурации при 96С (10 с), отжиг при 60С (50 с) и элонгации при 72С (40 с). Программу завершала финальная элонгация при 72С в течение 1 мин (табл. 2).
Анализ продуктов амплификации проводили разделением фрагментов ДНК в 2% агарозном геле: 2 г агарозы смешивали с 2 мл 50ТАЕ буфера (242 г трисаминометана, 37,2 г ЭДТА, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, довести до 1 л Н2О, рН 8,0) и нагревали в микроволновой печи до полного расплавления агарозы. Охлаждали раствор до 50-60 С и заливали в камеру для электрофореза, в которой предварительно устанавливали гребенку для формирования лунок. Для формирования геля оставляли его на 20-30 мин, затем камеру заполняли 1ТАЕ буфером (10 мл 50ТАЕ буфера, 490 мл Н2О) так, чтобы он слегка покрывал гель и убирали гребенку. После проведения ПЦР 5 мкл амплификата разделяли в агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида, при напряжении 150 B в течение нескольких мин для последующей визуализации в УФ-свете, подтверждающей наличие продукта амплификации. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («Сибэнзим», Россия).
Связь аллельного полиморфизма иммунорегуляторных генов с цитокинопродукцией in vitro
Как известно, генетическая регуляция – очень сложный процесс, складывающийся из взаимодействия множества участков генома [Корытина Г.Ф. и соавт., 2008]. Туберкулез, как мультифакториальная патология, развивается в результате действия множества генов, каждый из которых вносит свой незначительный вклад в развитие данного заболевания. Полиморфизм генов, белковые продукты которых вовлечены в механизмы иммунологической защиты, определяют степень резистентности к микобактериальной инфекции, а также тяжесть и продолжительность заболевания [Гончарова И.А. и соавт., 2006; Gonzalo X. et al., 2011].
В связи с этим нами была предпринята попытка найти ассоциации аллельных вариантов полиморфных сайтов Т-330G гена IL2, C-590T гена IL4, С-592А гена IL10, G-308A гена TNFА, C-509T гена TGFВ и +874A/T гена IFNG с уровнем продукции соответствующих цитокинов.
Бесспорным является тот факт, что изменения в промоторной области влекут за собой изменение активности контролируемого гена. Поскольку известно, что полиморфизм Т-330G расположен в области промотора гена IL2, то теоретически замена тимина на гуанин в позиции -330 п.н. относительно стартовой точки транскрипции, должна быть связана с уровнем экспрессии гена, а соответственно и с уровнем синтеза кодируемого продукта. При анализе зависимости уровня секреции IL-2 от аллельного варианта полиморфизма T-330G гена IL2 было обнаружено, что максимальный уровень продукции IL-2 имел место у носителей гомозиготного генотипа по аллелю Т, а минимальный – у носителей гомозиготного генотипа по аллелю G (табл. 21). В группе здоровых доноров было выявлено статистически значимое снижение спонтанной продукции IL-2 у гетерозигот TG по сравнению с гомозиготами по аллелю Т и аллелю G (рTT/TG 0,05 и рTG/GG 0,05) полиморфизма T-330G гена IL2. Показан также более низкий уровень спонтанной продукции IL-2 у гомозигот по аллелю G (рTT/GG=0,023) по сравнению с гомозиготами по аллелю Т (T-330G) гена IL2 (табл. 21). Следует отметить, что у больных ТЛ уровень BCG-индуцированной продукции исследуемого цитокина среди гомозигот ТТ (T-330G) гена IL2 оказался значимо ниже по сравнению с таковым у здоровых доноров (р1 0,05) (табл. 21).
Интересным является и тот факт, что в группе больных с диссеминированной формой ТЛ уровень спонтанной продукции IL-2 у гомозигот по аллелю Т (T-330G) гена IL2 оказался значимо выше, как по сравнению с группой контроля (р1 0,05), так и по сравнению с подргуппой больных ИТЛ (р2 0,05) (табл. 22). Статистический анализ выявил значимое понижение уровня продукции IL-2 в зависимости от генотипа полиморфизма T-330G гена IL2 в общей группе больных ТЛ (рTT/TG 0,05; рTT/GG 0,05 и рTG/GG 0,05), и в подгруппе больных ДТЛ (рTT/TG 0,05; рTT/GG 0,05 и рTG/GG 0,05) (табл. 21, табл. 22). В подгруппе больных ИТЛ прослеживалась только тенденция к снижению секреции цитокина, сходная с полученными данными у здоровых доноров (табл. 21, табл. 22).
Полиморфизм С-590Т гена IL4 так же находится в промоторном участке на пятой хромосоме (5q31.1) и контролирует уровень экспрессии соответствующего цитокина. В связи с этим был предпринят анализ уровня продукции IL-4 в зависимости от аллельного варианта полиморфизма С-590Т гена IL4, который показал, что у гомозигот по аллелю Т наблюдается максимальный, а у гомозигот по аллелю С – минимальный уровень секреции IL-4 как в группе здоровых доноров, так и в группе больных ТЛ (табл. 23). Среди здоровых доноров отмечалось значимое увеличение продукции исследуемого цитокина у гомозигот по аллелю Т (С-590Т) гена IL4 (рCC/CT 0,05 и рCC/TT 0,05) по сравнению с гетерозиготами TC и гомозиготами CС соответственно, а также более высокий уровень продукции IL-4 у гетерозигот (рCT/TT 0,05) по сравнению с гомозиготами по аллелю C (табл. 23).
В общей группе больных ТЛ было зафиксировано статистически значимое увеличение секреции IL-4 (спонтанной и BCG-индуцированной) у пациентов с генотипом ТТ по сравнению с генотипами CT (рCT/TT 0,05) и CC (рCC/TT 0,05) полиморфного сайта С-590Т гена IL4 (табл. 23). В группе больных ИТЛ выявлено значимое превышение уровня спонтанной секреции IL-4 in vitro у гомозигот ТТ (С-590Т) гена IL4 по сравнению с гетерозиготами (рCT/TT 0,05) и гомозиготами СС (рCC/TT 0,05) (табл. 24).
Полиморфизм С-590Т гена IL4 так же находится в промоторном участке на пятой хромосоме (5q31.1) и контролирует уровень экспрессии соответствующего цитокина. В связи с этим был предпринят анализ уровня продукции IL-4 в зависимости от аллельного варианта полиморфизма С-590Т гена IL4, который показал, что у гомозигот по аллелю Т наблюдается максимальный, а у гомозигот по аллелю С – минимальный уровень секреции IL-4 как в группе здоровых доноров, так и в группе больных ТЛ (табл. 23). Среди здоровых доноров отмечалось значимое увеличение продукции исследуемого цитокина у гомозигот по аллелю Т (С-590Т) гена IL4 (рCC/CT 0,05 и рCC/TT 0,05) по сравнению с гетерозиготами TC и гомозиготами CС соответственно, а также более высокий уровень продукции IL-4 у гетерозигот (рCT/TT 0,05) по сравнению с гомозиготами по аллелю C (табл. 23).
В общей группе больных ТЛ было зафиксировано статистически значимое увеличение секреции IL-4 (спонтанной и BCG-индуцированной) у пациентов с генотипом ТТ по сравнению с генотипами CT (рCT/TT 0,05) и CC (рCC/TT 0,05) полиморфного сайта С-590Т гена IL4 (табл. 23). В группе больных ИТЛ выявлено значимое превышение уровня спонтанной секреции IL-4 in vitro у гомозигот ТТ (С-590Т) гена IL4 по сравнению с гетерозиготами (рCT/TT 0,05) и гомозиготами СС (рCC/TT 0,05) (табл. 24).
В группе больных ДТЛ достоверных различий получено не было, но отмечалась тенденция к увеличению продукции исследуемого цитокина у гомозигот по аллелю Т по сравнению с гетерозиготами и гомозиготами СС полиморфизма С-590Т гена IL4 (табл. 24).
Значимых различий в продукции IL-4 in vitro между здоровыми донорами и больными ТЛ со сходными аллелями и генотипами полиморфизма С-590Т гена IL4 выявлено не было. В группе больных ТЛ отмечалась лишь тенденция к увеличению продукции данного цитокина (табл. 23). Выявлено значимое снижение BCG-индуцированной продукции IL-4 in vitro у больных ТЛ, имеющих генотип СТ (С-590) гена IL4, по сравнению с соответствующим показателем в группе контроля (табл. 23).
Сходная тенденция к увеличению секреции цитокина фиксировалась и в группах больных ИТЛ и ДТЛ, однако статистически значимых результатов получено не было, исключая достоверное превышение (p1 0,05) спонтанной продукции IL-4 у гетерозигот СТ (С-590Т) гена IL4 в подгруппе больных ДТЛ по сравнению с аналогичным показателем у здоровых доноров (табл. 24).
Для гена IL10, который находится в промоторном участке первой хромосомы человека (1q31-q32), также существует функциональный полиморфизм С-592А. Проведенное нами исследование продукции IL-10 в зависимости от аллельного полиморфизма C-592А гена IL10 показало, что у здоровых доноров с генотипом АА уровень IL-10 в супернатантах значимо превышал его содержание у лиц, имеющих генотипы СС (рCC/AA 0,05) и СА (рCA/AA 0,05) (табл. 25).
Среди пациентов с ТЛ, несущих генотип СС (C-592А) гена IL10, отмечалось статистически значимое снижение как спонтанной, так и индуцированной продукции исследуемого цитокина по сравнению с больными ТЛ, имеющими генотип СА (рCC/CA 0,05) и АА (рCC/AA 0,05). В группах больных ИТЛ и ДТЛ отмечалась сходная картина (табл. 25, табл. 26).
В общей группе больных ТЛ, а также в подгруппах больных ИТЛ и ДТЛ у лиц, несущих генотипы АА, СА и СС (C-592А) гена IL10, отмечалось значимое (p 0,05) увеличение как спонтанной, так и BCG-индуцированной концентрации IL-10 по сравнению со здоровыми донорами, имеющими соответствующие генотипы, за исключением индуцированного уровня секреции IL-10 in vitro в общей группе больных ТЛ и у группы больных ИТЛ (табл. 25, табл. 26).
