Введение к работе
Актуальность проблемы: Рак легкого занимает ведущее место в структуре онкологической заболеваемости населения практически всех индустриально развитых стран, характеризуется постоянным повышением частоты заболеваемости, в том числе в России, и низкими показателями выживаемости [Аксель Е.М., Давыдов М.И., 2002; Полоцкий Б.Е., Лактионов К.К., 2006; Gessner С. et al., 2004; Matakidou A. et al. 2007]. На дошо немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ), который объединяет плоскоклеточную (ПКРЛ), крупноклеточную гистологии и аденокарциному (АКЛ), приходится до 80-85% больных раком легкого; 15-20% составляет группа мелкоклеточного рака легкого (МКРЛ) [Бахлаев И.Е., Толпинский А.П., 2000; Трахтенберг А.Х., Чиссов В.Ч., 2000]. Различие между гистологическими типами рака легкого в течении патофизиологического процесса - по скорости развития опухоли, по степени малигнизации и дифференциации, вероятности метастазирования - дают основания для предположений об особенностях метаболических нарушений и генетической предрасположенности для различных типов рака легкого [Сое B.P.et al., 2006; Liu G. et al., 2001; Miller D.P. et al., 2002].
Рак легкого представляет собой мультифакториальную патологию, развитие которой обусловлено взаимодействием внешнесредовых и эндогенных факторов [Якубовская Р.И., 2000; Mechanic L.E. et al., 2005; Menezes R.J., 2007]. Вовлечение в патогенез рака легкого генетических факторов, ответственных за взаимодействие с экзогенными и эндогенными агентами, на фоне недостаточности иммунной системы и метаболических нарушений в ткани легкого может определять различия в уровнях риска развития заболевания.
Патогенез рака легкого определяется нарушениями фундаментальных клеточных механизмов в опухолевой ткани с одной стороны и нарушениями функций иммунной системы с другой [Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004; Kazbariene В., 2009; Standish L.J. et al., 2008]. Большое число исследований направлено на поиск специфических метаболических нарушений при раке легкого, ассоциированных, в частности, с развитием иммуносупрессии. В то же время не достаточно изученным остается вопрос о том, на сколько нарушаются универсальные внутриклеточные метаболические пути, функционирующие в опухолевой ткани и клетках иммунной системы. Многие данные свидетельствуют о различии патогенетических механизмов при разных гистологических типах рака легкого [Бахлаев И.Е., Толпинский А.П., 2000; Полоцкий Б.Е., Лактионов К.К., 2006], однако до настоящего времени не установлено определенного профиля метаболических нарушений, как в ткани легкого, так и в клетках иммунной системы в зависимости от гистологического типа.
Накопленные к настоящему времени данные позволяют характеризовать полиморфизм генов, вовлеченных во взаимодействие с факторами среды, регуляцию клеточного цикла и стабильности генома как генетических факторов предрасположенности к раку легкого с высокой распространенностью и низкой пенетрантностыо [Milne R.L., Benitez J., 2008], Наибольшее внимание в исследованиях ассоциации с риском развития рака легкого уделяется "нулевым" генотипам генов второй фазы биотрансформации ксенобиотиков глутатион-Б-трансфераз - GSTM1 и GSTT1, Arg/Pro-полиморфизму 72 кодона 4 экзона гена-онкосупрессора р53, полиморфизму С677Г гена метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR) [Суворова И.К. и соавт.,
2005; Чердынцева Н.В. и соавт., 2006; Dai S. et al., 2009; Hung R.J. et al., 2007; Popanda O. et al., 2007; Zhang X.M. et al., 2005]. Данные полиморфизмы создают неблагоприятный генетический фон для развития рака легкого, который реализует свое влияние через нарушение определенных ферментативных реакций или сигнальных путей. В то же время значение такого неблагоприятного генетического фона в развитии заболевания на уровне основных метаболических реакций в клетках остается не ясным, в том числе и при отдельных гистологических типах рака легкого.
Проведение комплексного исследования, включающего изучение метаболических параметров лимфоцитов и опухолевой ткани легкого в зависимости от гистологического типа опухоли и полиморфизма генов, определяющих особенности индивидуальной предрасположенности к развитию опухоли, позволит получить новые сведения о патогенезе рака легкого.
Цель исследования: Установить закономерности нарушений активности НАД(Ф)-зависимьгх дегидрогеназ в лимфоцитах крови и клетках легочной ткани в зависимости от гистологического типа рака легкого и полиморфизма генов GSTM1, GSTT1,pS3vlMTHFR.
Задачи исследования:
Определить рисковую значимость полиморфизмов генов GSTM1, GSTT1, р53 и MTHFR для различных гистологических типов рака легкого.
Оценить активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови в зависимости от гистологического типа рака легкого.
Выявить особенности активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в клетках немалигнизированной и опухолевой ткани легкого в зависимости от гистологического типа рака легкого.
Выявить закономерности метаболизма НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови и клетках опухолевой ткани легкого в зависимости от генетических факторов риска у больных раком легкого.
Научная новизна и теоретическая значимость работы: Для больных раком легкого установлено патогенетическое значение полиморфных генотипов GSTM1, р53 и MTHFR как факторов предрасположенности к раку легкого. Для больных с ПКРЛ и АКЛ легкого установлено рисковое значение генотипа GSTM1 0/0; для больных МКРЛ выявлена значимость генотипа р53 Arg/Pro. Впервые для ПКРЛ установлено патогенетическое значение сочетания генотипов "GSTM1 0/0 - MTHFR С/Т".
Впервые доказано, что лимфоциты больных раком легкого независимо от гистологического типа характеризуются ингибированием гликолиза, нарушением взаимодействий между ЦТК и реакциями аминокислотного обмена, нарушением липидного обмена, а также ингибироваїшем ПФП. Вьивлены нарушения метаболизма лимфоцитов, характерные только для больных МКРЛ: повышение активности аэробной энергетики на фоне недостаточности реакций синтеза аминокислот и оттока ин-термедиатов с аминокислотного обмена на цикл Кребса.
Получены новые данные о закономерностях нарушений активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в легочной ткани у больных раком легкого, в том числе и в зависимости от гистологического типа рака легкого, Опухолевая ткань больных раком легкого отличалась усилением преобразования лактата в гшруват по сравнению с немалигнизированной тканью. В опухолевой ткани больных ПКРЛ установлено повышение переноса продуктов липидного обмена на реакции гликолиза. Метаболизм
опухолевой ткани больных МКРЛ отличался от показателей для ПКРЛ и АКЛ и характеризовался активацией энергетических реакций цикла Кребса и ПФП. Немалиг-низированная ткань больных АКЛ отличалась от показателей активности НАД(Ф)-зависимьгх дегидрогеназ больных ПКРЛ: установлено снижение реакций гликолиза на фоне повышения активности глутатионредуктазы. В опухолевой ткани больных АКЛ наблюдалось ингибирование одного из звеньев антиоксидантной защиты по сравнению с немалигнизированной тканью.
Впервые был проведен нейросетевой анализ активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови, немалигнизированной и опухолевой ткани легкого и определены наиболее информативные ферменты в лимфоцитах крови (МДГ, ГР, НАДФ-ГДГ и НАДН-ЛДГ), немалигнизированной (НАДФ-ГДГ, НАДФ-МДГ, ГЗФДГ, НАДН-ГДГ и ЫАДН-ЛДГ) и опухолевой ткани легкого (НАДФ-МДГ, НАДФ-ГДГ и ГЗФДГ), позволяющие классифицировать различные гистологические типы рака легкого. В немалигнизированной ткани легкого у больных раком легкого доказано неодинаковое распределение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ: в 61% и 19,5% больных АКЛ активность ферментов соответствовала параметрам метаболизма опухолевой ткани больных ПКРЛ и МКРЛ, соответственно; в 14,9% и 15,1% больных ПКРЛ немалигнизированная ткань легкого определялась как опухо левая ткань больных АКЛ и МКРЛ, соответственно.
Впервые для гистологических типов рака легкого установлены закономерности нарушений метаболизма лимфоцитов в зависимости от полиморфизма генов GSTM1, р53 и MTHFR. Для больных АКЛ при генотипе GSTM1 0/0 показано снижение интенсивности аэробных этапов энергетического обмена в лимфоцитах, а также нарушение субстратного потока между ЦТК и реакциями аминокислотного обмена на фоне снижения активности ГР. У больных МКРЛ при генотипе р53 Arg/Pro выявлено усиление субстратного потока по ЦТК. Лимфоциты больных ПКРЛ при сочетании генотипов "GSTM1 0/0 - MTHFR С/Т" характеризовались нарушением переноса продуктов с липидного обмена на реакции гликолиза.
Практическая значимость работы: В результате проведенных исследований получены новые данные о закономерностях метаболических нарушений в лимфоцитах крови и клетках легочной ткани в зависимости от гистологического типа рака легкого и полиморфизма генов GSTMl,p53 и MTHFR.
Комплексное исследование метаболического статуса лимфоцитов, легочной ткани и генетических факторов предрасположенности к раку легкого у больных раком легкого позволяет составить представление о состоянии вігутриклеточньгх процессов в лимфоцитах и ткани легкого в зависимости от гистологического типа рака легкого и полиморфизма генов, что в свою очередь может быть использовано для разработки профилактических и лечебных мер для лиц группы риска.
На основании исследования делеционного полиморфизма гена GSTM1, Arg/Pro-полиморфизма 72 кодона гена р53 и С<577Г-полиморфизма гена MTHFR у пациентов можно выявлять группы риска предрасположенности к раку легкого.
Положения, выносимые на защиту:
1. Полиморфный генотип GSTM1 0/0 ассоциирован с риском развития ПКРЛ и АКЛ; Arg/Pro-генотші гена р53 ассоциирован с риском развития МКРЛ; сочетание генотипов "GSTM1 0/0 - MTHFR С/Т" является фактором риска развития ПКРЛ.
В лимфоцитах крови больных ПКРЛ и АКЛ выявлено сходство нарушений активности НАД(Ф)-зависимых дегадрогеназ. Ферментативный статус клеток иммунной системы у больных МКРЛ отличался от особенностей внутриклеточного метаболизма лимфоцитов больных ПКРЛ и АКЛ повышением активности ИЦЦГ и НАДН-ГДГ.
Установлены закономерности метаболических нарушений в лимфоцитах крови в зависимости от полиморфизма генов: у больных АКЛ при GSTM1 0/0-генотипе снижалась активность ГР, МДГ и НАДФН-ГДГ; у больных МКРЛ при генотипе р53 Arg/Pro наблюдалась активация цикла Кребса; у больных ПКРЛ при сочетании "GSTM1 0/0 -MTHFR С/Т" выявлено снижение активности ГЗФДГ.
Метаболические нарушения в опухолевой ткани легкого различаются у больных с различными гистологическими типами рака легкого: у больных ПКРЛ повышен уровень переноса продуктов липидного катаболизма на реакции гликолиза; у больных МКРЛ выявлено повышение активности Г6ФДГ и НАД-ИЦЦГ; у больных АКЛ снижена активность ГР. Немалигнизированная ткань легкого у больных АКЛ характеризовалась снижением активности НАДН-ЛДГ и ГР по сравнению с показателями ПКРЛ.
Апробация материалов диссертации: Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на X и XI Всероссийских научных конференциях "Экология и проблемы защиты окружающей среды", г. Красноярск (2003,2004); Российской научно-практической конференции "Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии", г. Томск (2004); Ш съезде онкологов и радиологов СНГ, г. Минск (2004); 8-ой международной Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука третьего тысячелетия", г. Пущино (2004); международной школе-конференции молодых ученых "Системная биология и биоинженерия", г. Москва (2005); V съезде Российского общества медицинских генетиков, г. Уфа (2005); межрегиональной научно-практической конференции "Объединение субъектов Российской Федерации и проблемы природопользования в приенисейской Сибири", г. Красноярск (2005); VIII научной конференции с международным участием "Генетика человека и патология", посвященной 25-летию НИИ медицинской генетики Томского научного центра СО РАМН, г. Томск (2007); Ш региональной конференции молодых ученых им. академика РАМН Н.В. Васильева "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии", г. Томск (2008); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, г. Новосибирск (2008); Всероссийской конференции с международным участием "Молекулярная онкология", г. Новосибирск (2008); XIV Всероссийский симпозиум с международным участием "Сложные системы в экстремальных условиях", г. Красноярск (2008); 13 межрегиональная научно-практическая конференция с международным участием "Актуальные проблемы медицины", г. Абакан (2010).
Публикации: Результаты исследования опубликованы в 27 печатных работах, отражающих основные положения диссертации, 6 работ из которых опубликовано в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура диссертации: Диссертационная работа изложена на 154 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, главы с изложением собственных результатов, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Библиогра-
фический указатель включает 223 источников, из них 74 отечественных и 149 зарубежных. Результаты работы отражены в 11 таблицах, 10 приложениях и 11 рисунках.
