Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Особенности течения ибс (острая коронарная недостаточность) у больных с полиморфизмом гена ITGB3
1.1. Острое нарушение коронарного кровотока 12
1.2. Повреждения эндотелия в области атеросклеротической бляшки 16
1.3. Тромбоз в области разрыва или повреждения эндотелия 20
1.4. Спазм коронарной артерии 24
1.5. Роль воспаления в развитии острого коронарного синдрома 24
1.6. Антифосфолипидный синдром 26
1.7. Оксид азота 30
1.8. Структура и функция интегрина 32
1.9. Роль интегрина GPIIb/IIIa в механизме тромбообразования 39
1.10. Влияние мутантного аллеля PLA2 гена GPIIIa на клинику ИБС 41
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1 Клиническая характеристика больных 48
2.2. Методы исследования
2.2.1. Клинические методы исследования 49
2.2.2. Лабораторные методы исследования 49
2.2.3. Инструментальные методы исследования 53
2.2.4. Анализ данных ЭКГ 53
2.2.5. Эндоваскулярные методы исследования 55
2.3. Статистическая обработка данных 56
Глава 3. Результаты и обсуждения собственных исследований
3.1. Анализ частоты встречаемости полиморфизма гена ITGB3 аллель PLA у пациентов с острой коронарной недостаточностью (ОКН) 57
3.2. Характеристика больных по возрасту и полу в группах в зависимости от полиморфизма гена ITGB3 63
3.3. Анализ данных анамнеза по сопутствующим заболеваниям и исходной патологии сердечно - сосудистой системы в зависимости от полиморфизма гена ITGB3 64
3.4. Клинико-лабораторные особенности течения ОКН в зависимости от полиморфизма гена ITGB3 68
3.5. Анализ гемодинамических показателей у больных с полиморфизмом гена ITGB3 74
3.6. Анализ данных ЭХО - кардиографии у пациентов с полиморфизмом гена ITGB3 76
3.7. Анализ лабораторных показателей у пациентов с полиморфизмом гена ITGB3 78
3.8. Анализ данных коронароангиографии у пациентов с полиморфизмом гена ITGB3 82
3.9. Особенности ЭКГ у больных с ОКН в зависимости от полиморфизма гена ITGB3 84
Обсуждение полученных результатов 89
Выводы 95
Практические рекомендации 97
Библиография 98
- Повреждения эндотелия в области атеросклеротической бляшки
- Антифосфолипидный синдром
- Лабораторные методы исследования
- Характеристика больных по возрасту и полу в группах в зависимости от полиморфизма гена ITGB3
Введение к работе
Актуальность проблемы
Заболевания сердечно-сосудистой системы являются серьезной медицинской и
социальной проблемой, что обусловлено, прежде всего, их высокой
распространенностью, тенденцией к росту числа больных и высокой инвалидизацией пациентов. С XX века сердечно- сосудистые заболевания приняли характер эпидемии, охватившей многие высокоразвитые страны. По статистике примерно одна треть смертей в мире приходится на ИБС. Согласно последним данным, опубликованным Американской ассоциацией сердца, смертность от последствий атеросклероза к 2020 году может достичь 60%, несмотря на широкое применение гиполипидемических, антиангинальных и гипотензивных препаратов. Следует отметить, что в нашей стране смертность от сердечно-сосудистых заболеваний приблизительно в 3,5 раза выше, чем в развитых европейских странах. В 2007 году в стране от сердечнососудистых заболеваний умерло 1232182 человека [Демографический ежегодник России, 2008]. Более половины всех смертей, наблюдающихся при ИБС, происходит при острых состояниях, т.е. от острых расстройств коронарного кровообращения [Оганов Р. Г., Масленникова Г. Я., 2000]. Клинически острые расстройства коронарного кровообращения проявляются в виде острого коронарного синдрома или развитием ОИМ с зубцом Q. Основным морфологическим субстратом для развития ОКС или ОИМ является разрыв атеросклеротической бляшки, который отвечает за формирование нестабильного коронарного кровотока и ведет к формированию острой коронарной недостаточности. В патогенезе острых расстройств коронарного кровообращения есть много нерешенных и спорных вопросов, однако считается бесспорным, что почти всегда необратимое повреждение миокарда происходит в результате острого нарушения доставки крови к определенному участку миокарда, что связано с процессами дестабилизации атеросклеротической бляшки с сопутствующим тромбозом и спазмом коронарной артерии. Собственно процессы тромбообразования могут как вести к образованию красного окклюзирующего тромба, обеспечивающего развитие острого инфаркта миокарда, так и сопровождаться активацией только тромбоцитарного звена гемостаза с формированием белого неокклюзирующего тромба, ответственного за обратимые острые коронарные события [Грацианский Н.А., 2005].
С другой стороны, развитие ИБС и особенности течения данного заболевания зачастую обусловлено наследственной предрасположенностью и имеющимися факторами риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Наследственная предрасположенность к ИБС и осложненному течению заболевания наиболее часто вызвана точечными мутациями в геномной ДНК [Samani N.J., Lodwick D. 1997.; Weiss E.J., Bray P.F., Tayback M. et. al., 1996]. Исследование генов-кандидатов, т.е. генов с потенциально большим вкладом в патогенез заболевания, позволяет определить, существуют ли вообще для данной патологии в конкретной популяции предрасполагающие или предохраняющие генетические факторы (маркеры) и можно ли с помощью этих маркеров предсказать развитие болезни и ее осложнений задолго до появления симптомов, т.е. прогнозировать течение заболевания. По данным литературы, предрасположенность к целому ряду осложнений сердечно- сосудистых заболеваний, к которым можно отнести острую коронарную недостаточность, можно рассматривать в ракурсе наличия полиморфизма генов- кандидатов, к которым
относится и ген ITGB3, обеспечивающий синтез интегриновых рецепторов тромбоцитов при необратимой их активации. Учитывая тот факт, что формирование тромба на фоне дестабилизации атеросклеротической бляшки и сопутствующей ей дисфункции эндотелия является ключевым событием в развитии острой коронарной недостаточности, изучение генетических факторов гемостаза представляет несомненный интерес. С этой точки зрения особую значимость имеет изучение полиморфизма гена ITGB3, кодирующего бета- субъединицу интегринового рецептора тромбоцитов.
Интегрины представляют собой семейство гетеродимерных белков, молекула которых состоит из нековалентно связанных а и В — субъединиц, формирующих трансмембранные белки. Ген ITGB3 существует в Европейской популяции в основном в двух вариантах (аллелях) PLA1 и PLA2. Белки PLA1 и PLA2 различаются по своей биологической активности. Полиморфизм гена ITGB3 вызван точечной мутацией, которая приводит к замене лейцина на пролин в 33-м аминокислотном остатке и приводит к изменению свойств белка рецептора. Известно, что наличие мутантного аллеля PLA2 способствует более сильной связи белка-рецептора с фибриногеном. В литературе имеются данные о том, что наличие аллеля PLA2 ассоциировано с риском возникновения инфаркта миокарда [Сироткина О.В., Баженова Е.А., Беркович О.А., Пчелина С.Н., 2004.; Weiss E.J., Bray P.F., Tayback М. et.al., 1996] особенно в молодом возрасте [Пчелина С.Н., Сироткина О.В., Шейдина A.M., и соавт. 2007; Терещенко С.Н., Левчук Н.Н., Дроздов В.Н., 1999]. С другой стороны, по данным литературы, получены сведения о невыявленных различиях в распределении частот аллелей между пациентами с ИМ и контрольной группой [Samani N.J., Lodwick D., 1997].
Наличие противоречивых сведений о влиянии генетических факторов на риск развития ИБС и ее осложнений, предопределяют актуальность проводимого исследования.
Цель исследования: определить влияние мутантного аллеля PLA2 гена ГГОВЗ на механизмы реализации острой коронарной недостаточности (ОКН), изучив возможность использования генотипических характеристик пациента по гену ITGB3 в прогнозировании особенностей течения острой коронарной недостаточности. Задачи исследования:
1. Изучить частоту встречаемости полиморфизма гена ITGB3 у пациентов с
острой коронарной недостаточностью, в зависимости от патофизиологических
механизмов ее реализации (определить частоту встречаемости мутантного аллеля
PLA2 в среднем по группам и отдельно у пациентов с повышенным АД).
2. Изучить особенности преморбидного статуса пациентов и клинико-
лабораторные особенности течения острой коронарной недостаточности, в
зависимости от полиморфизма гена ITGB3.
-
Изучить особенности состояния коронарного русла у больных с ОКН в зависимости от полиморфизма гена ITGB3.
-
Изучить особенности временной организации ЭКГ- сигнала у больных с острой коронарной недостаточностью, в зависимости от полиморфизма гена ГГОВЗ. Научная новизна. Впервые проводится анализ особенностей течения и развития острой коронарной недостаточности в зависимости от механизмов ее формирования (дестабилизация атеросклеротической бляшки, гемодинамическая перегрузка) при
полиморфизме гена ITGB3. Кроме того, учитывая данные литературы о повышенном риске внезапной смерти у пациентов с мутантным аллелем PLA2 гена ITGB3, впервые в данной работе анализируются особенности временной организации ЭКГ- сигнала с использованием энтропийного анализа с целью определения возможностей конкретного влияния данной мутации (Leu 33 Pro) на электрофизиологические особенности миокарда.
Практическая значимость. Проведенное исследование позволяет рекомендовать определение полиморфизма по гену ITGB3 (аллель PLA) у пациентов с обратимыми формами ОКН, с целью выявления дополнительных критериев, определяющих тяжесть течения ОКС и возможность его более частого сочетания с гипертонической болезнью, дислипидемией. Основные положения, выносимые на защиту:
-
Аллель PLA2 гена ITGB3 оказывает влияние на характер течения и особенности реализации атеросклеротического процесса в коронарных артериях сердца. Для пациентов с генотипами PLA1/PLA2 и PLA2/PLA2 характерно множественное поражение коронарных артерий при меньшей степени их стенозирования.
-
Аллель PLA2 гена ITGB3 может быть включен в группу генетических маркеров, определяющих особенности формирования и течения острой коронарной недостаточности.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы в изданиях, входящих в рекомендованный ВАК список. Опубликован тезисный доклад на 10 конгрессе РОХМиНЭ, Санкт-Петербург, 2009 г.
Объем и структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, экспериментальной части с обсуждением результатов, заключения, выводов и списка литературы.
Работа изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц. Список
литературы содержит работ: российских зарубежных авторов.
Повреждения эндотелия в области атеросклеротической бляшки
Атеросклеротическая бляшка является основным элементом атеросклероза. Склонные к разрыву атеросклеротические бляшки имеют большое липидное ядро, тонкую фиброзную покрышку из дезорганизованных коллагеновых волокон, содержат мало гладкомышечных клеток, много макрофагов и высокую концентрацию тканевого фактора. Липидное ядро внутри коллагенового матрикса бляшки формируется из клеточной массы. В формировании липидного ядра играет роль не только пассивное скопление погибших пенистых клеток, но и активное растворение коллагеновых волокон металлопротеиназами. Липидные ядра ранимых бляшек характеризуются высоким содержанием эфиров холестерина с большой долей жирных полиненасыщенных кислот [109]. Наиболее вероятно, что активный разрыв атеросклеротической бляшки обусловлен ослаблением фиброзной капсулы под воздействием протеолитических ферментов, выделяемых макрофагами [86]. В то же время пассивный ее разрыв связан с воздействием механических сил в наиболее слабом месте покрышки бляшки, обычно в месте ее соединения с нормальной стенкой сосуда. Подверженность бляшки разрыву (ее «ранимость») зависит от ее расположения, размера и состава липидного ядра, а также воздействия кровотока на обращенную в просвет сосуда поверхность бляшки. К настоящему времени появление новых высокоинформативных способов прижизненной диагностики ИБС (коронарография, УЗ-коронароскопия) и изучение биоптатов, полученных при направленной атерэктомии, позволили дополнить учение об атеросклеротической бляшке новыми данными [99, 100, 171]. Выявлена значительная гетерогенность бляшек у одного и того же человека, даже полученных из соседних сегментов коронарной артерии [171]. Широкомасштабные исследования показали, что с помощью коронарографии практически невозможно предсказать течение и осуществить прогнозирование ИБС [118, 136, 159, 171]. Новые бляшки, значительно стенозирующие просвет артерии, выявлялись у больных острым коронарным синдромом в тех сегментах, которые не имели стенозов при коронарографии, выполненной достаточно недавно (2-3 месяца) [38, 159]. В связи с этим появилось понятие «стабильная» и «нестабильная» бляшка [14, 33, 49, 102]. От состава и строения бляшки зависит клиническое течение заболевания и развитие осложнений. Показано, что наиболее склонны к разрыву так называемые «молодые» бляшки, богатые липидами, имеющие тонкую покрышку и бедные гладкомышечными клетками [96, 130]. Именно такие разорвавшиеся бляшки, иногда - единичные и нестенозирующие, и выявляются у лиц молодого и среднего возраста с обширными инфарктами или погибших внезапно [33, 89, 95, 101]. Причиной развития острых коронарных синдромов может стать не только разрыв, но и эрозия бляшки. Эрозия бляшек чаще встречается у женщин [51, 52, 54].
В одном из последних исследований обнаружено, что эрозия бляшки встречается в 40% случаев внезапной коронарной смерти и в 25% случаев острого инфаркта миокарда [51, 52, 54]. В случае эрозии тромб прикрепляется к поверхности бляшки, тогда как при разрыве бляшки тромб проникает в более глубокие слои бляшки, вплоть до липидного ядра. Если глубокое проникновение тромба не сопровождается положительным ремоделированием (растяжением сосуда), происходит быстрый рост и прогрессирование бляшки. Фиброзная покрышка бляшки обычно богата коллагеном 1-го типа и выдерживает большое растяжение без разрыва. Фиброзная покрышка представляет собой динамичную структуру, в которой синтез коллагена под действием факторов роста и его деградация под влиянием синтезируемых макрофагами металлопротеиназ находятся в постоянном равновесии. Способствовать ослаблению покрышки бляшки и ее разрыву может также апоптоз гладкомышечных клеток [134]. В патоморфологических исследованиях была выявлена инфильтрация бляшки макрофагами: содержание последних в разорвавшихся бляшках оказалось в 6-9 раз большим, чем в стабильных [151]. Высказывается предположение, что эти клетки вырабатывают металлопротеиназы, расщепляющие внеклеточный матрикс. In vitro макрофаги вызывают разрушение коллагена, взятого из фиброзной покрышки бляшки человека, а ингибиторы металлопротеиназ блокируют этот процесс [140]. Присутствие макрофагов отражает наличие воспалительного процесса, который также характеризуется присутствием в месте разрыва бляшки активированных Т-лимфоцитов. Т-лимфоциты выделяют различные цитокины, стимулирующие макрофаги и приводящие к пролиферации гладкомышечных клеток [27]. Основными морфологическими признаками нестабильной бляшки являются [6, 7, 14, 27, 33, 38, 47, 130, 133,134, 161, 168]: - эксцентричное расположение в просвете артерии; - большое липидное ядро, занимающее более 50% от объема бляшки; - тонкая фиброзная покрышка со сниженным содержанием в ней коллагена; - снижение количества гладкомышечных клеток и их апоптоз; - увеличение содержания макрофагов, Т-лимфоцитов и тучных клеток; - повышение секреции макрофагами матриксных металлопротеиназ; - хронический воспалительный процесс в бляшке. Разрыв бляшки принято называть активным. Возможен также и пассивный разрыв, вызванный воздействием гемодинамических сил и механической «усталостью» капсулы [33, 49, 130]. Данным термином принято обозначать длительный циклический процесс напряжения в плечевых областях покрышки бляшки под влиянием огромного числа периодов растяжения - сжатия (сгибания - разгибания) под действием
Антифосфолипидный синдром
Изучение антифосфолипидных антител (АФЛА) началось еще в 1906 г., когда Вассерманом был разработан серологический метод диагностики сифилиса (реакция Вассермана). В начале 40-х годов было обнаружено, что основным компонентом, с которым реагируют антитела («реагины») в реакции Вассермана, является отрицательно заряженный фосфолипид (ФЛ) кардиолипин. В начале 50-х годов в сыворотках больных системной красной волчанкой (СКВ) обнаружили циркулирующий ингибитор свертывания крови, который был назван волчаночным антикоагулянтом (ВА). Вскоре внимание исследователей привлек тот факт, что при СКВ продукция ВА сопровождается не кровоточивостью, а парадоксальным увеличением частоты тромботических осложнений. Разработка методов радиоиммунологического (1983) и иммуноферментного анализа (ИФА) для определения антител к кардиолипину (АКЛ) способствовала расширению исследований, касающихся роли АФЛА при заболеваниях человека. Оказалось, что АФЛА являются серологическим маркером своеобразного симптомокомплекса, включающего венозные и/или артериальные тромбозы, различные формы акушерской патологии (в первую очередь привычное невынашивание беременности), тромбоцитопению, а также другие разнообразные неврологические, кожные, сердечно-сосудистые, гематологические нарушения. В 1986 г. G. Hughes и соавт. [119] предложили обозначать этот симптомокомплекс как антифосфолипидный синдром (АФС). В 1994 г. на VI Международном симпозиуме по АФЛА было предложено называть АФС синдромом Hughes, по имени английского ревматолога, впервые описавшего его и внесшего наибольший вклад в разработку этой проблемы. Диагностика АФС основана на определенных сочетаниях клинических признаков и титров АФЛА. Выделяют следующие основные формы АФС [26]: - АФС у больных с достоверным диагнозом СКВ (вторичный АФС); - АФС у больных с волчаночно-подобными проявлениями; - первичный АФС; «катастрофический» АФС (острая диссеминированная коагулопатия/васкулопатия) с острым мультиорганным тромбозом; другие микроангиопатические синдромы (тромботическая тромбоцитопеническая пурпура/гемолитикоуремический синдром); HELLP синдром (гемолиз, повышение активности печеночных ферментов, снижение содержания тромбоцитов, беременность); ДВС- синдром; гипопротромбинемический синдром; - серонегативный АФС. Течение АФС, тяжесть и распространенность тромботических осложнений непредсказуемы и в большинстве случаев не коррелируют с изменением титров АФЛА и активностью СКВ (при вторичном АФС). У одних больных АФС проявляется преимущественно венозными тромбозами, у других - инсультом, у третьих - акушерской патологией или тромбоцитопенией.
Полагают, что примерно половина больных АФС страдает первичной формой заболевания. Однако вопрос о нозологической самостоятельности первичного АФС до конца не ясен. Имеются данные о том, что первичный АФС иногда может быть вариантом начала СКВ. Наоборот, у некоторых больных с классической СКВ в дебюте в дальнейшем на первый план могут выходить признаки АФС. Распространенность АФС в популяции неизвестна. АКЛ обнаруживаются в сыворотке у 2-4% (в высоком титре - менее чем у 0,2% пациентов), чаще пожилого, чем молодого возраста. АФЛА иногда обнаруживаются у больных воспалительными, аутоиммунными и инфекционными заболеваниями (ВИЧ инфекция, гепатит С и др-) у пациентов со злокачественными новообразованиями, на фоне приема лекарственных препаратов (оральные контрацептивы, психотропные средства и др.)- Заболевание чаще развивается в молодом возрасте, чем в пожилом, описано у детей и даже у новорожденных. В общей популяции АФС чаще выявляется у женщин. Однако среди больных первичным АФС отмечается увеличение доли мужчин [45]. Клинические проявления АФС развиваются у 30% больных с В А и у 30 -50% больных, имеющих умеренный или высокий уровень IgG и АКЛ. АФЛА обнаружены у 21% больных молодого возраста, перенесших ИМ, и у 18 - 46% перенесших инсульт, у 12 - 15% женщин с рецидивирующими спонтанными абортами, примерно у трети больных СКВ. В случае обнаружения АФЛА при СКВ риск развития тромбозов увеличивается до 60-70%, а при их отсутствии -снижается до 10-15%. Причины АФС неизвестны. Повышение уровня (как правило, транзиторное) АФЛА наблюдается на фоне широкого спектра бактериальных и вирусных инфекций, но тромботические осложнения у больных с инфекциями развиваются редко. Это определяется различиями в иммунологических свойствах АФЛА у больных АФС и инфекционными заболеваниями. Тем не менее, предполагают, что развитие тромботических осложнений в рамках АФС может быть связано с латентной инфекцией. Отмечено повышение частоты обнаружения АФЛА в семьях больных АФС, описаны случаи АФС (чаще первичного) у членов одной семьи и определенная связь между гиперпродукцией АФЛА и носительством некоторых антигенов главного комплекса гистосовместимости, а также генетическими дефектами комплемента. АФЛА - гетерогенная популяция антител, реагирующих с широким спектром фосфолипидов и фосфолипидсвязывающих белков. Взаимодействие АФЛА с фосфолипидами представляет собой сложный феномен, в реализации которого важную роль играют так называемые кофакторы. Установлено, что АКЛ связываются с кардиолипином в присутствии «АКЛ кофактора», который был идентифицирован как Ь2-гликопротеин I (Ь2-ГШ). Ь2-ПП - гликопротеин с мол. массой 50 кД, присутствующий в нормальной плазме в концентрации примерно 200 мкг/мл и циркулирующий в ассоциации с липопротеинами (он также обозначается как аполипопротеин Н). Он обладает естественной антикоагулянтной активностью. Антитела, присутствующие в сыворотке больных АФС, на самом деле распознают антигенные детерминанты не анионных фосфолипидов (кардиолипин), а конформационные эпитопы («неоантиген»), формирующиеся в процессе взаимодействия Ь2-ГГЯ с фосфолипидами. Напротив, в сыворотке больных инфекционными заболеваниями присутствуют главным образом антитела, реагирующие с фосфолипидами в отсутствие Ь2-ГШ [44]. АФЛА обладают способностью перекрестно реагировать с компонентами сосудистого эндотелия, включая фосфатидилсерин (анионный фосфолипид) и другие отрицательно заряженные молекулы (сосудистый гепарансульфат протеогликана, хондроэтинсульфатный компонент тромбомодулина). АФЛА подавляют синтез простациклина клетками сосудистого эндотелия, стимулируют синтез фактора Виллебранда, индуцируют активность тканевого фактора эндотелиальными клетками (ЭК), стимулируют прокоагулянтную активность, ингибируют гепаринзависимую активацию антитромбина III и гепаринопосредованное образование антитромбин III - тромбинового комплекса, усиливают синтез фактора активации тромбоцитов ЭК. Предполагается, что особенно важную роль в процессе взаимодействия АФЛА и ЭК играет Ы-ГГД. Ь2 - ГШ - зависимое связывание АФЛА и ЭК приводит к активации эндотелия (гиперэкспрессии клеточных молекул адгезии, увеличению прилипания моноцитов к поверхности эндотелия), индуцирует апоптоз ЭК, что, в свою очередь, увеличивает прокоагулянтную активность эндотелия. Мишенью для АФЛА могут являться отдельные белки,
Лабораторные методы исследования
Проводилось полное клиническое обследование всех больных, включающее в себя: осмотр, сбор коронарного анамнеза с учетом наличия существующей гипертонической болезни, длительности течения ИБС и перенесенного в прошлом инфаркта миокарда, гиперлипидемии, нарушений сердечного ритма и проявлений недостаточности кровообращения. Также при сборе анамнестических данных учитывалось наличие сопутствующих заболеваний: сахарного диабета, ОНМК, патологии щитовидной железы, онкозаболеваний, тромбоэмболические осложнения и др. На протяжении всего периода исследования проводилось наблюдение за общим состоянием пациентов: наличие субъективных жалоб на фоне проводимого лечения, оценивалась переносимость физических нагрузок, оценивались гемодинамические показатели - артериальное давление, ЧСС. Также за время наблюдения осуществлялась регистрация ЭКГ и лабораторных показателей в динамике. Получение ДНК осуществлялось из клеток периферической крови, собранной методом сухой капли на бумажный фильтр размером 30x20 мм с использованием набора «Цитолизин» (Россия) по прилагаемой к набору методике. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием термоциклера "Trepsonal" (Биометра, Германия) и «ДНК-технология» ( Россия). Набор праймеров для амплификации ДНК - мишени проводили на основе программы «Praimer 3» с использованием нуклеотидной последовательности гена GPIIIA ( асе. М32672), приведенной в базе данных Genbank. Постановка полимеразной цепной реакции и анализ продуктов ПЦР. 1-й этап амплификация участка геномной ДНК. Промаркировать амплификационные пробирки для клинических образцов. (+) и (-) контролей; в одноразовых перчатках чистыми ножницами вырезать кусочек пятна крови размером 2 мм на 1,5 мм и внести в соответствующую амплификационную пробирку, используя пинцет (пинцет и ножницы обрабатывать 70% этиловым спиртом, каждый раз полностью их высушивая); выставить пробирки с анализируемым материалом в штатив. Приготовленную реакционную смесь тщательно перемешать; в пробирки амплификационные с анализируемыми образцами внести 50 мкл .приготовленного супермикса; в каждую пробирку капнуть по одной капле (около 25 мкл) вазелинового масла и плотно закрыть; перенести пробирки в прогретый до 95С программируемый амплификатор и провести амплификацию по программе состоящей из 35 циклов при следующих условиях каждого из циклов: 95С - 40 сек, 60С --30 сек, 72С 90 сек.
При окончании амплификации пробирки с амплификатом центрифугировали на оборотах 13,4 об/мин в течение 2 минут. Далее пробирки выставить в штатив, вторым и третьим рядом поставить чистые пробирки и промаркировать соответственно пробиркам первого ряда; из-под масла отобрать 37 мкл амплификата, не касаясь дна и кусочка ватмана, и перенести в чистую пробирку второго ряда. Далее из пробирок второго ряда взять 7 мкл амплификата и внести в пробирки третьего ряда. В каждую пробирку 3 ряда добавить по 5 мкл краски для электрофореза и провести электрофорез в агарозном геле с целью проверки результатов амплификации. 2-й этап — рестрикция. В пробирки второго ряда внести этиловый спирт 96% по ПО мкл, перемешать на Vortex в течение 1 сек, после чего поместить пробирки в морозильную камеру (t = - 18-20С) на ночь. Достать пробирки из морозильной камеры и центрифугировать на максимальных оборотах в течение 15 минут; удалить наконечником 125 мл надосадочной жидкости, к осадку добавить 90 мкл этилового спирта и центрифугировать в течение 5 минут на максимальных оборотах. Открытые пробирки перенести в термостат, прогретый до температуры 65С. Сушить не более 5 минут. Растворить осадок ДНК добавлением 10, 5 мкл деионизированной воды. Через 15 минут раствор ДНК готов для рестрикции. В подготовленные образцы внести по 10 мкл реакционной смеси для рестрикции (вода деионизированная 7 мкл, рестриктаза 1 мкл, 10 буфер для рестрикции). Аккуратно перемешать. Поставить пробирки в термостат при t=37C и провести рестрикцию в течение 2—2,5 часов. По окончании рестрикции добавить в каждую пробирку по 5 мкл краски для электрофореза. 3-й этап - электрофоретический анализ результатов амплификации.
Характеристика больных по возрасту и полу в группах в зависимости от полиморфизма гена ITGB3
В дальнейшем при исследовании аллельного распределения гена ITGB3 пациенты с острой коронарной недостаточностью, когда это не противоречило логике исследования, были распределены на две группы: первая группа — гомозиготы PLA1/PLA1 (67,2%) и вторая группа - гомо- и гетерозиготы по аллелю PLA2 (32,7%). Выявленные носители гомозиготного генотипа PLA2/PLA2 (3 человека) с учетом их малочисленности были включены во вторую группу. Принимая во внимание тот факт, что частота формирования и развития всех клинических форм ИБС зависит от пола и возраста пациентов, нами был проведен анализ на однородность групп по изучаемым показателям. Включенные в исследование больные существенно не отличались по полу и возрасту, что позволяет нам выявленные далее отличия связывать собственно с генотипом, а не с разницей в поло-возрастном составе в анализируемых группах (таблицы 3,4). Предпосылками для проведения анализа стали литературные данные, свидетельствующие о влиянии полиморфизма изучаемого гена на формирование и развитие беременности, вероятности развития акушерского кровотечения, инфекции мочевыводящих путей, нарушения мозгового кровообращения, склонности к инвазивному росту при онкологических процессах [8, 13, 19, 41, 65]. В таблице 5 представлены частоты встречаемости общесоматических заболеваний и патологии сердечно-сосудистой системы на основе анализа анамнестических данных. На основании полученных данных можно утверждать, что у пациентов с ОНК, которые являются носителями мутантного аллеля PLA2 гена ITGB3, достоверно чаще встречаются в анамнезе острое нарушение мозгового кровообращения, онкозаболевания. Из проявлений сердечной патологии чаще наблюдаются признаки сердечной недостаточности, достоверно чаще проводилась хирургическая коррекция состояния коронарного русла. Пациенты с гомозиготным генотипом PLA1/PLA1 имеют достоверно более частое упоминание в анамнезе о желчекаменной боле%). Выявленные носители гомозиготного генотипа PLA2/PLA2 (3 человека) с учетом их малочисленности были включены во вторую группу. Принимая во внимание тот факт, что частота формирования и развития всех клинических форм ИБС зависит от пола и возраста пациентов, нами был проведен анализ на однородность групп по изучаемым показателям. Включенные в исследование больные существенно не отличались по полу и возрасту, что позволяет нам выявленные далее отличия связывать собственно с генотипом, а не с разницей в поло-возрастном составе в анализируемых группах (таблицы 3,4). Предпосылками для проведения анализа стали литературные данные, свидетельствующие о влиянии полиморфизма изучаемого гена на формирование и развитие беременности, вероятности развития акушерского кровотечения, инфекции мочевыводящих путей, нарушения мозгового кровообращения, склонности к инвазивному росту при онкологических процессах [8, 13, 19, 41, 65].
В таблице 5 представлены частоты встречаемости общесоматических заболеваний и патологии сердечно-сосудистой системы на основе анализа анамнестических данных. На основании полученных данных можно утверждать, что у пациентов с ОНК, которые являются носителями мутантного аллеля PLA2 гена ITGB3, достоверно чаще встречаются в анамнезе острое нарушение мозгового кровообращения, онкозаболевания. Из проявлений сердечной патологии чаще наблюдаются признаки сердечной недостаточности, достоверно чаще проводилась хирургическая коррекция состояния коронарного русла. Пациенты с гомозиготным генотипом PLA1/PLA1 имеют достоверно более частое упоминание в анамнезе о желчекаменной болезни, язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки. С целью выявления особенностей течения ИБС в зависимости от генотипа у всех пациентов проведен анализ базовой терапии, применяемой вне обострения заболевания (таблица 6), и число применяемых групп препаратов (таблица 7). Под понятием «базовая терапия» подразумевается объем лекарственных средств, необходимых для поддержания рабочих цифр АД, снижения или прекращения приступов стенокардии. Оценивались основные группы антиангинальных и гипотензивных препаратов, а также объем комбинированной терапии вне обострения ИБС. Up —аргумент нормального распределения при угловом преобразования Фишера на уровне одностороннего критерия: р 0,05 и двустороннего критерия:р 0,025. На основании данных из таблицы 6 можно утверждать, что объем базовой терапии (потребность в приеме нитратов, (3- адреноблокаторов, антагонистов кальция, ингибиторов АПФ) у носителей аллеля PLA2 гена ITGB3 выше, чем у пациентов из первой группы. У пациентов - носителей гомозиготного генотипа PLA1/PLA1 гена ITGB3 в качестве базового лечения преобладала терапия из одной или комбинация из двух групп препаратов. Пациенты с гетеро- и гомозиготными генотипами по аллелю PLA2 гена ITGB3 в качестве базовой терапии назначалось лечение из трех и более групп лекарственных препаратов зни, язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки. С целью выявления особенностей течения ИБС в зависимости от генотипа у всех пациентов проведен анализ базовой терапии, применяемой вне обострения заболевания (таблица 6), и число применяемых групп препаратов (таблица 7). Под понятием «базовая терапия» подразумевается объем лекарственных средств, необходимых для поддержания рабочих цифр АД, снижения или прекращения приступов стенокардии. Оценивались основные группы антиангинальных и гипотензивных препаратов, а также объем комбинированной терапии вне обострения ИБС. Up —аргумент нормального распределения при угловом преобразования Фишера на уровне одностороннего критерия: р 0,05 и двустороннего критерия:р 0,025. На основании данных из таблицы 6 можно утверждать, что объем базовой терапии (потребность в приеме нитратов, (3- адреноблокаторов, антагонистов кальция, ингибиторов АПФ) у носителей аллеля PLA2 гена ITGB3 выше, чем у пациентов из первой группы. У пациентов - носителей гомозиготного генотипа PLA1/PLA1 гена ITGB3 в качестве базового лечения преобладала терапия из одной или комбинация из двух групп препаратов. Пациенты с гетеро- и гомозиготными генотипами по аллелю PLA2 гена ITGB3 в качестве базовой терапии назначалось лечение из трех и более групп лекарственных препаратов, в то время как монотерапия не использовалась совсем.
