Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные аспекты патогенеза гемокоагуляционных осложнений (обзор литературы) 13
1.1. Современные аспекты прогнозированя гемокоагуляционных нарушений 13
1.2. Молекулярно-генетические аспекты гемостаза 18
1.3. Заключение 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования...
2.1. Общая характеристика клинического материала 33
2.2. Методы исследования
2.2.1. Клинические методы исследования 35
2.2.2. Лабораторные методы исследования 35
2.2.3. Методы статистической обработки результатов 40
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 41
3.1. Распространенность SNP гена IL- 2 (Т330G), гена IL- 10 (С819Т, G1082A) 41
3.1.1. Распространенность мутаций IL- 2 (Т330G) 41
3.1.2. Распространенность полиморфизма гена IL-10 (G1082A) 44
3.1.3. Распространенность полиморфизма гена IL-10 (С819Т) 47
3.1.4. Относительный риск возникновения тромботических осложнений у носителей аномальных аллельных вариантов генов IL-2 (Т330G), гена IL-10 (С819Т, G1082A) при политравме 50
3.1.5. Показатели концентрации цитокинов у пациентов с политравмой 51
3.2. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у пациентов с политравмой 53
3.3. Распространенность протромботических мутаций: V фактора Leiden 1691А, протромбина G20210A, MTHFR C677T 59
3.3.1. Распространенность SNP гена фактора V Leiden (G1691А). 59
3.3.2. Распространенность SNP гена протромбина (G20210A) у больных с политравмой 63
3.3.3. Распространенность SNP гена метилентетрагидрофолатредуктазы (С677Т) у
пациентов с политравмой 66
3.3.4. Распространенность сочетаний протромботических мутаций 69
3.3.5. Относительный риск возникновения тромботических осложнений у носителей аномальных аллельных вариантов генов V фактора Leiden 1691А, протромбина G20210A, MTHFR C677T 70
3.3.6. Показатели гемостаза 70
3.4. Регрессионная многофакторная модель 73
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 78
Заключение 93
Выводы 94
Список сокращений 96
Список литературы .
- Молекулярно-генетические аспекты гемостаза
- Лабораторные методы исследования
- Показатели концентрации цитокинов у пациентов с политравмой
- Относительный риск возникновения тромботических осложнений у носителей аномальных аллельных вариантов генов V фактора Leiden 1691А, протромбина G20210A, MTHFR C677T
Молекулярно-генетические аспекты гемостаза
Термин тромбоз (греч. Thromboo – свертываю) был введен еще Галеном более 4000 лет назад. Впервые же четкое представление о тромбозе как о внутрисосудистом свертывании крови, ведущем к закупорке кровеносного сосуда, было сформулировано Р. Вирховым (1859 г.). Согласно его триаде, тромбоз является следствием одного или комбинации трех основных факторов, к которым относят: повреждение сосудистой стенки, гиперкоагуляцию и венозный стаз.
Актуальность проблемы тромбоэмболических осложнений в травматологии не вызывает сомнений [68, 69, 70, 115, 118, 119, 121, 151]. Адекватное состояние системы гемостаза обеспечивается равновесным действием свртывающих, противосвртывающих и фибринолитических механизмов [121]. Известно, что в результате травмы происходит повреждение внутреннего слоя сосудистой стенки. В свою очередь, выделение большого количества тканевого фактора запускает процесс свртывания крови [92, 121]. Дефект эндотелия может возникнуть и опосредованно, вследствие гипоксии. Повреждения тканей запускают механизм системной воспалительной реакции, при котором выделяющиеся оксиданты вызывают гибель клеток эндотелия [77, 121]. Массивные разрушения, возникающие при политравме, приводят к гиперкоагуляционному сдвигу системы гемостаза. Угроза развития венозных тромбоэмболических осложнений продолжает существовать достаточно длительное время, чему способствуют недостаточная подвижность больного в первые дни травматической болезни, а также различные сопутствующие заболевания, сопровождающиеся нарушениями в системе гемостаза [82, 84, 201]. На современном этапе общепризнана роль лейкоцитов в процессе нарушения реологических свойств крови. При различных патологических процессах увеличивается их адгезия к эндотелию, склонность образовывать коагрегаты с тромбоцитами и эритроцитами.
Существенную роль в развитии венозных тромбозов играют нарушения реологических свойств крови - повышение е вязкости, высокие показатели гематокрита, уровня гемоглобина, эритроцитов и тромбоцитов, резкое ускорение скорости оседания эритроцитов (СОЭ), повышение уровня фибриногена и др. [103, 105]. Сдвиги в тромбоцитарно-сосудистом взаимодействии, проявляющиеся в усилении адгезивности тромбоцитов и чувствительности их к механическому стрессу, опосредованные повышенным уровнем фактора Виллебранда и фибриногена, и связанные с кальцием, являются компонентами развития тромбозов [4, 101, 165].
К настоящему времени существует множество способов прогнозирования развития тромботических осложнений в хирургии. Так, известен способ, основанный на определении вязкости крови общего кровотока и сосудов дна матки, основанный на диагностике микроциркуляторных и гемореологических нарушений при доброкачественных опухолях в раннем послеоперационном периоде. Вязкость крови из сосудов дна матки сравнивают с вязкостью крови из общего кровотока и с нормальным показателем вязкости при заданной скорости течения крови. При повышении вязкости из сосудов матки и общего кровотока, по сравнению с нормой, прогнозируют угрозу тромбоэмболических осложнений, а при уменьшении значений вязкости крови из сосудов матки и общего кровотока, по сравнению с нормой - возможность возникновения геморрагических состояний. Однако, данный метод недостаточно точен, поскольку определяет только физические свойства крови (вязкость) и не учитывает показатели свртывающей системы крови и микроциркуляторного русла, как основных параметров тромбообразования [104].
Известен метод прогнозирования срока возможного возникновения тромбоэмболии лгочной артерии в послеоперационном периоде [143]. Данный способ основан на определении гемокоагуляционного потенциала. При этом анализируют показатели системы свртывания крови, объема кровопотери и инфузионной терапии. С помощью формулы определяют время (Т) возможного начала развития тромбоэмболии лгочной артерии (в часах). Т = -0,81F + 0,03 Ш±1) _ 0,13W fa , где Т - время возможного образования тромбоэмболии лгочной артерии, ч; V - объем инфузионной терапии, мл; W объем операционной кровопотери, мл; t - время рекальцификации плазмы, мин; i протромбиновый индекс; f - количество фибриногена, мг/л; а - возраст больного, год. Юшковым А.Г. (2008) разработан метод прогнозирования тромбоэмболических осложнений при эндопротезировании крупных суставов нижних конечностей [165], основанный на определении уровня микроциркуляторного кровотока в динамике до операции и в раннем послеоперационном периоде. Показано, что прогнозирование развития тромбоэмболических осложнений возрастает при повышении уровня фонового микроциркуляторного кровотока в послеоперационном периоде в проекции сосудистого пучка паховой области более 120% от дооперационного уровня, при снижении уровня фонового микроциркуляторного кровотока в средней трети бедра и средней трети голени более чем на 20% от дооперационного уровня, при снижении уровня фонового микроциркуляторного кровотока на первом пальце стопы более чем на 10% от дооперационного уровня; при снижении микроциркуляторного кровотока на оперируемой конечности в послеоперационном периоде при проведении пробы с задержкой дыхания более чем на 60% от дооперационного уровня; при отсутствии снижения максимального кровотока на оперируемой конечности в послеоперационном периоде при проведении постокклюзионной пробы, при уровне максимального кровотока после окклюзии ниже 6 мл/мин/100 г при постокклюзионной пробе, при достижении максимального кровотока после окклюзии на второй минуте, времени достижения максимального кровотока более 45 с в до- и послеоперационном периодах, при среднем приросте максимального кровотока менее 0,5 в до- и послеоперационном периодах, при снижении времени полувосстановления в послеоперационном периоде более чем на 15% по сравнению с дооперационным уровнем. При этих условиях прогнозируют развитие тромбоэмболических осложнений. Данный способ основан на исследовании состояния кровенаполнения сосудистого русла, что является недостаточно точным, поскольку не учитывается состояние свртывающей системы крови, как основного показателя тромбообразования [39, 104, 162].
Лабораторные методы исследования
Для выявления резистентности Va фактора к протеину С использовали одну из модификаций общепринятого метода, основанную на определении у больных и в контроле степени удлинения активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) бедной тромбоцитами плазмы (БТП) при введении в тест-систему активированного протеина С. Для получения последнего в нормальную БТП, предварительно лишенную фактора V, но содержащую нормальное количества протеинов С, S и АТ-III, вводили активатор протеина С из яда змеи Agkistrodon contortrix, который в фирменных диагностических наборах обозначается как Protac.
Положительным результатом считали пробы с NR менее 0,8. При уменьшении последнего в пределах от 0,8 до 0,5 считали как выраженную резистентность к протеину С, а ниже 0,5 как тяжелую (чаще всего гомозиготная) резистентность к протеину С. В норме NR варьирует в пределах от 0,8 до 1,14. У всех больных при положительном результате это исследование повторяли 2-3 раза и учитывали как признак патологии при стабильном выявлении нарушения активации фактора Va. В случае приема больными антикоагулянтов непрямого действия последние отменялись и исследования повторялись дважды с интервалом в 1 месяц при полной нормализации международного нормализованного отношения (NR). Оценка лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА)
Свежую гепаринизированную кровь обследуемых больных наслаивали на градиент урографин-фикол (плотность 1,077) и выделяли лимфоциты. Собирали интерфазное кольцо, содержащее клетки и кровяные пластинки, однократно промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3-4 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок микроскопировали в камере Горяева. Подсчитывали число лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов на 100 клеток. Степень адгезии определяли как число кровяных пластинок, адгезированных на поверхности одного лимфоцита (Витковский Ю.А. и соавт., 1999; Солпов А.В., 2005). Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Забор крови осуществляли из кубитальной вены в вакутейнер с 3,8% цитратом в объеме 5,0 мл. Выделение ДНК осуществлялось при помощи набора реагентов для биологических проб (НПФ «Литех», Россия, Москва). Выявление мутаций проводилось методом ПЦР с аллель-специфичными праймерами (НПФ «Литех» - «SNP-экспресс», Россия, Москва). Детекция продуктов амплификации осуществлялась электрофоретическим способом.
Выделение ДНК
ДНК выделяли из цельной крови. Пробирки с материалом размораживали при комнатной температуре, тщательно перемешивали на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 10 секунд, помещали в предварительно прогретый до +98оС твердотельный термостат на 10 минут. Затем пробирки извлекали и центрифугировали при 12000об/мин в течение 15 секунд. Получаемый таким путем супернатант содержал раствор ДНК.
Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Для проведения реакции амплификации из наборов реагентов «SNP-экспресс» готовилась рабочая реакционная смесь из расчета на 1 пробу: 17,5 мкл разбавителя, 2,5 мкл реакционной смеси, 0,2 мкл Taq-полимеразы. При этом для каждого образца ДНК готовились две реакционные смеси – «норма» и «патология». Пробирки для амплификации маркировались соответственно образцам. В каждую пробирку добавлялось по 20 мкл готовой рабочей смеси и 5 мкл раствора ДНК в соответствии с маркировкой. Реакция амплификации проводилась в программируемом термостате – амплификаторе (ООО «Бис» Россия, Новосибирск) по следующей программе:
Разделение продуктов ПЦР осуществлялось методом горизонтального электрофореза. Для этого использовался 3% агарозный гель, карманы которого заполнялись амплификатом, полученным на предыдущем этапе. Гель помещали в электрофоретическую камеру («Helicon», Россия, Москва) на 10-15 минут, где задавалось напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/см геля. При этом происходило разделение продуктов амплификации в направлении от катода к аноду. По окончании электрофореза гель извлекался из камеры и помещался на стекло УФ-трансиллюминатора, затем проводилось фотографирование фрагментов анализируемой ДНК, выявляемых в виде светящихся полос. Данная методика позволяла сделать три типа заключений: нормальная гомозигота, гетерозигота, мутантная гомозигота.
Показатели концентрации цитокинов у пациентов с политравмой
Проблема тромбоэмболических осложнений является ключевой в структуре летальности заболеваний, в особенности, в травматологии. Мы сосредоточили свое внимание на гемокоагуляционных нарушениях при политравме и попытались объяснить индивидуальную реактивность системы гемостаза с молекулярно-генетических позиций.
Известно, что нормальная реакция системы гемостаза зависит от состояния сосудистой стенки, тромбоцитов, соотношения активирующих и ингибирующих компонентов свертывания крови и фибринолиза [39, 40, 232, 249]. Гемостаз, взаимодействуя с другими защитными системами, обеспечивает поддержание циркулирующей крови в жидком состоянии в сосудистом русле, а также предотвращает развитие кровотечения при повреждении сосудов. Любые отклонения в соотношении компонентов, в частности, любые нарушения функциональной интеграции эндотелия и определенных компонентов, включенных в механизмы биомодуляции, биоамплификации, биоаттенуации или функциональной интеграции фибринолитического звена, могут индуцировать состояние гиперкоагуляции и целый спектр тромботических или геморрагических осложнений [25, 34, 35, 38, 44, 106, 108, 110, 217].
Особое место в регуляции системы гемостаза занимают иммунные механизмы. Еще в начале прошлого века было известно, что в процессе свертывания крови участвуют лейкоциты. В связи с развитием современной иммунологии стали накапливаться факты, свидетельствующие о том, что основными клетками, принимающими участие в иммунном ответе, являются лимфоциты и макрофаги. Однако, только в 1981 году Б.И.Кузник и Н.Н.Цыбиков представили первые данные, подтверждающие наличие иммунного механизма регуляции свертывания крови и фибринолиза [73, 74, 75, 76, 77, 158, 159]. В свете новых представлений о структурно-функциональной организации системы гемостаза описаны клеточные и молекулярные взаимоотношения с иммунной системой, признанной на современном этапе развития биологии в качестве важнейшего ее регулятора [34, 35, 74, 77, 78, 81, 215, 216].
В 90-х годах ушедшего столетия Ю.А. Витковский изучил роль медиаторов иммунного ответа – цитокинов в опосредованной клетками регуляции системы гемостаза в норме, а также исследовал потенциальную роли провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в развитии гиперкоагуляции и ДВС-синдрома при различных патологических состояниях. Установлено, что иммунитет, гемостаз и неспецифическая резистентность организма выступают как единая интегральная клеточно-гуморальная система защиты [73, 74, 75, 76, 77, 78]. Изменения, возникающие в одном из функциональных звеньев в этой системе, обязательно приводят к сдвигам в других. Сигнальными молекулами, объединяющими функционирующие единицы, являются цитокины[154, 155, 156, 166]. Эти соединения вызывают адекватные ответные реакции со стороны иммунитета, гемостаза и неспецифической резистентности, направленные на поддержание постоянства внутренней среды организма в норме, а также характеризуют развитие патологического процесса [24, 26, 28, 34, 38, 130, 131, 138, 139, 140].
Влияние цитокинов на систему гемостаза широко изучается при многих патологических состояниях, однако эти исследования не касаются генетического полиморфизма медиаторов иммунного ответа.
Мы изучили единичный нуклеотидный полиморфизм (SNP) у пациентов с политравмой и ограничились лишь двумя интерлейкинами – IL-2 и IL-10. Наше внимание привлекли эти цитокины по следующим причинам. Как показали в своих работах Ю.А. Витковский и соавт., один из них – IL-2 вызывает клеточно-опосредованную гиперкоагуляцию, а другой – IL-10 – гипокоагуляцию [26, 27, 29, 32, 34, 38, 106]. Мы посчитали, что их совместное влияние может сказаться на реакциях системы гемостаза у лиц с различным носительством полиморфных маркеров не только цитокинов, но и протромботических мутаций, определяющих готовность организма к тромбообразованию – тромбофилии. Мы установили, что при политравме в случае развития осложнений чаще встречается аллель T и генотип Т/Т полиморфизма гена IL-2 (T330G). Более того, проследили концентрацию IL-2 у пациентов с политравмой в зависимости от генотипа SNP гена IL-2 (T330G) и наличия тромбоэмболических осложнений, и обнаружили, что наибольшая концентрация IL-2 выявлялась у носителей гомозиготного варианта T/T. При наличии осложнений у пациентов с этим генотипом содержание IL-2 в крови оказалось наибольшим. В ходе исследований, проведенных в лаборатории Ю.А. Витковского, установлено, что IL-2, совместно с другими провоспалительными цитокинами, усиливает гиперкоагуляцию благодаря изменению активности иммунокомпетентных клеток. У пациентов при политравме существенно возрастала концентрация IL-ip, IL-8 и TNFoc. Известно, что IL-1 является ключевым триггером гиперкоагуляции. Он воздействует на эндотелиальные клетки, макрофаги/моноциты, клетки Купфера, клетки Лангерганса, астроциты, экспрессирующие тканевой фактор. Таким же стимулирующим действием на экспрессию тканевого фактора клетками обладают IL-8 и TNFoc [26, 27, 34, 184].
В соответствии с данными Ю.А. Витковского, IL-lp проявляет лимфоцит-опосредованное действие на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз, свертывание крови и фибринолиз. Установлено, что IL-ip при образовании кровяного сгустка тормозит образование протеина С, а і-антитрипсина, а2-макроглобулина и активирует фибринолиз. Такое разнообразное действие IL-ip зависит прежде всего от микроокружения, в котором пребывают клетки-продуценты указанных соединений. Несомненным является то, что ведущими информационными факторами в этих реакциях служат молекулы IL-ip, поскольку предварительная обработка культуры МонАТ против данного цитокина изменяла течение реакций [34]. Им установлено, что в культуре сгустка крови, к которой добавлялись IL-lp, IL-2 и IL-8, обнаружено снижение продукции аутоантител к тканевому фактору, что усиливает петлю гиперкоагуляции.
Относительный риск возникновения тромботических осложнений у носителей аномальных аллельных вариантов генов V фактора Leiden 1691А, протромбина G20210A, MTHFR C677T
Мы обнаружили, что у пациентов с политравмой встречаемость аллели А SNP фактора V (G1691A) (Leiden) существенно выше в группе с тромбоэмболическими осложнениями, чем в группе без таковых. Следует отметить, что в основном выявлялось носительство аллели А в гетерозиготном варианте. Гомозиготное носительство A/A выявлено только в одном случае.
Своими наблюдениями мы подтвердили принятые взгляды на то, что при APC-R типичным является развитие венозной тромбоэмболии и тромбоза. Некоторые авторы рассматривают APC-R как более легкую патологию, чем другие дефекты антитромбинового звена гемостаза [91, 227].
Следующая протромботическая мутация, которую мы проследили у пациентов – SNP гена FII (протромбин G20210A). Оказалось, что встречаемость аллели А среди пациентов с тромбоэмболическими осложнениями политравмы выше, чем в группе без осложнений.
Из литературных источников известно, что аллель А SNP гена FII (протромбин G20210A) обуславливает постоянно высокий уровень протромбина в плазме [212, 224, 241, 242]. (рис. 4.3). Аномалия, обусловленная перемещением гуанина на место аденина в 20210 нуклеотиде, локализована в 3/-концевой части гена и не изменяет полипептидной цепи протромбина, но повышает стабильность его м-РНК и, соответственно, уровень белка в плазме [240, 241].
Мы определили относительный риск развития тромбоза с мутацией гена протромбина. У пациентов с осложнениями при политравме он оказался 3,9, что совпадает с данными Vicente V. et. al. [242], показавшего, что при нуклеотидной замене GA в гене фактора II возникновение венозного тромбоза возрастает в 3 раза. s.
Роль полиморфизма фактора II (протромбина) в развитии тромбоза. Следующая мутация, которую мы изучили у пациентов с политравмой – это SNP гена фермента метилентетрагидрофолатредуктазы. Считается, что гипергомоцистеинемия является независимым и существенным фактором риска в развитии артериальных и венозных тромбозов, а также атеросклеротического поражения коронарных, мозговых и периферических сосудов [8, 9, 41, 46, 47, 114, 163, 164, 177, 180].
В последнее время ряд авторов ассоциирует гипергомоцистеинемию с акушерской патологией – привычное невынашивание беременности, сосудистые нарушения маточного и фетоплацентарного кровотока, бесплодие, а также с возможным развитием тератогенного, фетотоксического действия вплоть до антенатальной гибели плода [90, 163, 164]. Мутация С677Т в гене МТГФР
Мутация гена MTHFR (G677Т) приводит к замене аланинового остатка на валиновый в молекуле белка MTHFR, что делает мутантный белок термолабильным. Наличие мутантной аллели Т вызывает накопление в клетке токсичного продукта обмена метионина – гомоцистеина, который разрушает клетку, чаще всего эндотелиальную.
При гипергомоцистеинемии наблюдается активация всех компонентов гемостаза: сосудистой стенки, тромбоцитарного и плазменно-коагуляционного звеньев [177, 180]. В норме эндотелиальные клетки нейтрализуют повреждающий эффект гомоцистеина путем его превращения в S-NO-гомоцистеина с помощью эндотелий-продуцируемого релаксирующего фактора (EDRE), являющимся оксидом азота или близким к нему S – нитрозотиолом. Гомоцистеин нарушает метаболизм арахидоновой кислоты в тромбоцитах, увеличивая освобождения тромбоксана А2 , что ведет к повышению адгезивных и агрегационных свойств тромбоцитов. Одновременно с этим гомоцистеин вызывает активацию фактора V за счет вмешательства в экспрессию тромбомодулина, и активацию протеина С. Гипергомоцистеинемия индуцирует активность тканевого фактора, ингибирует тканевой плазминоген. Все эти факторы увеличивают риск тромбоза.
У пациентов с политравмой и наличием патологической аллели Т SNP показатель относительного риска развития тромбоэмболических осложнений составляет 2,18.
Таким образом, мы проследили встречаемость протромботических мутаций у больных с политравмой.
Для подтверждения прогностического значения полученных данных мы провели многофакторный регрессионный анализ, в который включили носительство генотипов единичных полиморфизмов генов IL-2 и IL-10, FV (Leiden), FII, MTHFR, концентрацию исследуемых цитокинов, D-димера, показатели лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.
При задании показателей выявлено, что наибольшей значимостью обладает определение ЛТА, IL-2, D-димера, полиморфизма гена MTHFR (С677Т), полиморфизма гена IL10 (G1082A), АЧТВ, полиморфизма гена IL2 (T330G) и полиморфизма гена FV(Leiden) (G1691A). Полученные результаты могут послужить основой для разработки новых подходов к оценке риска, профилактике, прогнозированию развития тромбоэмболических осложнений политравмы. Выявленные сведения о наличии полиморфизмов IL-2 (T330G), IL-10(C819T), IL-10 (G1082A), FV (Leiden) (G191A), FII (G20210A), MTHFR (C677T) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и совместно с другими полиморфизмами использоваться для оценки риска развития тромбоэмболий при политравме.
Похожие диссертации на Некоторые генетические и иммунологические механизмы развития гемокоагуляционных осложнений у пациентов с политравмой
