Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 13
1.1 Нейрогенез головного мозга и развитие нервной системы 13
1.1.1 Развитие нервных стволовых клеток во взрослом мозге 15
1.1.2 Основные характеристики взрослого нейрогенеза 17
1.1.3 Нейрогенные ниши во взрослом мозге млекопитающих 18
1.1.4 Картина экспрессии различных маркеров нейрогенеза, экспрессирующихся в поснатальном и взрослом гиппокампе 19
1.1.5 Дизрегуляция нейрогенеза 24
1.2 Современные представления о болезни Альцгеймера 25
1.2.1 Патогенез болезни Альцгеймера, влияние В-амилоидных олигомеров... 28
1.2.2 Нейрогенез при болезни Альцгеймера 30
1.3 Пластичность головного мозга 33
1.3.1 Arc-ген синаптической пластичности 33
1.4 Изменения структурно-функциональной пластичности головного мозга, индуцированные обогащенной средой 36
1.4.1 Экспериментальная парадигма обогащенной среды 37
1.4.2 Структурно-функциональные изменения в центральной нервной системе при воздействии обогащенной среды 39
1.4.3 Нейрогенез в условиях обогащенной среды 39
1.4.4 Обогащенная среда при болезни Альцгеймера 42
1.4.5 Возможные пути применения обогащенной среды 47
1.5 Роль лимбико-гипоталамо-гипофизарной системы в социальном поведении48
ГЛАВА 2 Материал и методы исследования 51
2.1 Описание животных 51
2.2 Описание воздействия на животных. Моделирование болезни Альцгеймера53
2.3 Нейропсихическое тестирование животных 56
2.4 Моделирование обогащенной среды 63
2.5 Иммуногистохимическое исследование з
2.6 Подтверждение модели провели протоколом окраски с Тиофлавином S 67
2.7 Оценка апоптоза методом TUNEL 67
2.8 Определение гена раннего реагирования в гиппокампе и миндалине головного мозга методом вестерн-блоттинга 68
2.9 Статистическая обработка 69
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 70
3.1 Результаты обработки данных оценки сложных форм поведения при болезни Альцгеймера в эксперименте 70
3.1.1 Результаты обработки данных в тесте «Открытое поле» 70
3.1.2 Результаты обработки данных в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» 77
3.1.3 Результаты обработки данных в тесте Водный лабиринт Морриса» 83
3.1.4 Социальный тест «Пятипопыточиый» 84
3.2 Верификация модели болезни Альцгеймера 93
3.3 Результаты обработки данных по оценке апоптоза в головном мозге крыс 94
3.3.1 Уровень экспрессии маркеров апоптоза 94
3.4 Результаты обработки данных по оценке экспрессии маркеров нейрогенеза в головном мозге крыс 100
3.4.1 Результаты обработки данных по уровню экспрессии Рахб -маркера стволовых клеток в головном мозге крыс 100
3.4.2 Результаты обработки данных по уровню экспрессии маркера амплификации стволовых клеток Neurogenin 2 (Ngn2) 103
3.4.3 Результаты обработки данных по уровню экспрессии маркера дифференцировки стволовых клеток NeuroDl 108
3.4.4 Результаты обработки данных по уровню экспрессии маркера постмитотических нейронов NeuN
3.5 Результаты обработки данных по уровню синаптогенеза в головном мозге крыс 113
3.6 Результаты обработки данных по оценке экспрессии Сх43 в головном мозге крыс 117
3.7 Результаты обработки данных экспрессии АгсЗ.1 в гиппокампе крыс 119
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 122
4.1 Изменение сложных форм поведения при экспериментальной болезни Альцгеймера и при пребывании животных в обогащенной среде 122
4.2 Изменение процессов запрограммированной клеточной гибели в головном мозге при действии обогащенной среды и при экспериментальной болезни Альцгеймера 125
4.3 Изменение экспрессии маркеров нейрогенеза в головном мозге при действии обогащенной среды и при экспериментальной болезни Альцгеймера 128
4.4 Особенности синаптогенеза при действии обогащенной среды и при экспериментальной болезни Альцгеймера 133
4.5 Межклеточные астроглиальные контакты в головном мозга при действии обогащенной среды и при экспериментальной болезни Альцгеймера 135
4.6 Особенности экспрессии Arc 3.1. при действии обогащенной среды и при экспериментальной болезни Альцгеймера 138
Выводы 146
Список сокращений 148
Список литературы 1
- Нейрогенные ниши во взрослом мозге млекопитающих
- Подтверждение модели провели протоколом окраски с Тиофлавином S
- Результаты обработки данных в тесте Водный лабиринт Морриса»
- Изменение процессов запрограммированной клеточной гибели в головном мозге при действии обогащенной среды и при экспериментальной болезни Альцгеймера
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Болезнь Альцгеймера (БА) является нейродегенеративным расстройством и наиболее распространенной формой деменции у пожилых людей. Нейродегенеративные процессы при БА сопровождаются нарушениями нейрогенеза. Тем не менее, молекулярные механизмы, вовлеченные в патологический нейрогенез болезни Альцгеймера, еще не полностью изучены [MuY. etal.,2011].
Вследствие большой частоты и особой тяжести последствий, болезнь Альцгеймера признана одной из главных медицинских и социально-экономических проблем современного цивилизованного мира. Социальное бремя проблем, связанных с хронической нейродегенерацией, будет продолжать неуклонно возрастать по мере старения населения [«Alzheimer's Disease International World Alzheimer Report, 2012»].
В контексте формирования социального поведения, процессы нейрогенеза, синаптогенеза, апоптоза, нейрон-глиального сопряжения, миграции клеток определяют то, как нейрональные сигналы распознаются и интегрируются в специфических регионах мозга. Одним из ключевых механизмов такой интеграции является активность лимбической системы, функционирование которой принципиально отличается в развивающемся, зрелом и стареющем мозге [Robinson G.E., 2008].
Детально были изучены генетические факторы, модулирующие функции мозга и его дисфункцию, но средовые параметры получили гораздо меньше внимания [Mayeux R., 2003, Nithianantharajah J., 2006]. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в понимании механизмов, которые опосредуют поведенческие, клеточные и молекулярные эффекты обогащенной среды (ОС), остается много нерешенных вопросов [van Praag Н., 2000, Li S. et al.,2013].
Признанным является факт наличия существенных различий в функционировании клеток нейрональной и глиальной природы в зрелом и стареющем мозге и, соответственно, в патогенезе заболеваний центральной нервной системы [Verret L. et al., 2007]. При различных возраст-зависимых заболеваниях процессы нейрогенеза, апоптоза и нейропластичности подвергаются нарушению. Соответственно, рассмотрение нейродегенеративной патологии, исследование зрелого и стареющего мозга требует пристального
внимания. В связи с этим актуально изучение механизмов нейрогенеза, лежащих в основе организации интегративной функции мозга при реализации сложных форм поведения в норме и при самой распространенной нейродегенеративной патологии - болезни Альцгеймера [Winner В., 2011].
Таким образом, существует потребность в создании экспериментально подтвержденной концепции формирования и развития пластичности головного мозга в ответ на действие внешних средовых факторов, приводящих к изменению сложных форм социального поведения при нейродегенерации и старении центральной нервной системы.
Цель исследования: охарактеризовать особенности нейрогенеза, апоптоза и реализации интегративных функций головного мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера и при физиологическом старении в условиях обогащенной среды.
Задачи исследования:
-
Изучить сложные формы поведения при пребывании экспериментальных животных (крыс) в обогащенной среде в различные периоды онтогенеза и у животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера.
-
Исследовать процессы апоптоза при пребывании экспериментальных животных в обогащенной среде в различные периоды онтогенеза и у животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера.
-
Изучить процессы нейрогенеза при пребывании экспериментальных животных (крыс) в обогащенной среде в различные периоды онтогенеза и у животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера.
-
Исследовать особенности влияния обогащенной среды на экспрессию белка нейропластичности (АгсЗ.1), белка межкклеточных контактов астроцитов (Сх43) и белка синаптических контактов (PSD95) в исследуемых группах животных.
Научная новизна
Установлены новые особенности реализации интегративных функций мозга (контроль сложных форм поведения) при действии обогащенной среды. Обогащенная среда на когнитивные функции поврежденного мозга (животные с экспериментальной болезнью Альцгеймера) или стареющего мозга (физиологическое старение) выраженного влияния не оказывает, однако обогащенная среда позитивно влияет на сохранение социальной памяти и
социального интереса при физиологическом старении и экспериментальной болезни Альцгеймера.
Впервые показано, что при экспериментальной болезни Альцгеймера происходит значительное подавление апоптоза в миндалине мозга, которое сопровождается торможением ранних процессов нейрогенеза и уменьшением количества постмитотических нейронов. При физиологическом старении происходит интенсификация апоптоза в миндалине мозга, которая сочетается с относительно высокой долей прогениторных клеток и уменьшением количества постмитотических нейронов.
Впервые установлены новые механизмы влияния обогащенной среды на нейрогенез и синаптогенез при физиологическом старении и экспериментальной болезни Альцгеймера. Убедительно показано, что обогащенная среда эффективно запускает апоптоз и ранние этапы пролиферации клеток, но не может повлиять на более поздние события, связанные с приобретением клеткой нейронального, а не глиального фенотипа при экспериментальной модели болезни Альцгеймера.
Впервые продемонстрированы особенности экспрессии АгсЗ.1 и Сх43 в клетках коры, гиппокампа и миндалины мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера и физиологическом старении, в том числе в условиях обогащенной среды.
Теоретическая значимость исследования
Установлены клеточно-молекулярные механизмы действия обогащенной среды на нейрогенез головного мозга при физиологическом старении и экспериментальной болезни Альцгеймера, а также закономерности апоптоза и нейрогенеза в структурах лимбической системы (миндалина, гиппокамп).
Практическая значимость исследования
Установленные механизмы повреждения и восстановления клеток головного мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера, в том числе при действии обогащенной среды, могут стать основой при разработке новых нейрофармакологических стратегий и протоколов нейрореабилитации. Выявленные дифференциальные диагностические признаки в миндалине мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера и физиологическом старении создают основу для разработки новых методов для оценки разных по этиологии механизмов хронической нейродегенерации.
Методология и методы исследования
Работа носит экспериментальный характер. Для решения поставленных
задач проведено нейропсихическое тестирование, иммуногистохимическое исследование препаратов мозга, вестерн-блоттинг. Объект исследования -крысы - самцы линии Wistar, предмет исследования - оценка процессов апоптоза, неирогенеза, синаптогенеза при различных условиях. Достоверность полученных данных подтверждена методами математической статистики. Основные положения, выносимые на защиту
-
Старение и интрацеребральное введение бета-амилоида разнонаправленно нарушают процессы неирогенеза, синаптогенеза и апоптоза клеток коры и лимбической системы мозга. При моделировании болезни Альцгеймера происходит торможение ранних процессов неирогенеза, тогда как при физиологическом старении отмечается относительно высокая доля прогениторных клеток.
-
Миндалина головного мозга является структурой, чувствительной к повреждающему действию бета-амилоида, что позволяет использовать ее для регистрации событий, характеризующих нейротоксичность (экспрессия маркеров апоптоза) и нейропластичность (экспрессия маркеров неирогенеза и синаптогенеза, экспрессия генов раннего реагирования) в контексте дифференцировки изменений, вызванных физиологическим старением и обусловленных развитием экспериментальной болезни Альцгеймера.
-
Обогащенная среда восстанавливает процессы нарушенного неирогенеза, апоптоза и синаптогенеза, а также экспрессию белков астроглиальных контактов при физиологическом старении и экспериментальной болезни Альцгеймера.
-
Изменения когнитивных функций и сложных форм поведения при физиологическом старении и экспериментальной болезни Альцгеймера корригируются обогащенной средой, что сопровождается изменением экспрессии маркера нейропластичности (АгсЗ.1) в гиппокампе мозга.
Степень достоверности результатов
Все научные положения и выводы обоснованы применением системного анализа поставленной проблемы, современных методов нейробиологии, достоверной выборкой исследуемых животных, большим объемом фактического материала, который подвергнут адекватному статистическому анализу.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и
токсикологической химии, научный процесс НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации доложены и обсуждены на Школе молодых ученых «Экспериментальные модели заболеваний ЦНС» в рамках Пленума проблемной комиссии Фундаментальные вопросы нейронаук научного совета РФ по неврологии (Красноярск, 2011); на Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине»: Аспирантские чтения 2011 (Самара, 2011); на видеоконференции Красноярск-Барнаул, посвященной современным исследованиям в области нейронаук и клеточных технологий (Красноярск, 2011); на Международной интернет-конференции «Медицина в XX веке: тенденции и перспективы», посвященной 70-летию КрасГМУ и 91-ой годовщине открытия гормона инсулина (Красноярск, 2012); на научной конференции «Сложные системы в экстремальных состояниях», СФУ (Красноярск, 2012); на VII Сибирском физиологическом съезде (Красноярск, 2012); на VII Российско-японском семинаре по нейронаукам в рамках Всероссийской научно-практической конференции педиатров (Красноярск, 2012); на научно-практической конференции «Комплексные методы в биомедицинских исследованиях: от молекул до поведения» (Москва, 2013); на XXVI Международном Симпозиуме BRAIN'13 (XXVIth International Symposium on Cerebral Blood Flow, Metabolism and Function & Xlth International Conference on Quantification of Brain Function with PET) (Шанхай, Китай, 2013); на 12 FELASA SECAL Congress: Animal Research: Better Science from Fever Animals (Барселона, Испания, 2013).
Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.
Объем и структура работы
Нейрогенные ниши во взрослом мозге млекопитающих
Взрослый нейрогенез повторяет полный процесс развития нейронов в эмбриональной стадии [64]. Во взрослой субвентрикулярной зоне пролиферирующая радиальная глия дает начало мигрирующим амплифицирующимся клеткам, которые в свою очередь генерируют нейробласты. В ростральном миграционном тракте нейробласты образуют цепь и мигрируют к обонятельной луковице через туннель, образованный астроцитами [149]. После достижения ядра обонятельной луковицы, незрелые нейроны отделяются от рострального миграционного пути и мигрируют радиалыю к клубочкам, где они дифференцируются в различные подтипы интернейронов [148].
В субгранулярной зоне взрослого мозга пролиферирующие радиальные и нерадиальные предшественники дают рост промежуточным предшественникам, которые, в свою очередь генерируют нейтробластьт. Незрелые нейроны мигрируют во внутренний гранулярный слой клеток и дифференцируются в гранулярные клетки зубчатой извилины гиппокампа [172] (Рисунок 2).
В течение нескольких дней новые нейроны распространяют дендриты к молекулярному слою и выпускают аксоны к САЗ [71]. Новые нейроны следуют стереотипным процессам синаптической интеграции в существующие цепи [254]. По сравнению со зрелыми гранулярными клетками, новорожденные нейроны проявляют гипервозбудимость и повышенную синаптическую пластичность на определенных этапах своего развития [230, 254]. После длительной фазы созревания, взрослые нейроны имеют сходные основные электрофизиологические свойства зрелых нейронов, хотя и некоторые свойства могут все еще быть различными [172].
Во-первых, основные вехи развития нейронов являются высоко консервативными при эмбриональном, раннем постнатальном и взрослом нейрогенезе [254]. Заметным отличием является значительно более медленный темп созревания нейронов во взрослом мозге по сравнению с эмбриональным развитием [71, 231]. Физиологическое значение этого продолжительного развития остается неизвестным, но ускоренный темп созревания иногда приводит к аномальной интеграции новорожденных нейронов в гиппокампе взрослого мозга [64, 231]. Во-вторых, подтипы клеток-предшественников демонстрируют значительную пластичность при выборе клеточного пути. [52]. В-третьих, схожие критические периоды в отношении конкретных аспектов взрослого нейрогенеза в субгранулярной и субвентрикулярной зонах. Выживаемость нейронов имеет два критических периода один на промежуточной прогениторной и нейробластной стадии [167, 193] и один на стадии интеграции незрелых нейронов [144, 194]. Новорожденные нейроны также обладают повышенной синаптическои пластичностью глутаматергического входа в критический период [14, 230, 254]. Такое увеличение пластичности может дать новым нейронам преимущества в конкуренции со зрелыми нейронами для селективного образования и стабилизации афферентных и эфферентных синаптических связей [194, 252]. Кроме того, эти свойства могут позволить интегрированным новым нейронам осуществить вклад в обработку информации в течение этого периода. 1.1.2 Ненрогенныс ниши во взрослом мозге млекопитающих
Как уже было отмечено выше во взрослом мозге имеются уникальные структуры - нейрогенные ниши, которые ограничивают активный пейрогепез в двух дискретных регионах [117, 224]. Среди основных клеточных компонентов нейрогенной ниши взрослого мозга находятся эндотелиальные клетки, астроциты, эпендимоциты, микроглия, зрелые нейроны и потомство взрослых нервных клеток-предшественников. Сосудистые клетки играют важную роль в регуляции распространения взрослых нервных клеток-предшественников. В субгранулярной зоне взрослого мозга кластеры делящихся клеток анатомически близко расположены к сосудистой сети, особенно капиллярам. В субвентрикулярной зоне взрослого мозга сосудистая сеть включает обширную сеть сообщающихся сосудов [8, 15]. Недавние исследования продемонстрировали динамическую и пластичную природу взрослых нейрогенных ниш. По принципу обратной связи новые клетки могут регулировать поведение нейронных предшественников [169]. Было показано, что полная потеря пирамидных нейронов СА1 области гиппокампа приводит к пролиферации астроцитов [7].
Весь процесс гиппокампального нейрогенеза физиологически локализован в зубчатой извилине. Кроме того, субгранулярная зона обогащена нервными окончаниями и подвергается регулированию через различные нейротрансмиттеры. В противоположность этому субвентрикулярная зона не находится в плотной нейронной сети и физически отделена от обонятельной луковицы, где происходит интеграция новых нейронов [287].
Молекулярный механизм, лежащий в основе нейрогенеза в зубчатой извилине, до конца не изучен. Очевидно, что транскрипционный каскад событий управляет спецификацией нейрональной идентичности в зубчатой извилине [168, 267, 271, 285], но детали характера экспрессии и функции каждого фактора транскрипции остаются неизвестными.
Подтверждение модели провели протоколом окраски с Тиофлавином S
Бета-амилоид 1-42 (Sigma-Aldrich, USA) растворяли в фосфатно-солевом буфере до концентрации 2 мкг/мкл с последующей агрегацией в термостате при 37С в течение 7 дней. 5 мкл амилоида было введено с каждой стороны гиппокампа в СА1 зону [227].
Время оценки признаков болезни Альцгеймера проводили, начиная с 10 суток [43] после оперативного вмешательства, т.к. в более ранний послеоперационный период животные содержатся по одной особи в клетке, соответственно, исследование социальных, когнитивных функций, а также тревожности и эмоциональности становится недопустимым.
Перед моделированием болезни Альцгеймера животное взвешивали на весах (для расчета дозировки анестетика). Для подавления ноцицепции использовали ксилазин в дозе 1 мл/кг веса животного, анестезию проводили интраперитонеальным введением хлоралгидрата 0,35 мг/кг веса животного. После полной анестезии удаляли шерсть с головы с помощью электрической бритвы. Хирургический уровень анестезии сохранялся от 45 мин до 1 часа,
После проверки болевой чувствительности, оценки частоты дыхания и сердечных сокращений и уверенности в безболезненности и отсутствии страдания животного, крысу фиксировали в стереотаксической рамке. Для этого нос и резцы фиксировали специальным зажимом вниз и в сторону. Затем закрепляли одно из ушных креплений 3,5 мм от центра. Устанавливали грелку внизу ( 35 С0) и помещали ее на стереотаксическую рамку для поддержания температуры тела, затем поднимали животное на уровень ушных креплений. Поддерживая голову животного снизу, закрепленный наконечник ушного крепления помещали в наружный слуховой проход. Другое ушное крепление помещали в противоположное ухо до плотной фиксации. Далее наносили офтальмологическую мазь «Видисик» для глаз. Дезинфекцию скальпа проводили бетадином, далее проводили инфильтрациоиную анестезию лидокаином и делали разрез по средней линии. С помощью хирургических ножниц разрез продливали вперед к задним частям глаз и назад между ушей. Удаляли перикраниальиые ткани с помощью ватного тампона и обрабатывали перекисью водорода. Уровень головы животного измерялся по z координатам брегмы и лямбды, корректировалась позиция головы таким образом, чтобы они стали равными. Затем уровень головы по горизонтали в передне-заднем направлении (выравнивание в медиально-латеральном направлении) достигали правильным позиционированием крепления для ушей животного.
Подгоняли иголку микроинжектора для стереотаксической рамы и брали DV (дорсо-вентральное направление глубина) значения у брегмы и лямбды. Поднимали или опускали крепления резцов и зажим для носа для того, чтобы подвести координаты DV брегмы и лямбды в пределах 0,1 мм друг от друга. Нулевой масштаб DV у брегмы. Устанавливали прицел в стереотаксической рамке, выравнивали перекрест с брегмой и нулем, АР (передне-задней) и ML (медиально-латеральной) шкалой. Измеряли положение х и у координат брегмы и определяли место целевой инъекции. Устанавливали сверло в стереотаксической раме, ставили в целевые АР и ML координаты и просверливали отверстие в черепе. Координаты для СА1 зоны гиппокампа: ML локализация от брегмы 2,2 мм, 3,0 мм в АР направлении от брегмы. Глубина 2,8 мм [248].
Далее приостанавливали сверление, брали небольшую иглу и тщательно перфорировали края отверстия трепанации черепа, а затем кончиком иглы аккуратно снимали кусочек кости. Далее устанавливалась игла для стереотаксической рамы и проводилась инъекция амилоида (Рисунок 6)
После проникновения через оболочку, медленно опускали иглу до соответствующей z координаты места инъекции, после этого начинали медленно, прикладывая давление на шприц вводить вещество со скоростью 1 мм в поперечнике в минуту. Через 5-7 минут после введения вещества медленно вынимали иглу. Место инъекции обрабатывали влажными ватными тампонами.
После всех манипуляций проводили ушивание раны и удаление животного из стереотаксическои рамы. Накладывали шовный материал на кожу и наносили мазь с антибиотиком на рану.
Инъецировали анестетик лидокаин подкожно рядом с раной для местной анестезии во время раннего периода восстановления после операции. Инъецировали стерильный физиологический раствор (30 мл/кг) подкожно для предотвращения обезвоживания.
После операции животное находилось в тепле (под лампой с контролем температуры). Как только животное восстанавливалось, вводили анальгетик. Возвращали животное в чистую клетку (одна крыса); клали кормушку с влажными гранулами пищи. На первый и второй день после операции инъецировали мелоксикам в дозе 1 мг/кг. В течение 5 дней оценивали восстановление животного, на шестой день - помещали в общую клетку [248].
Испытуемые животные подвергались следующим видам тестирования в период с 10 по 14 день после оперативного моделирования болезни Альцгеймера: тест «Открытое поле», тест «Приподнятый крестообразный лабиринт», «Водный лабиринт Морриса», «Социальный пятипопыточный тест».
Утилизация биологического материала. Трупы животных упаковывали и немедленно доставляли в морозильную камеру, предназначенную только для хранения трупов животных. Далее централизовано вывозили для утилизации.
Результаты обработки данных в тесте Водный лабиринт Морриса»
С помощью теста «Водный лабиринт Морриса» можно оценить пластичность обучения (пространственную память, эквивалентную эпизодической памяти человека), регулируемую преимущественно гиппокампом. При исследовании пространственной памяти отмечается значимое увеличение времени поиска платформы после моделирования болезни Альцгеймера у животных, находящихся в условиях обогащенной среды ( р 0,05) по сравнению с исходными значениями (крысы 9 месяцев после ОС) (Рисунок 8).
Время, затраченное на поиск платформы на 4 день тестирования после трех дней тренировки Кроме того, значимое снижение времени поиска платформы при сравнении интакных животных в возрасте 9 месяцев, подвергшихся экспозиции обогащенной среды по сравнению с животными аналогичного возраста без обогащения ( р 0,05). Однако полученные нами данные позволяют сделать вывод, что обогащенная среда стимулирует когнитивную функцию у интакных крыс, на поврежденный мозг (амилоидная модель БА) обогащенная среда выраженного влияния не оказывает. Также не было обнаружено значительного влияния на когнитивные функции в стареющем мозге (ФС) крыс в возрасте 23 месяца.
Тест «Социальный пятипопыточный» оценивает когнитивные функции узнавания новой особи. При частых встречах грызуны адаптируются друг к другу и тратят меньше времени на социальное взаимодействие, чем при встрече с абсолютно новой крысой. Во время тестирования проводятся 4 короткие экспозиции одного и того же интрудера (в домашней клетке). При пятой попытке в клетку помещается новый грызун (для обозанчений на рисунках 1-4 первая подсаживаемая особь, 5 новая особь)[38].
На рисунке 9 представлены результаты «Социального пятипопыточного теста» для животных в возрасте 21 месяца (4 группа в динамике до и после 60 дней обогащенной среды). При сравнении 4 группы в динамике обнаружено, что обогащенная среда не значимо влияет на социальный интерес (время контакта с первой особью достоверно не отличается после обогащенной среды). Однако, как было выявлено, у стареющих крыс снижена социальная память, что проявляется не отличающимся временем распознавания нового самца (пятая попытка) от предыдущего. Вместе с тем, экспозиция обогащенной среды в течение 60 дней достоверно значимо увеличивает время, потраченное на знакомство с новой особью после четырех попыток.
У стареющих крыс (23 месяца) (физиологическое старение ФС) достоверно снижена не только социальная память, что проявляется не отличающимся временем распознавания нового самца (пятая попытка) от предыдущего, но и достоверно значимо снижается социальный интерес по сравнению с особями из ОС. Обогащенная среда достоверно значимо увеличивает время, потраченное на знакомство с новой особью после четырех попыток (Рисунок 10). сек.
На рисунке 11 представлены результаты 2 группы (крысы в возрасте 7-9 месяцев) животных в динамике (до и после экспозиции обогащенной среды). Отмечается достоверное увеличение времени контакта крыс с подсаживаемой особью в первую и вторую попытку после обогащенной среды в сравнении с животными до воздействия обогащенной среды, что говорит о повышении социального интереса, который продолжается даже после первого контакта с особью. Так как время контакта увеличено во второй попытке, но не отличается в третьей и четвертой, можно говорить именно о продолжающемся социальном интересе, но не о затрудненном узнавании особи. Время, потраченное на распознавание нового самца (пятая попытка) после обогащения увеличивается, но различия не достоверны. У всех животных сохранена социальная память, так как в одной и другой группе 4 и 5 попытки отличаются по времени контакта достоверно в сторону значительного увеличения времени контакта с новой пятой особью. 1 2 3
При сравнении животных одного возраста (9 месяцев), но содержащихся в разных условиях, выявлено достоверное увеличение времени контакта с первой особью в первой и второй попытке (Рисунок 12). Данный результат свидетельствует, что обогащенная среда увеличивает социальный интерес у животных, так как содержит помимо физических стимулов еще и социальные стимулы. Социальная память у обеих групп сохранена, поскольку в первой и во второй группе 4 и 5 попытки отличаются по времени контакта достоверно в сторону значительного увеличения времени контакта с новой пятой особью.
При анализе времени контакта крыс в возрасте 9 месяцев после обогащенной среды и после моделирования болезни Альцгеймера значимых различий выявлено не было. Сек. 180 в стандартных условиях и в обогащенной среде Для исключения влияния оперативного вмешательства на социальный интерес и социальную память были сравнены животные, подвергшиеся ложной операции. Время контакта крыс после обогащенной среды и ложной операции достоверно не отличалось.
Также не было выявлено значимых различий при сравнении времени контакта крыс с моделированием БА и ложной операции после экспозиции обогащенной среды. Это может свидетельствовать о положительном влиянии ОС на мозг с дегенерацией.
При сравнении крыс, содержащихся в стандартных условиях с последующим моделированием БА, выявлено достоверно значимое снижение времени контакта в первой и пятой попытке у крыс с экспериментальной моделью БА по сравнению с интактным животными (Рисунок 13).
Сек. Время контакта крыс в возрасте 9 месяцев, содержащихся в стандартных условиях и после моделирования болезни Альцгеймера при содержании в СУ Время социального контакта крыс, содержащихся в стандартных условиях и после проведения ложной операции, достоверно не отличается.
При сравнении амилоидной модели и ложной операции в пятипопыточном социальном тесте выявлено достоверно меньшее количество времени, потраченное на контакт в первой и пятой попытке по сравнению с животными с ложной операцией. Однако у обеих групп сохраняется достоверное различие между временем, потраченным на контакт с первой особью в четвертой попытке и новой крысой при пятой попытке (Рисунок 14).
Изменение процессов запрограммированной клеточной гибели в головном мозге при действии обогащенной среды и при экспериментальной болезни Альцгеймера
Исследования показывают, что болезнь Альцгеймера включает дисфункцию многих клеточных путей, в том числе синаптической передачи, динамичности цитоскелета, нейрогенеза и апоптоза. До сих пор неясно, какие изменения происходят в различных регионах мозга при реализации клеточной гибели при прогрессировании БА [100].
Массивная и прогрессивная потеря нейронов в таких областях, как гиппокамп и кора лежит в основе когнитивного ухудшения и потери памяти при болезни Альцгеймера. Ослабление нейрогенеза происходит раньше начала поражения или потери нейронов и может играть роль в инициации и прогрессировании болезни Альцгеймера. Поэтому изучение различных звеньев нейрогенеза и их разобщения является весьма актуальным [143]. Помимо взрослого нейрогенеза в нейрогенных нишах был также описан нейрогенез в миндалине [191], СА1 зоне гшшокампа [223]. Однако эти данные остаются спорными, но не потому, что нейрогенез в этих регионах невозможен. Скорее, последние сообщения о таких явлениях еще недостаточно преодолели многие методологические вопросы, описанные ранее [143].
Так было показано, что обогащенная среда сокращает уровень апоптоза на 45% в зубчатой извилине гиипокампа [82], уменьшает уровень экспрессии проапоптотических каспаз [220]. Кроме того, существуют данные, что инъекция бета-амилоида в перегородку вызывает ухудшение памяти и когнитивных функций, однако увеличения уровня апоптоза в гиппокампе зафиксировано не было [127].
При запуске механизма апоптоза апоптоз-индуцирующий фактор (АИФ) транслоцируется в ядро, где он приводит к конденсации ядерного хроматина и крупномасштабным фрагментациям ДНК, которые приводят к каспаз-независимой гибели нейронов. Было обнаружено, что апоптоз-индуцирующий фактор увеличивается в пирамидальных нейронах гиппокампа в мозге с БА. Тем не менее была показана временная региональная специфичность апоптоза, так АИФ был обнаружен в пирамидальных нейронах СА1 зоны на ранней стадии болезни Альцгеймера и в СА2 на прогрессивной стадии. Ядерная локализация АИФ-позитивных нейронов наблюдалась также в миндалине и холинергических нейронах переднего мозга на ранних этапах БА [90].
При исследовании апоптоза нами были зафиксированы региональные различия в интенсивности апоптоза в стареющем мозге и мозге животных с моделью БА. Так было отмечено значительное снижение экспрессии терминальных участков ДНК в миндалине крыс с БА при высоком уровне апоптоза в коре и гиппокампе. У стареющих животных выявлено увеличение апоптоза во всех исследуемых зонах. При этом ОС снизила уровень апоптоза только в гиппокампе животных с экспериментальной болезнью Альцгеймера, в стареющем мозге ОС оказывает такое воздействие на кору и гиппокамп.
Известно, что повреждения ДНК в нейронах могут способствовать старению и когнитивным нейродегенеративным расстройствам, таким как болезнь Альцгеймера. Старение связано с прогрессивным увеличением маркеров разрывов ДНК в нейронах [12, 21]. Недавние исследования показали, что разрывы ДНК связаны с паузой в прогрессии клеточного цикла [208]. Поэтому можно предположить, что усиление апоптоза коррелирует с нейрогенезом головного мозга, особенно это касается тех областей мозга, которые непосредственно отвечают за память и обучение (кора и гиппокамп). Так В. В. Шерстнев и др. показали, что физическое и эмоциональное состояние, связанное тестированием в лабиринте Морриса, вызывают значительное увеличение показателей неонейрогеиеза и апоптоза в коре, гиппокампе и мозжечке [4]. При этом бета-амилоид усугубляет повреждения ДНК путем воздействия на синаптическуго активность.
По данным некоторых авторов, значительное количество нейронов в матрице миндалины погибает на начальных стадиях БА [276]. В связи с этим, возможно, при исследовании головного мозга на 14 сутки после моделирования БА уже не регистрируется интенсивный апоптоз, в то время как в гиппокампе и коре он все еще продолжается.
Таким образом, ОС оказывает положительное влияние на выживаемость клеток головного мозга, однако, вполне возможно, что при исследовании ткани в одни и те же временные промежутки в различных областях мозга можно наблюдать разные картины, которые можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, скоростью повреждения регионов мозга при болезни Альцгеймера. Так у трансгенных мышей по АРР (АРР23) отложение амилоида начинается сначала в гиппокампе, затем в коре и в конце поражение затрагивает миндалину. У трансгенных мышей с моделью pR5 (Таи), ассоциированной с отложением нейрофибриллярных клубков, в первую очередь повреждение проявляется в миндалевидном комплексе, и только потом в процесс вовлекаются другие структуры [29]. Вместе с тем, по данным литературы при амилоидной модели болезни Альцгеймера происходит увеличение апоптоза в коре и гиппокампе [12, 21]. Вместе с тем до конца неясно, как именно развивается поражение структур при стереотаксическом введении бета-амилоида. Однако есть данные о вовлечении миндалины в ранние периоды развития нейродегерации [26]. Возможно, именно миндалина является структурой лимбической системы головного мозга, которая хронологически отличается по своим процессам от процессов, происходящих в гиппокампе.
Процессы апоптоза и нейрогенеза в миндалине выражены слабее [261], чем в гиппокампе и коре, поэтому интенсивность апоптоза также может быть снижена при моделировании БА. Также некоторые исследования показывают, также что АР олигомеры и болезнь Альцгеймера могут привести к повторному входу в клеточный цикл [51]. Возможно предположить, что образование повреждений ДНК в нейронах является естественным процессом, который облегчает ремоделирование хроматина и изменения в экспрессии генов, участвующих в обработке информации, обучении и памяти. Тем не менее, невозможно исключить возможность того, что разрывы ДНК являются лишь побочным продуктом энергии обмена веществ в особо активных нейронах. Было получено несколько линий доказательств в поддержку гипотезы, что исследовательское поведение и патологически повышенный амилоид увеличивает разрывы ДНК нейронов путем модуляции активности нейронов [208]. Однако, по собственным наблюдениям, эти события имеют региональную специфичность. Так изменения в базолатералыюй миндалине носят отличный характер от гиппокампа крыс с моделью БА. Не исключено, что уровень апоптоза коррелирует с нейрогенезом в головном мозге, поскольку именно гиппокамп является нейрогенной нишей и процессы нейрогенеза там протекают более интенсивно, то и уровень апоптоза значительно выше.
Однако следует отметить, что при исследовании апоптоза можно судить о выживаемости клеток. Вместе с тем для полной картины изменений, происходящих в головном мозге необходимо исследование различных ступеней нейрогенеза.
![Клинико-эпидемиологические особенности дисгормональных заболеваний и рака молочных желез у мужчин в процессе адаптации к условиям среды обитания [Электронный ресурс]](/i/i/4607/176829.png "Клинико-эпидемиологические особенности дисгормональных заболеваний и рака молочных желез у мужчин в процессе адаптации к условиям среды обитания [Электронный ресурс] Мельников Алексей Александрович")
