Механизмы дисфункции митохондрий и нарушений ионного гомеостаза при глутаматной нейротоксичности Сурин, Александр Михайлович

Введение к работе

Актуальность проблемы

По данным ВОЗ (Информационный бюллетень №310, июнь 2011) в странах со средним и высоким уровнем дохода инсульт и другие цереброваскулярные заболевания прочно занимают второе место (9-13%) после сердечно-сосудистых по уровню смертности (14-16%). С учетом нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера и др.) и травм, полученных при несчастных случаях, повреждения мозга становятся на один уровень с сердечно-сосудистыми заболеваниями по доле летальных исходов. По потерям трудоспособности инсульт, цереброваскулярные и нейродегенеративные заболевания опережают все остальные причины инвалидности среди выживших.

При повреждениях мозга, вызванных кислороддефицитными состояниями, травмами или инсультами, вокруг участков поражения развиваются зоны энергозависимого нарушения метаболизма клеток, в первую очередь, нейронов (так называемая «ишемическая полутень» или «пенумбра» (penumbra) (Dirnagl et al, 1999). В синапсах нейронов, оказавшихся в этих зонах, происходит неконтролируемое высвобождение основного возбуждающего нейромедиатора центральной нервной системы глутамата (Glu). Избыточная стимуляция глутаматных рецепторов, прежде всего ионотропных рецепторов NMDA-типа, приводит к перегрузке нейронов ионами Са²⁺ и Na⁺, нарушению сигнальных, метаболических и энергетических процессов и, в итоге, к увеличению области поражения мозга в результате отсроченной гибели нейронов (Mattson & Mark, 1995; Nicotera & Orrenius, 1998; Sattler & Tymianski, 2000). Разработка методов, позволяющих ограничить область вторичного поражения мозга, требует учета многих параметров, влияющих на способность нейронов к выживанию. Первичные культуры нейронов, полученных из различных разделов мозга млекопитающих (в основном крысы и мыши), являются общепризнанной и часто незаменимой моделью исследования процессов, происходящих в мозге в норме и при патологии (Choi, 1987, 1992).

Предшествующие пионерские исследования (Tymianski et al, 1993; Adamec et al, 1998; Castilho et al, 1998), выполненные, в том числе, с участием нашего коллектива (Khodorov et al, 1996; см. также обзоры Ходоров, 2000; Khodorov, 2004), показали, что в нейрональных культурах длительное воздействие высоких доз Glu вызывает двухфазное увеличение внутриклеточной концентрации свободного Са²⁺ ([Ca²⁺]_i). Вторая фаза подъема [Ca²⁺]_i , т.н. отсроченная кальциевая дисрегуляция (ОКД), всегда происходит синхронно со значительным падением трансмембранного потенциала внутренней мембраны митохондрий (далее «митохондриального потенциала», _m) (Vergun, et al, 1999). Измерения на сестринских культурах показали, что доля нейронов, в которых возникла ОКД, почти линейно соотносится с долей нейронов, погибших через несколько часов после окончания Glu воздействия (Limbric et al, 1995). Этим обстоятельством, а также тем, что Са²⁺ является вторичным мессенджером во всех типах клеток и регулирует мириады внутриклеточных процессов (Авдонин и Ткачук, 1994; Berridge, 2000), и обусловлен незатухающий интерес к механизму возникновения ОКД и использованию этого феномена для тестирования нейротропных свойств различных агентов (см., например, Suwanjang et al, 2013; Vaarmann et al, 2013).

Исследования, выполненные за последние 20 лет, выявили ряд возможных причин развития ОКД и последующего сохранения высокого [Ca²⁺]_i плато. Эти исследования можно разделить на два направления в зависимости от того, какой из механизмов развития ОКД считается основным: (1) возникновение неспецифической поры высокой проводимости во внутренней мембране митохондрий (mitochondrial permeability transition, мРТ) или (2) развитие энергетического кризиса, приводящего к дисбалансу ионного гомеостаза, кульминацией которого является ОКД. Центральная роль митохондрий не подвергается сомнению в любой из гипотез развитии ОКД и последующей гибели нейронов. При этом остаются невыясненными следующие вопросы: 1) на какой стадии ОКД образуется мРТ в нейронах; 2) Является ли образование мРТ главной причиной ОКД и последующего энергетического кризиса, или наоборот, мРТ является следствием развития ОКД? 3) Предшествует ли критическое падение концентрации АТФ в цитозоле ([ATP]с) развитию ОКД или низкий уровень [ATP]с достигается только на стадиях высокого [Ca²⁺]_i плато? 4) Каковы механизмы вовлечения митохондрий в развитие ОКД и поддержание высокого [Ca²⁺]_i плато ?

Для решения этих вопросов необходимо не только расширение арсенала методов исследования, но и разработка методических приемов, позволяющих проводить многопараметрические прижизненные высокочувствительные измерения процессов, вовлекаемых в развитие ОКД. Значительный прогресс в изучении разнообразных аспектов внутриклеточной сигнализации в норме и патологии был достигнут благодаря применению белковых конструктов, состоящих из флуоресцентных и сенсорных белков, которые селективно реагируют на изменения внутриклеточных параметров, таких как рН, концентрации Са²⁺, пероксида водорода, циклического АМФ и др. (Shaner et al, 2006; Chudakov et al, 2010; Lukyanov et al, 2010; Orosco et al, 2013). В дифференцированных клетках экспрессия флуоресцентных белковых сенсоров затруднена и поэтому примеры применения этого метода при исследовании внутриклеточных процессов в нейронах пока немногочисленны (Rintoul et al, 2003; Shalbueva et al, 2006; Bolshakov et al, 2008; Kovac et al, 2012). Вирусная трансфекция позволяет достичь 80-90% экспрессии флуоресцентного сенсора в нейронах (Bano et al, 2005), однако требует особых мер предосторожности при проведении экспериментов и поэтому реже используется. Главными преимуществами флуоресцентных белковых сенсоров являются (1) возможность отслеживать такие внутриклеточные характеристики, для которых пока не удалось создать синтетические индикаторы и (2) адресная доставка в интересующие внутриклеточные компартменты с прецизионностью, недоступной для низкомолекулярных синтетических флуоресцентных зондов. Учитывая все это, при выполнении данной работы были разработаны способы одновременной экспрессии в культивируемых нейронах различных флуоресцентных белковых сенсоров и исследование с их помощью внутриклеточной сигнализации, ионного гомеостаза и биоэнергетики нейронов в норме и при нейротоксическом действии Glu.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось выяснение роли митохондрий в механизмах нарушения ионного гомеостаза нейронов при гиперстимуляции ионотропных глутаматных рецепторов, приводящей к развитию отсроченной Са²⁺ дисрегуляции (ОКД) и последующей гибели клеток.

Задачи исследования:

1. Разработать мультипараметрическую флуоресцентно-микроскопическую систему для измерений функционального состояния митохондрий и ионного гомеостаза в индивидуальных нейронах с комбинированным использованием синтетических флуоресцентных зондов и флуоресцентных белковых сенсоров с адресной доставкой в цитозоль и митохондрии.

2. Исследовать взаимосвязь между индуцированной глутаматом ОКД, митохондриальной деполяризацией и механизмом последующей гибели нейронов.

3. Исследовать влияние на развитие ОКД внешних факторов, модулирующих функциональное состояние митохондрий (инигбирования дыхания, разобщения окислительного фосфорилирования, глюкозной депривации, реверсии Na⁺/Са²⁺ обмена).

4. Изучить вклад в развитие дисфункции митохондрий и ОКД эндогенных факторов, возникающих в результате индуцированной глутаматом активации фосфолипаз А2 и поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1.

5. Исследовать процессы, в которых митохондрии играют активную роль в противодействии развитию ОКД.

6. Исследовать различия биоэнергетики культивируемых нейронов при действии глутамата и в нейронах, полученных из животных пре- и постнатального периода развития.

Научная новизна

1. Впервые показано, что более 90% культивируемых нейронов, в которых за время аппликации Glu успела развиться ОКД и сильная митохондриальная деполяризация, погибают спустя 14-20час от некроза и апоптоза.

2. Показано, что эндогенными факторами развития ОКД, снижающими митохондриальный синтез АТФ и Са-буферные свойства митохондрий, являются арахидоновая кислота, высвобождаемая в результате активации фосфолипаз А2, и падение NADH вследствие активации поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1.

3. Установлено, что в культивируемых нейронах наряду с Glu-индуцированными патогенными процессами, развиваются также процессы, противодействующие дисфункции митохондрий и глутаматной токсичности: 1) переключение на другой метаболический путь окисления субстратов, компенсирующий глюкозную депривацию и дефицит пирувата; 2) увеличение градиента рН между матриксом митохондрий и цитозолем (рН), компенсирующее снижение митохондриального потенциала (_m); 3) рост активности сукцинатдегидрогеназы.

4. Впервые показано, что в индивидуальных культивируемых нейронах развитию ОКД предшествует падение концентрации АТФ в цитозоле до 10-20% от уровня в покоящихся клетках.

5. Обнаружены кардинальные отличия в биоэнергетики нейронов пре- и постнатального периодов: в культивируемых нейронах, из гиппокампа эмбрионов крысы (Е17-Е18), основным способом производства АТФ является гликолиз, тогда как в нейронах из гиппокампа постнатальных крыс (Р1-Р2) АТФ синтезируется преимущественно за счет окислительного фосфорилирования.

Научно-практическое значение работы

Разработаны флуоресцентно-микроскопические методы регистрации в индивидуальных клетках изменений одновременно нескольких (от двух до четырех) внутриклеточных параметров, таких, как внутриклеточная концентрация свободного Са²⁺ и Nа⁺ , NAD(P)H и FAD автофлуоресценции, активных форм кислорода, потенциала митохондриальной и плазматической мембраны, рН в цитозоле и митохондриях.

Применены новые фармакологические подходы (ингибиторный анализ) и внедрен многопараметрический морфологический анализ выживаемости нейрональной культуры.

Впервые удалось достичь экспрессии в нейрональных культурах одновременно двух сенсорных флуоресцентных белков, имеющих разные спектральные параметры и локализованных в разных внутриклеточных компартментах.

Разработанные методы могут служить для тестирования механизмов действия биологически активные веществ. Вещества, задерживающие развитие ОКД, могут быть перспективными при разработке препаратов нейропротекторного действия. Увеличение лаг-периода ОКД под влиянием испытуемого вещества, является количественным критерием эффективности подобных веществ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Развитие ОКД происходит синхронно с развитием сильной митохондриальной деполяризации (МД). Нейроны, в которых ОКД достигла фазы высокого [Ca²⁺]_i плато, гибнут через 14-20час в результате некроза или апоптоза в пропорции ~1:1. Длительность лаг-периода ОКД и МД может служить количественной мерой для тестирования нейропротекторных или нейротоксических свойств биологически активных соединений.

2. Развитие ОКД вызвано действием нескольких факторов, в числе которых высвобождение из фосфолипидов арахидоновой кислоты, снижение NAD(P)H, увеличение ионной (протонной) проводимости внутренней мембраны митохондрий, разобщение окислительного фосфорилирования, падение [ATP]с , снижение Са²⁺-буферной емкости митохондрий. Восходящая фаза ОКД и начало высокого [Ca²⁺]_i плато не являются следствием образования «классической» неспецифической высокой проводимости (мРТ), поскольку являются обратимыми, происходит сильное падение, но не коллапс _m и рН, митохондрии удерживают в матриксе NAD⁺ и более низкомолекулярные субстраты цикла трикарбоновых кислот.

3. При действии нейротоксических доз Glu, одновременно с появлением факторов, ослабляющих функционирование митохондрий в качестве производителей АТФ и основных Са²⁺-буферных емкостей нейронов, происходит привлечение внутриклеточных ресурсов, препятствующих ОКД, а именно, мобилизация «резервного» субстрата взамен пирувату при блокаде гликолиза, рост рН, усиление работы FAD-зависимого комплекса II дыхательной цепи.

4. При переходе от эмбриональной (Е17-Е18) к постнатальной (Р1-Р2) стадии развития в нейронах мозга происходит перестройка биоэнергетики проявляющаяся в том, что в основной массе (~84%) культивируемых нейронов из мозга пренатальных животных основным способом производства АТФ служит гликолиз, тогда как в нейронах из гиппокампа новорожденных крыс доминирующим способом синтеза АТФ становится окислительное фосфорилирование.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на Международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2007, 2009, 2011, 2013), на 3-ем Съезде Биохимического общества России, Санкт-Петербург-2003, на Конференциях Физиологического общества Великобритании (Aberdeen-2000, London-2002), 3-ем Российском Конгрессе по патофизиологии (Москва-2004), на Конференциях Американского Общества нейронаук (Society for Neurosciences, Washington-2005, 2008, 2011; Chicago 2009; San-Diego, 2010), на Съезде Американского биофизического общества (Baltimore-2011), на 8-ом Всемирном конгрессе IBRO (Florence-2011), на 3-ем Съезде физиологических обществ стран СНГ (Ялта-2011).

Публикации

Основные положения диссертации опубликованы в 43 печатных работах, из которых 16 в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы

Похожие диссертации на Механизмы дисфункции митохондрий и нарушений ионного гомеостаза при глутаматной нейротоксичности

Тиреоидный гомеостаз и дисгормональные нарушения репродуктивной системы у женщинЮнусов Абдурашид Абдумаликович

Патогенетические и саногенетические механизмы гомеостаза в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга у пациентов с повреждениями шейного отдела позвоночникаУльянов Владимир Юрьевич

Патогенетические механизмы психовегетативных дисфункций при воздействии хронического профессионального стресса у врачей поликлинических учрежденийЛымаренко, Валерий Михайлович

Механизмы формирования эндотелиальной дисфункции, сопровождающие патологию висцеральных органов при сахарном диабете. Перспективы коррекцииДзугкоев, Сергей Гаврилович

Нарушения энергетического метаболизма митохондрий при итоксикации этанолом и их коррекция гепатопротекторамиПетрова, Зоя Викторовна

Биохимические механизмы нарушений регуляции гомеостаза у онкологических больных при эндотоксемииСмолякова Раиса Михайловна

Исследование механизмов нарушения кальциевого гомеостаза в нейронах при токсическом воздействии глутаматаФаюк, Дмитрий Александрович

Роль синдрома системного воспалительного ответа в нарушении гомеостаза при хирургическом и комбинированном лечении рака желудкаАфанасьева Алла Николаевна

Нарушение гомеостаза и лечение гемолитико-уремического синдрома у детейТрофимов Алексей Анатольевич

Патогенетическое обоснование коррекции нарушений гомеостаза при острой хирургической патологии посредством антиоксидантной, антигипоксантной и антицитокиновой терапииМаджанова, Елена Рустамовна