Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на многочисленные исследования в областях патофизиологии и биохимии в последние годы, однако, полностью еще не выяснены индукторы активации апоптоза и компоненты его сигнальных механизмов. Биохимические механизмы регуляции апоптоза очень сложны и, как показали исследования последних лет, практически не изменились в процессе эволюции, что дает основание судить о фундаментальной биологической роли апоптоза [Kim Y.S., 2009].
Можно выделить два направления в изучении апоптоза. С одной стороны, исследуются существующие сигнальные и рецепторные пути, регулирующие апоптоз. Эти данные можно использовать, применяя эндогенные медиаторы. С другой стороны, ведется поиск веществ, способных направленно воздействовать на процессы апоптоза, подавляя или активируя его. Главной задачей исследователей, изучающих апоптоз, является установление путей возможной регуляции активности апоптоза, т.е. не просто факторов его индукции или угнетения, а именно поиск -модуляторов апоптоза.
Механизмы развития апоптоза, его индукторы и супрессоры изучаются на экспериментальных моделях. Одной из классических экспериментальных моделей апоптоза в почечной ткани является - острая почечная недостаточность (ОПН).
Острая почечная недостаточность проявляется сложным симптомокомплексом патофизиологических изменений в почках. Одним из них является апоптоз [Sanz А.В., et al., 2008]. В связи с изучением апоптоза возникла необходимость пересмотра ряда концептуальных основ в патофизиологии почечных патологий.
ОПН приводит к ишемии/гипоксии в органах и клетках, которая, в свою очередь, вызывает апоптоз через изменения в митохондриях, вследствие образования свободных радикалов, изменения транслокации ионов кальция, изменения проницаемости митохондриальной мембраны и выделения апоптогенных факторов, таких как цитохром с и белков семейства Всі-2 [Hutchens М.Р., et al., 2008]. Имеются данные о вовлечении опиоидных рецепторов в протекторные механизмы ишемия/реперфузионного синдрома, так называемый феномен «ишемического прекондиционирования» [Комаревцева И.А., 2004; Tegeder I., Geisslinger G., 2004]. Вместо прежних представлений о гибели клеток многоклеточного организма как отрицательном по значимости явлении, сформировался новый взгляд, согласно которому гибель части клеток в пределах организма является закономерным и необходимым процессом и само существование многоклеточного организма подразумевает баланс жизни и смерти на уровне составляющих его клеточных популяций [Chen Н., et al., 2008].
При острой почечной недостаточности (ОПН) ишемического, токсического или обструктивного генеза апоптоз развивается в клетках
канальцев. В этих случаях имеет место и некроз клетки, и еще неизвестно, какой из этих двух инициированных механизмов гибели клеток является ведущим. При различных фазах ОПН скорость апоптоза неравномерна: он может персистировать, или замедляться. Апоптоз при ОПН также может развиваться как адекватный ответ на повреждение. В этих случаях это рассматривается как физиологический баланс контроля и сдерживания преувеличенной компенсаторной пролиферации [Srichai М.В., et al., 2008].
При острой почечной недостаточности изменяется экспрессия и внеклеточных, и внутриклеточных факторов регуляции апоптоза [Isaka Y., et al.,2009].
Актуальность проблемы заключается в возможности коррекции этого процесса при различных заболеваниях, в том числе почечных.
Идентификация морфологических и биохимических маркеров апоптоза должна в перспективе способствовать более глубокому пониманию механизмов патогенеза заболеваний, улучшению дифференциальной диагностики и созданию принципиально новых направлений терапии.
Основной целью нашего исследования стало изучение лигандов опиатных рецепторов, как возможных модуляторов уровня апоптоза в почках на модели острой почечной недостаточности. Кроме этого, нас интересовал сигнальный путь, через который мог бы реализовываться проапоптотический и антиапоптотический эффекты опиоидов.
Цель исследования: установить уровень апоптоза и роль его модуляторов в развитии экспериментальной модели повреждения почки -острой почечной недостаточности.
Задачи исследования
-
Разработать модели стимулированного ренального апоптоза в условиях экспериментальной острой почечной недостаточности (ОПН) (преренальной-гемодинамической; ренальной-паренхиматозной) с биохимической верификацией патологического процесса.
-
Изучить степень развития апоптотических процессов количественно по ДНК-фрагментации в сопоставлении с морфологической детекцией при использованием ядерного красителя Хехст в почечной ткани в условиях развития экспериментальной ОПН.
-
Выяснить наличие экспрессии индуцибельной синтазы оксида азота по содержанию стабильных метаболитов оксида азота - нитрит- и нитрат-анионам в клетках почек при различных моделях ОПН.
-
Изучить активность сфингомиелинового метаболического пути в почках в сигналпередающих системах апоптоза при экспериментальных моделях ОПН.
-
Изучить ^-протонные механизмы клеточного объема по данным ЯМР-релаксации тканевой воды в почках в условиях ОПН и под действием модуляторов апоптоза.
-
Выявить биохимические механизмы модуляции апоптотических процессов в почках синтетическим лей-энкефалином - даларгином - при различных моделях ОПН.
-
Установить роль опиоидных рецепторов в регуляции К+АТф - каналов митохондрий в почках в условиях стимулированного апоптоза.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Активация опиатных рецепторов вызывает различные эффекты на уровень апоптоза в почках: в физиологических условиях у интактных животных -проапоптозный и антиапоптозный в условиях стимулированного апоптоза на экспериментальной модели ОПН.
-
Проапоптозный эффект опиоидов (даларгина) реализуется через fi-опиатные рецепторы и является NO-независимым, тогда как антиапоптозное действие опиоидов в условиях стимулированного апоптоза при ОПН является NO-зависимым процессом запускаемом через <3\-опиатные рецепторы с участием АТФ-чувствительных митохондриальных К+-каналов.
-
Модуляторами опиатно-рецепторного сигнального пути апоптоза при экспериментальной ОПН является ангиотензиновая и простаноидная системы, сфингимиелин-сфингозиновый каскад и оксид азота, триггерным механизмом апоптоза которых, является перераспределение внутри- и внеклеточной фракции тканевой воды в почках.
Научная новизна работы
Разработан метод для анализа состояния системы оксида азота в тканях и биологических жидкостях по его конечным метаболитам - нитрит- и нитрат-анионам. Установлена активация метаболического пути сфингомиелина в клетках почек при экспериментальной ОПН. Выявлена роль оксидантного стресса в стимуляции апоптотических процессов в клетках почек в разных моделях ОПН.
Впервые обнаружена модуляционная способность даларгина, налоксона, каптоприла, нитроаминогуанидина, индометацина на программу клеточной гибели. Раскрыт антиапоптотический механизм действия даларгина через активацию К+АТФ - каналов митохондрий и активацию N0-синтазы в условиях развития ОПН.
Впервые получены ЯМР-характеристики почечной ткани в условиях стимулированного апоптоза и при модуляции программы клеточной гибели различными препаратами.
Практическая значимость работы
Вклад бифункционального характера действия оксида азота, развития оксидантного стресса и активации метаболитов сфингомиелина в стимулировании апоптотических процессов при экспериментальной ОПН позволит углубить знания о данном явлении на молекулярном уровне, установить роль программированной клеточной гибели в патогенезе
почечной патологии. Модуляционные эффекты исследованных препаратов на
процессы апоптоза могут быть полезными при фармакологических
исследованиях, связанных с использованием препаратов в
экспериментальной и клинической практике.
Изучение показателей ЯМР-релаксации протонов тканевой воды при различных моделях ОПН с позиции апоптоза, с одной стороны, позволит раскрыть ^-протонные механизмы клеточного объема, а с другой, подведет патогенетическую базу под диагностику степени апоптоза методом ЯМР-релаксометрии.
Понимание роли оксида азота в сигналпередающих системах апоптоза раскроет пути его фармакологической коррекции донаторами или блокаторами эндогенного оксида азота в клинической практике.
Апробация материалов диссертации
Результаты исследований, вошедшие в диссертацию, были доложены на Международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (г.Москва, 2004г.), 15-й Европейской конференции молодых ученых (ФРГ, г. Берлин, 2004 г.), 5-ом Межнародном конгрессе студентов-медиков (Польша, г. Катовицы, 2000 г.), 4-ом Межнародном конгрессе студентов-медиков (Польша, г. Катовицы, 1998 г.), IX Конгрессе международного общества украинских врачей (Чикаго, 2002).
Внедрение результатов исследования в практику
Внедрение полученных результатов в практику осуществляется следующими путями:
Материалы диссертации опубликованы в печатных работах, докладывались на съездах, научных и научно-практических конференциях.
Результаты работы используются в учебном процессе при обучении докторантов, аспирантов и научных сотрудников методам биохимического анализа тканей и клеточных культур.
Характеристика ряда широко используемых лекарственных препаратов в плане влияния на процессы апоптоза (как индукторы, так и супрессоры) может иметь нацеленность на выход полученных данных в клиническую практику.
ЯМР-параметры ткани в динамике введения препаратов-антиоксидантов могут рассматриваться как положительный тест при оценке стабилизации гомеостаза в клетках почек.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 28 научных работ.
Структура и объем диссертации
