Введение к работе
Актуальность проблемы. С момента своего открытия в начале 50-х годов универсальная оксигеназа зшвых систем -цитохром Р-450 привлекает пристальное внимание исследователей. Цитохром Р-450 обнаружен в клетках представителей животного,.растительного и бактериального миров. Цитохром Р-450-содержащие системы участвуют в окислении как эндогенных субстратов - холестерина, стероидных гормонов, жирных кислот, так и ксенобиотиков - лекарственных веществ, пестицидов, канцерогенов, мутагенов и т.д. Несмотря на большое число работ, посвященных структуре и механизму функционирования цитохромов Р-450. влия~ ние субстратов и липидов на структуру восстановленного белка является в настоящее время наименее изученным вопросом. Большие возможности для изучения свойств восстановленных цитохромов Р-450 открывает исследование кинетики присоединения к белку окиси углерода и влияния на нее различных физико-химических факторов: наличия и химической природы субстратов, липидного микроокружения, поверхностно-активных веществ и т.д.
Цель работы заключалась в исследовании влияния субстратов и липидного микроокружения на физико-химические свойства восстановленной формы цитохромов Р-450 из различных источников. Конкретные задачи исследования состояли в следующем:
-
изучение кинетики реакции рекомбинации цитохромов Р-450 с окисью углерода;
-
изучение влияния субстратов типа I и липидного микроокружения на кинетику реакции цитохромов Р-450 с СО;
3) изучение влияния субстратов и липидов на реакцию восстановления цитохромов Р-450 радикалами метилвиологена.
Научная новизна работы. В работе впервые систематически изучены реакции комплексообразования СО с восстановленной формой цитохромов Р-450 из различных источников, в частности, из дрожжей Candida maltosa. Показано, что реакция присоединения СО к цитохрому Р-450 из дрожжей С. maltosa описывается однофазной кинетикой. Установлено, что при фотодиссоциации кар-боксикомплекса цитохрома Р-450 Ш-2 образуются неравновесные конформеры с повышенной реакционной способностью. На основе данных по квантовым выходам фотодиссоциации карбоксикомллек-сов и ЭПР спектроскопии цитохромов Р-450 сделан вывод о разной стереохимии ниэкомолекулярного лиганда в координационной сфере гемового железа (II) белков и влиянии на нее субстратов и их химического строения. Впервые изучена кинетика восстановления цитохромов Р-450 радикалами метилвиологена в растворе и в присутствии субстратов и липидов. Установлено, что эти реакции описывается двухстадийной кинетикой, что объясняется наличием в агрегатах белка двух состояний. Показано, что наличие субстратов и липидов приводит к увеличению констант скорости восстановления цитохрома Р-450.-
Практическая ценность работы.
Кинетический подход,разработанный в диссертации,может использоваться для определения изоферментного состава препара-
- з -тов цитохрома Р-450. Результаты работы следует учитывать при изучении процессов активации молекулярного кислорода в ходе монооксигеназных реакций. Результаты также могут быть полезны для понимания превращений, происходящих в активном центре цитохрома Р-450 в процессе ферментативного гидроксилирования. Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на конкурсе научных работ ИХФ АН СССР (1985г.), на Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека". Москва (1985г.), на Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды". Новосибирск (1987г.), на Международной конференции "Свободные радикалы в биологии и медицине", София (1988г.), на Всесоюзной конференции "Цитох-ром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта (1989г.).
Публикации. Ш материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена нд 125 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 15 таблиц. Библиография включает 137 наименований.