Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10
1.1. Свойства белков в органических растворителях с 10
низким содержанием воды
Ферментативная активность в безводных 10 органических растворителях
Термостабильность белков в органических 12 растворителях
Регио и энантиоселективность белков, 17 суспендированных в органических средах
Субстратная специфичность 19
Связывание лигандов и явление «молекулярной 20 памяти»
Исследования влияния природы органического 23 растворителя и его влагосодержания на свойства белков
Изучение состояния белков в органических средах с 31 использованием структурных методов
Термодинамические исследования межмолекулярных 35 взаимодействий, определяющих поведение белков в органических средах
Адсорбция воды на белках в органических средах 35
Адсорбция паров органических растворителей на 36 белках
Теплоемкость и термодинамические характеристики 37 сухих белков
Влияние влажности белка на его теплоемкость 40
'-у
1.4.5. ГЛАВА 2. 2.1
2.2. 2.2.1.
2.2.2.
2.1.4.
2.2.4.
2.3.
2.3.1.
2.3.2.
2.3.3. 2.3.4.
ГЛАВА 3.
3.2.
J.J.
Калориметрические исследования
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Постановка задачи, выбор объектов исследования,
экспериментальных методов, программа
исследования
Реактивы и материалы
Подготовка растворителей
Сывороточный альбумин человека. Характеристики
препарата и свойства белка
Бычий панкреатический а-химотрипсин
Характеристики препарата и свойства белка
Растворимость белков в органических средах
Физико-химический эксперимент
Калориметрический эксперимент
Определение содержания воды в органических
растворителях
ИК-спектроскопические измерения
Изучение термостабильности белков методом
дифференциальной сканирующей калориметрии
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
СИСТЕМА «СУХОЙ БЕЛОК + ОРГАНИЧЕСКИЙ
РАСТВОРИТЕЛЬ + ВОДА»
Тепловые эффекты, наблюдающиеся при внесении
осушенных белков в органические растворители с
низким содержанием воды
Изменения в ИК-спектрах, наблюдающиеся при
внесении осушенных белков в безводные
органические растворители
Особенности структурных изменений в этаноле,
метаноле, воде и ДМСО
Влияние природы растворителя на величины 87 калориметрических и ИК-спектроскопических характеристик состояния белков
Влияние гидрофильности растворителей на 95 величины калориметрических и ИК-спектроскопических характеристик состояния белков
Проявления термодинамической неравновесности 100 осушенных белков в результатах дифференциальной сканирующей калориметрии
Влияние протонодонорной способности 102 растворителя
Дифференциация действия растворителей на 104 осушенные белки
ГЛАВА 4. СИСТЕМА «УВЛАЖНЕННЫЙ БЕЛОК + 107
ОРГАНИЧЕСКИЙ РАСТВОРИТЕЛЬ+ВОДА»
4.1 Тепловые эффекты смачивания препарата 108
сывороточного альбумина человека, содержащего
10% воды, водно-органическими смесями
4.2 Тепловые эффекты десорбции воды с белка в 111
органических средах
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 120
ЛИТЕРАТУРА 122
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время является общепризнанным, что взаимодействия молекул с окружением могут оказывать значительное влияние на протекание различных биологических и физико-химических процессов. Так, интенсивно развивающиеся последние два десятилетия работы в области ферментативного катализа в органических средах с низким содержанием воды открыли новое научное направление, демонстрирующее широкие возможности управления ферментативными реакциями путем варьирования природы растворителя [1-11]. В таких системах смена естественного водного окружения белка на нетипичное органическое (с образованием поверхности, разделяющей твердую фазу белка, и жидкую фазу, содержащую органический компонент) приводит к тому, что белковые макромолекулы демонстрируют новые уникальные качества: повышенную термостабильность; возможность катализировать реакции, не протекающие в присутствии ферментов в водных растворах (например, ацилирование, переэтерификацию, синтез пептидов); явление «молекулярной памяти» -способность осушенных белков запоминать «водную» конформацию субстрата и селективно сорбировать их из органических сред. Успехи неводной энзимологии явились основанием для введения термина «растворная инженерия» ("medium engineering" [1]).
Однако, несмотря на впечатляющие успехи в практическом использовании ферментов в органических средах, целый ряд вопросов до настоящего времени остается в значительной степени открытым:
- Какие параметры органического растворителя (размер молекул, полярность, гидрофобность, способность к специфическим взаимодействиям) оказывают наиболее существенное влияние на свойства белков (в т.ч. на вторичную структуру, термостабильность) ?
- Каковы механизмы такого влияния; насколько зависимость свойств таких
систем от природы растворителя чувствительна к природе самого белка, его
биологической функции ?
- Насколько состояние белка в таких системах близко к состоянию в
естественном водном окружении ?
В настоящее время становится очевидным, что изучение физико-химических закономерностей взаимодействия белков с компонентами водно-органических смесей позволяет не только оптимизировать различные биотехнологические процессы, но и существенно расширяет наши представления о стабильности белковых макромолекул и межмолекулярных силах, поддерживающих каталитически активную конформацию ферментов; дает информацию, недоступную в рамках традиционных «водных» исследований; создает предпосылки для прояснения роли воды в биокатализе [12,13].
Поэтому количественный анализ межмолекулярных процессов в сложных гетерогенных системах, содержащих белок, органический растворитель и воду, представляет собой важную научную проблему, решение которой представляется актуальным и практически значимым.
Целью настоящей работы является:
Изучение энергетики образования гетерогенных систем «белок -органический растворитель + вода»;
Выделение вкладов межмолекулярных взаимодействий типа «белок-вода» и «белок - органический растворитель» в суммарных тепловых эффектах образования систем «белок + органический растворитель + вода»
3) Выяснение возможности, исходя из информации по структуре
молекулы растворителя, прогнозирования влияния органической среды на
межмолекулярные взаимодействия типа «белок-вода» и «белок - органический
растворитель»;
4) Построение феноменологической модели, позволяющей прогнозировать изменения в состоянии белков в неводных органических средах, а также их способности к взаимодействию с водой.
Решение этих задач требует применения эффективных и информативных методов анализа, способных дать термодинамическую информацию о межмолекулярных взаимодействиях типа «белок-вода» и «белок -органический растворитель». Поэтому экспериментальной основой настоящего исследования является анализ данных, полученных с использованием метода калориметрии.
В качестве объектов исследования были выбраны два не родственных белка - транспортный белок сывороточный альбумин человека (САЧ) и фермент бычий панкреатический химотрипсин (XT) - существенно различающихся по типу нативной конформации и механизму функционирования.
Научная новизна. В ходе выполнения работы впервые методом
изотермической калориметрии было измерено более 100 величин тепловых
эффектов смачивания осушенных и увлажненных белковых препаратов в
органических растворителях с низким содержанием воды, а также тепловых
эффектов растворения этих же препаратов в воде при 25С. Ряд растворителей
включал в себя ароматические, галогензамещенные и нитрозамещенные
углеводороды, серию моноатомных алифатических спиртов и
протоноакцепторных сред, карбоновую кислоту. Для всех этих растворителей
были впервые рассчитаны величины свободных энергий растворения воды при
НпО бесконечном разбавлении AG ~ . Впервые выявлена линейная корреляция
между тепловыми эффектами величинами структурных интегральных изменений, сопровождающими процесс внесения сухих белков в неводные органические среды. Впервые установлено, что стабильность сухих белков при комнатной температуре к воздействию органического растворителя может быть качественно предсказана, исходя из анализа величины свободной энергии
растворения воды в растворителе при бесконечном разбавлении AG - и
протонодонорной способности среды. Впервые установлено, что сольватация воды играет определяющую роль в процессе десорбции воды с белка в растворителях с высокой степенью гидрофильности.
Работа изложена на 130 страницах, иллюстрирована 45 рисунками и 37 таблицами. В первой главе изложен обзор свойств систем, в которых твердые белковые препараты непосредственно помещаются в органические среды. Проанализирована имеющаяся в литературе информация о процессах, определяющих свойства белков в органических растворителях. Показана актуальность изучения состояния белковых макромолекул в таких гетерогенных системах, очерчен круг актуальных проблем.
Описание экспериментальной части работы представлено во второй главе. Она включает в себя обоснование выбора объектов исследования и методов экспериментального изучения, описание программы исследования. Во второй главе изложены методики калориметрического и ИК-спектроскопического экспериментов, а также сведения по подготовке растворителей и характеристике препарата белков и их свойствам.
В третьей главе изложены результаты собственных термохимических исследований по выделению вклада взаимодействия белок - органический растворитель в суммарные тепловые эффекты образования систем «белок-органический растворитель - вода». Осуществлена разработка качественной модели, позволяющей прогнозировать стабильность сухих белков при комнатной температуре в безводных органических средах
В четвертой главе на основании анализа собственных и литературных калориметрических данных, характеризующих процесс десорбции воды с белка в растворитель, предложен экспериментальный прием, позволяющий проводить выделение тепловых эффектов десорбции воды с белка в растворитель в суммарные тепловые эффекты образования систем «белок - органический растворитель - вода». Показано, что в случае гидрофильных растворителей
энтальпии сольватации воды в растворителе при бесконечном разбавлении вносят определяющий вклад в изменения величин тепловых эффектов десорбции воды с белка.
Диссертационная работа была выполнена на кафедре физической химии Казанского Госуниверситета имени В.И. Ульянова-Ленина. Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям проф., д.х.н. Соломонову Б.Н. и с.н.с, к.х.н. Сироткину В.А. за ценные советы и поддержку при выполнении диссертационной работы.
Автор благодарит кандидата биологических наук, научного сотрудника Казанского Института Биохимии и Биофизики КНЦ РАН Файзуллина Д.А. за помощь и ценные советы, полученные при обсуждении ИК-спектроскопических данных.
Автор благодарит научного сотрудника кафедры физической химии КГУ Захарычева Д. В. за помощь при проведении экспериментов методом дифференциальной сканирующей калориметрии.
