Содержание к диссертации
Введение
3. Обзор литературы 9
3.1. Крахмал и мальтодекстрины, как структурообразующие компоненты пищевых систем 9
3.2. Роль взаимодействия крахмала и мальто декстринов с низкомолекулярными поверхностно-активными веществами (ПАВ) в структурообразующих свойствах полисахаридов 15
3.3. Роль взаимодействия крахмала и мальто декстринов с белками в структурообразующих свойствах биополимеров 20
3.4. Комплексообразование белков с низкомолекулярными ПАВ 27
4. Цели и задачи работы 32
5. Экспериментальная часть 33
5.1. Объекты исследования 33
5.1.1. Легумин 33
5.1.2. Мальтодекстрины 35
5.1.3. Амилоза и амилопектин 35
5.1.4. Низкомолекулярные поверхностно-активные вещества (ПАВ) 35
5.2. Методы исследования 39
5.2.1. Приготовление растворов биополимеров, низкомолекулярных ПАВ и их смесей 39
5.2.2. Методика выделения легумина ("11S" глобулиновой фракции) из кормовых бобов 42
5.2.3. Определение концентраций и инкрементов показателей преломления в растворах биополимеров и их комплексов с низкомолекулярными ПАВ 43
5.2.4. Калориметрия смешения 44
5.2.5. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) 45
5.2.6. Тензиометрия 45
5.2.7. Метод статического лазерного светорассеяния 47
5.2.8. Метод динамического лазерного светорассеяния 51
5.2.9. Вискозиметрия 52
5.2.10. Оценка пёнообразующей способности биополимеров их комплексов с низкомолекулярными ПАВ 53
6. Результаты и их обсуждение 54
6.1. Влияние мальтодекстринов на термодинамические свойства легумина в объёме водного раствора и на границе раздела фаз вода/воздух 54
6.1.1. Простые смеси мальтодекстринов и легумина в водной среде 54
6.1.2. Ковалентные конъюгаты мальтодекстринов и легумина в водной среде 63
Заключение по части 6.1. 66
6.2. Термодинамический анализ процессов структурообразования в смесях мальтодекстринов с низкомолекулярными ПАВ 68
6.2.1. Влияние структуры индивидуальных молекул низкомолекулярных ПАВ и мальтодекстринов на характер их взаимодействия в водной среде 69
6.2.2. Модификация молекулярных и термодинамических параметров мальтодекстринов посредством их взаимодействия с низкомолекулярными ПАВ 75
6.2.3. Влияние мальтодекстринов на поверхностную активность низкомолекулярных ПАВ на границе раздела фаз воздух/вода 91
Заключение по части 6.2. 98
6.3. Термодинамический анализ роли мальтодекстринов в структурообразующей способности тройных систем: мальтодекстрин - легумин - НМ ПАВ 99
6.3.1. Термодинамический анализ характера взаимодействия между мальтодекстринами и легумином, модифицированных взаимодействием с анионными низкомолекулярными ПАВ 99
6.3.2. Влияние мальтодекстринов на конформационную стабильность легумина в присутствии анионных низкомолекулярных ПАВ 106
6.3.3. Влияние мальтодекстринов на структурообразующую способность смесей легумина с низкомолекулярными ПАВ на границе раздела фаз вода/воздух . 112
Заключение по части 6.3. 119
Выводы 120
Список литературы 121
- Крахмал и мальтодекстрины, как структурообразующие компоненты пищевых систем
- Метод статического лазерного светорассеяния
- Модификация молекулярных и термодинамических параметров мальтодекстринов посредством их взаимодействия с низкомолекулярными ПАВ
- Влияние мальтодекстринов на структурообразующую способность смесей легумина с низкомолекулярными ПАВ на границе раздела фаз вода/воздух
Введение к работе
Актуальность темы Для того чтобы ближе подойти к пониманию процессов структурообразоваиия в наиболее важных для практики многокомпонентных биополимерных системах актуальным является усложнение модельных систем и переход от наиболее изученных "бинарных" систем, содержащих, два ключевых компонента к "тройным" системам, содержащим третий ключевой для системы компонент. Такая задача, в частности, является актуальной для коллоидных систем пищевого и фармацевтического назначения, в которых эмульгаторами или пенообразователями выступают, как правило, смеси белков и низкомолекулярных поверхностно активных веществ (НМ ПАВ), а стабилизаторами структуры -различные по природе полисахариды. К моменту начала нашей работы взаимное влияние этих ключевых компонентов на их структурообразующие свойства в объёме водной среды и на границе раздела фаз в таких "тройных" системах оставалось практически неизученным. Это не только осложняло выбор и целенаправленное использование, формирующих структуру коллоидных систем, компонентов, но и сдерживало выпуск продукции, обладающей усовершенствованными или уникальными составом, структурой и физической стабильностью.
Актуальность проведённого исследования также обусловлена выбором "тройной" системы для изучения, а именно, системы: легумин — мальтодекстрин — НМ ПАВ, в которой легумин и мальтодекстрины по отдельности являются одними из наиболее перспективных ингредиентов для разработки инновационных продуктов пищевого и фармацевтического назначения. Так, легумин (11S глобулин) - это основной запасной белок кормовых бобов, который является полноценным растительным белком, и, кроме того, аналогом 11S глобулинов других широко распространённых семян бобовых, например, сои или гороха. Повышенный интерес к свойствам этих белков в настоящее время обусловлен всё возрастающими требованиями потребителей по замене животных белков растительными в выпускаемых продуктах коллоидного типа. В свою очередь мальтодекстрины, являясь продуктами ферментативного гидролиза главного резервного полисахарида растений,
крахмала, лишены многих, присущих ему недостатков. Они хорошо растворяются как в холодной, так и в горячей воде и при этом способны эффективно контролировать вязкость и текстуру выпускаемых продуктов; они обладают антикристаллизационными свойствами, могут связывать больше воды, по сравнению с нативными крахмалами и препятствовать процессу синерезиса (т.е. отделения воды) в крахмалсодержащих продуктах; кроме того, их гелеобразующие, наиболее высокомолекулярные, фракции обладают органолептическими свойствами схожими со свойствами жиров, что определяет их успешное использование в качестве заменителей жиров в разработке низкожирных продуктов. Таким образом, мальтодекстрины находят всё более широкое и разнообразное применение, благодаря предоставляемой ими уникальной возможности решать в комплексе возникающие перед производителем задачи. Однако, целенаправленное использование как мальтодекстринов, так и растительных белков, на практике сдерживается недостатком фундаментальных знаний об их поведении в реально важных многокомпонентных системах, к которым можно, например, отнести пищевые коллоидные системы. Так, в частности, к моменту начала нашей работы наиболее полно было изучено взаимодействие пищевых белков животного и растительного происхождения с НМ ПАВ, тогда как только ограниченная информации была доступна о взаимодействии НМ ПАВ с мальтодекстринами. При этом оставался открытым вопрос о механизме взаимодействия нейтральных молекул мальтодекстринов с амфифильными молекулами заряженных /незаряженных НМ ПАВ в водной среде. Кроме того, в литературе отсутствовали данные о характере взаимодействия и взаимовлияния 11S глобулинов и мальтодекстринов в смешанных растворах и коллоидных системах.
Цель и задачи работы Используя термодинамический подход, мы ставили своей целью изучение роли межмолекулярных взаимодействий в трёхкомпонентном модельном водном растворе: легумин - мальтодекстрин - НМ ПАВ в процессах структурообразования, протекающих, как в объеме, так и на границе раздела фаз вода-воздух такого раствора. Для достижения поставленной цели мы планировали решение следующих задач:
-
Охарактеризовать термодинамику парных взаимодействий легумин -мальтодекстрин и мальтодекстрин — НМ ПАВ в водной среде в зависимости от степени полимеризации мальтодекстринов и структуры НМ ПАВ.
-
Установить корреляции между обнаруженным характером взаимодействия мальтодекстринов и легумина, а также мальтодекстринов и НМ ПАВ, в объёме водной среды и поверхностной активностью белка и НМ ПАВ на границе раздела фаз вода/воздух.
-
На основании объединённых данных по термодинамике взаимодействия мальтодекстринов с НМ ПАВ и характеристике молекулярных параметров, образующихся между ними комплексов, предложить схему молекулярного механизма взаимодействия и взаимного влияния мальтодекстринов и НМ ПАВ на их структурообразующие свойства в водной среде.
-
Охарактеризовать термодинамику парных взаимодействий между модифицированными с помощью НМ ПАВ мальтодекстринами и легумином.
-
Изучить влияние мальтодекстринов на конформационную стабильность легумина в присутствии НМ ПАВ.
-
Охарактеризовать влияние мальтодекстринов на поверхностную активность смесей легумина с НМ ПАВ.
Для достижения поставленной цели и решения перечисленных задач в качестве основных объектов исследования были выбраны: основной запасной белок семян кормовых бобов - легумин (11S глобулин), в его нативном состоянии; мальтодекстрины различной степени полимеризации, полученные ферментативным гидролизом из картофельного крахмала; ряд анионных НМ ПАВ, а именно, деканоат натрия CITREM (сложный эфир лимонной кислоты и моноглицерида) и SSL (натриевая форма сложного эфира молочной кислоты с жирной кислотой). По данным фирмы производителя CITREM и SSL, исследуемые в работе, содержали практически равные количества стеариновой и пальмитиновой жирных кислот (Рис. 1).
СН2-0-СО-(СН2)„-СНз
CH3-(CH2)8-COONa* |
CH-OH
сн2-о-с = о
СИ,
I I
CH* CHj СНО-СО-(СН2)„-СН3
но-с-соо- сно-с=о
I I
CH* COO" Na*
COO'
(a) (6) (в)
Рисунок 1. Химические формулы анионных НМ ПАВ: (а) - модельный - деканоат натрия; промышленно важные НМ ПАВ (п = 14 или 16): (б) — CITREM и (в) - SSL.
Научная новизна работы
-
Используя термодинамический подход, нам, впервые, удалось установить прямые корреляции между характером взаимодействий мальтодекстринов с легумином в объёме водной среды и поверхностной активностью белка на границе раздела фаз вода/воздух. Также, впервые, установлено влияние степени полимеризации мальтодекстринов на характер их взаимодействия с легумином в водной среде.
-
Впервые, выявлена роль структуры, как мальтодекстринов, так и НМ ПАВ в их взаимодействии в водной среде.
-
Впервые, предложена термодинамически обоснованная схема молекулярного механизма взаимного влияния мальтодекстринов и НМ ПАВ на их структурообразующие свойства в объёме водного раствора и на границе раздела фаз вода/воздух.
-
Используя термодинамический подход, нам, впервые, удалось установить природу влияния мальтодекстринов на изменение поверхностной активности смешанных растворов легумина с НМ ПАВ на границе раздела фаз вода/воздух.
Практическая значимость работы Проведённое систематическое термодинамическое исследование, раскрывая природу взаимного влияния компонентов в процессах формирования структуры в изученных системах, даёт возможность разработки новых природных эмульгаторов и стабилизаторов для коллоидных систем пищевого и фармацевтического назначения. Кроме того, в данной работе продемонстрированы преимущества применённого для исследований термодинамического подхода, позволяющего глубже понять молекулярные механизмы взаимодействий и модификации структурообразующих свойств биополимеров в многокомпонентных растворах, содержащих также НМ ПАВ, что открывает возможности предсказания, регулирования и молекулярного дизайна широкого круга систем в практике современных биотехнологических исследований.
Апробация работы Материалы диссертации были представлены в виде устных и стендовых докладов на Конкурсе молодых ученых ИБХФ РАН (Москва 1999г.), Конкурсе научных работ (Москва, ИБХФ РАН 2007г.); Международной Конференции молодых ученых "Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов", посвященная памяти М.Н. Манакова (Москва 2000г.), XI Международной конференции по крахмалу (Москва 2003г.) и на трех международных конференциях Food Colloids (Germany 2000г., United Kingdom 2004r.t Switzerland 2006г.).
Публикации По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 6 статей (2 статьи опубликованы в зарубежных журналах, вошедших в перечень, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских диссертаций, 2 статьи - в зарубежных изданиях, включенных в систему цитирования Web of Sciences (Sciences Citation Index Expanded) и 2 статьи - в книгах докладов международных конференций с шифром ISBN), а также 6 тезисов докладов на международных конференциях.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка, 17 таблиц и состоит из введения, 4 глав литературного обзора, 2 глав экспериментальной части, 3 глав обсуждения результатов, а также выводов и списка литературы (340 ссылок).
Крахмал и мальтодекстрины, как структурообразующие компоненты пищевых систем
В литературе существует достаточное количество источников, из которых мы можем получить подробную информацию, существующую на сегодняшний день, как о составе, структуре и функциональных свойствах крахмала, так и о его возможном применении. Помимо того, что нативные крахмалы, выделенные из разнообразного растительного сырья, находят широкое применение в пищевой, текстильной и целлюлозно-бумажной промышленности, их также перерабатывают и модифицируют с целью получения разнообразных и высокофункциональных ингредиентов для этих отраслей промышленности [1-Ю].
Что касается нативного крахмала, то он является главным резервным полисахаридом растений и представляет собой смесь амилозы и амилопектина, соотношение которых зависит от вида растения и стадии его развития (15 -25% амилозы и 75- 86% амилопектина). Крахмал также может содержать в незначительном количестве как органические (липиды, протеины, ферменты, аминокислоты и т.п.), так и неорганические (фосфаты, соли металлов) примеси [1, 2, 11]. Различные физико-химические, термические, реологические и ретроградационные свойства крахмалов зависят от среднего размера гранул, количественного отношения амилозы к амилопектину, а также от минерального состава образцов [12-41]. В крахмалосодержащих продуктах желатинизация и последовательная реорганизация макромолекул в процессе хранения контролируют текстуру и стабильность конечного продукта.
Один из основных компонентов крахмала - амилоза представляет собой, главным образом, линейный полисахарид, составленный из длинных неразветвленных цепей глюкозных остатков, соединенных а-(1,4)-глюкозидными связями, число которых зависит от вида растения и в среднем составляет около 1000. Молекулы амилозы способны скручиваться в спираль, причем один виток состоит в среднем из шести глюкозных остатков [1, 2, 42]. Эта способность амилозы лежит в основе формирования ее молекулами спиральных комплексов включения с различными лигандами. В растворе линейные молекулы амилозы могут располагаться одна вдоль другой, образуя множество водородных связей, и тем самым формируя прочные гели. Кроме того, линейные молекулы амилозы склонны к образованию двойных спиралей, что может сопровождаться их рекристаллизацией, известной как процесс ретроградации крахмала, при этом может происходить уплотнение и расслоение первоначально однородного геля. Склонность гелей к ретроградации повышается по мере увеличения длины молекулы амилозы [1,2, 42-45].
Другой основной компонент крахмала - амилопектин имеет сильно разветвленные молекулы, состоящие из фрагментов амилозы (около 20 моносахаридных остатков), связанных между собой а-(1,6)-глюкозидными связями. В структуре амилопектина различают центральную цепь с количеством звеньев более 60, несущую остаток глюкозы со свободной восстанавливающей группой; короткие цепи из 15-20 остатков (S-цепи), расположенные на периферии молекулы и внутри нее; и длинные (около 45 звеньев) L-цепи. В отличие от амилозы, боковые цепи амилопектина в основном представляют собой короткие двойные спирали, которые объединены в кластеры, придающие амилопектину жесткую структуру. Упорядоченное расположение в пространстве этих двойных спиралей обеспечивает крахмалу его полукристаллический характер. Высокая степень разветвления также делает амилопектин одним из наиболее высокомолекулярных биополимеров, встречающихся в природе [2, 46]. В воде амилопектин, также как амилоза, образует мицеллярные растворы, однако, вследствие того, что амилопектин обладает большей молярной массой по сравнению с амилозой, он формирует более вязкие, но непрочные гели. Также, разветвлённые молекулы амилопектина образуют пространственные затруднения, препятствующие процессу ретроградации, однако, при достаточной длине боковых цепей в молекулах амилопектина, также возможно протекание этого процесса [1, 2, 42-45].
Хорошо известно, что в горячей воде крахмал набухает, а при добавлении неорганических кислот постепенно гидролизуется с уменьшением молекулярной массы, вплоть до глюкозы [47]. В настоящее время гидролиз крахмала также проводят ферментативно, с использованием а-амилазы [48, 49], которая содержится в слюне, а также выделяется поджелудочной железой. В результате гидролиза крахмала могут получиться декстрины различной длины, поэтому, например, образцы мальтодекстринов представляют собой, как правило, смеси углеводов с разной степенью полимеризации (от глюкозы до высокомолекулярных полисахаридов), свойства и количественное соотношение которых зависит как от способа гидролиза, так и от вида используемого сырья [50]. Так, в частности, выбранные для нашего исследования мальтодекстрины являлись продуктами ферментативного гидролиза картофельного крахмала и обладали различной степенью полимеризации (См. 5.1.2.). Мальтодекстрины, как правило, содержат остатки линейных молекул амилозы и разветвленных молекул амилопектина [51-55] и могут быть записаны общей формулой: Н (СбН10О5)п ОН.
Степень гидролиза мальтодекстринов может быть различной и может характеризоваться таким показателем, например, как "декстрозный эквивалент" (DE). Декстрозный эквивалент определяет восстанавливающую способность D-Глюкозы (декстрозы), измеряемую в граммах на 100 г сухого вещества, при этом принято, что чистая D-Глюкоза имеет DE равный 100. Значение DE определяется как отношение восстанавливающей способности гидролизованного материала (%) к восстанавливающей способности декстрозы (%), умноженное на 100 [56] DE является также индикатором степени деполимеризации крахмала (чем больше DE, тем больше степень гидролиза крахмала, и наоборот). Декстрозный эквивалент мальтодекстринов варьируется от 1 до 20, а глюкозных сиропов - от 20 до 40 [57, 58].
Крахмалы давно и широко использовались в приготовлении пищи как компоненты, способные придать ей крепкую, гелеобразную и приятную текстуру [42]. При этом, однако, гели крахмала имели ряд недостатков, таких например, как нестойкость к рН, нагреванию, охлаждению, а также интенсивному механическому воздействию. Что, как правило, проявлялось в выделении воды и потере вязкости гелей [59-62]. Поэтому, сегодня для оптимизации коммерчески важных свойств крахмала, а также для создания продуктов с желаемыми органолептическими свойствами, практически всегда требуется применение дополнительных ингредиентов наряду с крахмалами. Так, например, чтобы избежать ретроградации крахмала, которая ведет к нежелательной жесткости и "сухости" готовых пищевых продуктов на основе крахмала, при производстве к крахмалу добавляют различные моноацильные полярные липиды [63]. Позитивный эффект от добавления липидов, как правило, объясняется образованием спиральных комплексов включения между липидами и амилозой [64]. Другим объяснением является предположение о комплексообразовании между боковыми цепями амилопектина и липидами, что замедляет ретроградацию амилопектина и улучшает качество крахмалосодержащих продуктов [65-67].
У мальтодекстринов, как более низкомолекулярных продуктов гидролиза, большинство перечисленных недостатков, присущих крахмалу, отсутствуют. Так, независимо от величины DE, мальтодекстрины хорошо растворяются как в холодной, так и в горячей воде, образуя при этом растворы с различными показателями вязкости, при этом, чем ниже значение DE, тем выше вязкость раствора мальтодекстрина. Благодаря меньшей молярной массе, мальтодекстрины усваиваются организмом лучше, чем обычный крахмал и имеют сравнительно небольшую скорость расщепления, обеспечивая тем самым длительное и равномерное поступление глюкозы в организм, кроме этого они улучшают и облегчают процесс растворения белков, а также обладают ценной способностью стимулировать рост полезной микрофлоры кишечника, что может способствовать профилактике дисбактериозов [45, 58].
Метод статического лазерного светорассеяния
Средневесовое значение молярной массы (Mw = EjWjMj) [320], z-среднее значение радиуса инерции (RQ = 1/N Е;ГІ , где Х\ - расстояние от мономерных единиц полимерной молекулы до центра масс молекулы, а N - число мономерных единиц полимерной молекулы) [320, 321], а также усредненные величины вторых вириальных коэффициентов (АБ_Б, Ане-ПС? АБ-пс, АКОМПЛ-КОМПЛ) определяли методом статического лазерного светорассеяния в разбавленных водных растворах биополимеров (от 1 х Ю-2 до 1 х 10 3 г/мл). Отношение Релея (Re Ie/Io, где 10 и 10 интенсивность рассеянного и падающего света, соответственно) было измерено с использованием вертикально поляризованного света (633 нм) при различных углах светорассеяния в диапазоне от 40 до 140 (13 углов) с использованием прибора лазерного многоуглового светорассеяния VA Instruments LS-01 (Санкт-Петербург, Россия), откалиброванного по обеспыленному бензолу (R9o = .11,84 х \0 6 см"1) [322]. Буферный раствор обеспыливали путём фильтрования через мембранные фильтры (Миллипор, США) с размером пор 0,22 мкм, в свою очередь, растворы биополимеров и их комплексов с НМ ПАВ обеспыливали через мембранные фильтры с размером пор 0,65-0,8 мкм. Концентрацию биополимеров и их комплексов с ПАВ проверяли каждый раз после фильтрации, используя известные величины v (Табл. 1).
В случае бинарного раствора типа "полимер-растворитель" данные светорассеяния использовались для построения угловой и концентрационной зависимости отношения HC/ARe согласно методу Зимма [322]. Где С - это концентрация биополимеров или их комплексов с НМ ПАВ (г/мл), ARe является избыточным рассеянием света раствором биополимером или комплекса, по отношению к чистому растворителю при угле измерения 0, а Н - это оптическая константа прибора, равная 47t2n2v2/NAA,4, где NA — число Авогадро, X - длина волны падающего света в вакууме, п - показатель преломления растворителя, a v - инкремент показателя преломления биополимеров и их комплексов с ПАВ. Значения средневесовой молярной массы (Mw) были определены как средние величины, рассчитанные в точках пересечения с осью ординат концентрационных зависимостей HC/ARe ПРИ Э-»0 (экстраполяция проведена по 13 углам) и угловых зависимостей HC/ARo при С— 0 (экстраполяция проведена по 5-8 концентрациям) для каждой изученной системы. Значения радиуса инерции (RG) определялись по наклону угловой зависимости HC/ARo при С—»0. Значения вторых вириальных коэффициентов (АБ-Б, АПС-ПС, А2) определялись из тангенсов угла наклона концентрационных зависимостей HC/ARe при 0— 0 для каждой системы. Вторые вириальные коэффициенты (АБ.Б, АПС-пс, Акомпл.компл) характеризуют, в первую очередь, термодинамическое сродство молекул полимера друг к другу или к растворителю (в нашем случае — к водной среде). Так, растворитель - термодинамически плохой (т.е. взаимодействия полимер-полимер термодинамически благоприятны), если А2 О или, напротив, растворитель термодинамически хороший (т.е взаимодействия полимер-полимер термодинамически неблагоприятны), если А2 0; если А2 = 0, то растворитель является термодинамически идеальным (т.е. все парные взаимодействия в растворе являеются термодинамически идентичными) [320]. Таким образом, при проведении измерений в водной среде величина второго вириального коэффициента косвенным образом даёт нам представление о гидрофобности/гидрофильности поверхности молекулы биополимера.
Значения Mw, А2 и RG, приводимые в данной работе, являются средними значениями по крайней мере двух повторов каждого эксперимента. Ошибка метода при определении Mw и А2 составляет примерно + 10 %. Ошибка в определении RQ составляет + 5 % [321, 322].
Для изучения взаимодействий неидентичных биополимеров в растворе типа "белок-полисахарид", мы использовали концентрационную зависимость светорассеяния смешанных растворов биополимеров, измеренную при постоянном соотношении концентраций полимерных компонентов. Серию растворов для измерений получали путем разбавления растворов смесей полимеров чистым буфером. Расчеты проводили по уравнению [323]: ЩСБ + СпЭ
ЛЕ-Е, АПС-ПС - второй вириальный коэффициент, характеризующий парные взаимодействия белка и полисахарида, соответственно; АБ-ПС- перекрестный второй вириальный коэффициент, характеризующий парные взаимодействия различных биополимеров (белка и полисахарида); С Б, Спс- концентрация раствора белка и полисахарида, соответственно; МН,Б, Mwnc- средневесовая молярная масса белка и полисахарида, соответственно; WE, wnc - весовая доля белка и полисахарида, соответственно; VE, vnc- инкремент показателя преломления белка и полисахарида и их комплексов с ПАВ, соответственно.
При этом значение перекрестного второго вириального коэффициента, АБ-пс3 можно определить из тангенса угла наклона зависимости Н(СБ + СпсУ [A Re]e=o от (СБ + Спс) по уравнению 6. Кроме этого, сравнение значения интерсепта, экспериментально полученного из этой зависимости со значением интерсепта, рассчитанного по уравнению 6, позволяет делать выводы о существенных изменениях отдельных биополимеров, которые они претерпевают (или не претерпевают) при смешении друг с другом [323].
Ошибка расчета перекрестного второго вириального коэффициента равна 30%.
Модификация молекулярных и термодинамических параметров мальтодекстринов посредством их взаимодействия с низкомолекулярными ПАВ
В этой главе, во-первых, представлены данные систематического исследования влияния концентрации анионных НМ ПАВ (до области ККМ) на особенности ассоциации мальтодекстрина с максимальной степенью полимеризации (SA2) в водной среде. Кроме этого, также были сопоставлены молекулярные и термодинамические параметры мальтодекстринов с различной степенью полимеризации (SA2, MD6 и MD10) в присутствии определенных концентраций CITREM и модельного НМ ПАВ - деканоата натрия. Получить такие данные позволило измерение многоуглового лазерного светорассеяния в бинарных растворах полисахарид - НМ ПАВ в статическом и динамическом режимах [321]. При этом, сравнение данных светорассеяния и значений характеристической вязкости позволило более достоверно охарактеризовать структуру формирующихся комплексных ассоциатов.
Так, в случае растворов, содержащих CITREM, на рисунке 10 (а, б) мы ВИДИМ, ЧТО С РОСТОМ МОЛЯРНОГО ОТНОШеНИЯ R = МОЛЬ CITREM / МОЛЬ глюкозы До 3 увеличивается молярная масса и радиус инерции мальтодекстрина SA2 в присутствии этого НМ ПАВ. Это может быть результатом эффективной ассоциации первоначально существующих в водной среде ассоциатов мальтодекстрина, благодаря гидрофобным взаимодействиям и водородному связыванию, в которых участвуют молекулы CITREM. Надо отметить, что в области максимума (R ЗхІО"4) на 10 тысяч молей глюкозных остатков приходится только 3 моля CITREM. Это может быть признаком образования комплексов включения между CITREM и линейными полимерными участками молекул мальтодекстрина SA2, которые при этом, очевидно, спирализуются. Эта спирализация, в свою очередь, инициирует спираль-спиральную агрегацию, поскольку, из литературных данных известно, что центральным событием межмолекулярной ассоциации и гелеобразования амилозы, является ее сворачивание в кооксиальные двойные спирали, которые затем могут образовывать ассоциаты. При этом средняя длина спирализованных участков в гелях амилозы составляет 5(Н70 глюкозных остатков [95]. Мальто декстрин SA2 располагает такой длиной молекул и, следовательно, способен формировать спирали. Кроме этого, гидрофобные взаимодействия между углеводородными радикалами молекул НМ ПАВ, присоединенных к молекулам мальтодекстрина, также могут способствовать ассоциации мальтодекстрина в водной среде.
При дальнейшем увеличении мольного отношения (R ЗхЮ"4), по-видимому, увеличивается электростатическое отталкивание внутри комплексных ассоциатов мальтодекстрина, в результате увеличения числа одноименно заряженных молекул анионного НМ ПАВ, присоединившихся к молекулам мальтодекстрина. Это приводит к понижению степени ассоциации мальтодекстрина, модифицированного CITREM, и, следовательно, к уменьшению его молекулярных размеров (Mw - молярной массы и RG - радиуса инерции). В области, близкой к ККМ (R 4x10"4), мы видим существенное возрастание Mw и RG, как следствие более эффективной ассоциации молекул мальтодекстрина множественными водородными связями, формирующимися в результате взаимодействия либо с высоко заряженными мицеллами CITREM, которые образуются в этой области, либо с единовременно освобождающимся из них при столкновении с молекулами мальтодекстрина большим числом индивидуальных молекул НМ ПАВ.
В свою очередь, структурно-чувствительный параметр р (Рис. Па) показывает, что архитектура комплексных ассоциатов мальтодекстрина имеют сферическую форму [321] во всей изученной области концентраций CITREM. Причем в области минимальных значений Mw и RG формирующиеся ассоциаты имеют архитектуру плотных сфер (р 1), тогда как в максимуме этих значений имеют менее плотную структуру случайных клубков (1 р 2).
Изменение величины второго вириального коэффициента (Рис. 116) указывает на прогрессирующее уменьшение термодинамического сродства к водной среде комплексных ассоциатов мальтодекстрина с ростом молярного отношения (R) практически до области ККМ. Такой результат, очевидно, показывает рост сил притяжения между комплексными ассоциатами мальтодекстрина в водной среде, что может быть признаком увеличения относительной гидрофобности поверхности первоначально существующих ассоциатов мальтодекстрина за счет присоединения к ним длинных углеводородных цепочек молекул анионного CITREM. При этом, значения моляльного вириального коэффициента (АМд-мд ) в большей степени отражают влияние на взаимодействие образующихся ассоциатов мальтодекстрина вклада исключенного объема [11, 306]. В таблице 7 представлено сравнение экспериментальных значений АМд-мд с теоретическими, которые характеризуют расчетный вклад физически исключенного объема ассоциатов мальтодекстрина, модифицированных НМ ПАВ, в их парные взаимодействия. В своих расчетах мы принимали комплексные ассоциаты мальтодекстрина как твердые сферы, а также, что исключенный объем - это физический объем, занимаемый одной полимерной частицей, который не доступен для других полимерных частиц в растворе. При этом теоретическая величина Амд-мд рассчитывалась по следующему уравнению [11, 320]:
Таким образом, данные таблицы 7 свидетельствуют о преобладании сил притяжения над силами исключения (отталкивания) в парных взаимодействиях между ассоциатами мальтодекстрина, модифицированных НМ ПАВ, в водной среде. Это отражается в существенно меньших положительных значениях или даже в отрицательных значениях экспериментально определенных Амд-мд по сравнению с расчетными. Поэтому предполагаемый вклад взаимного отталкивания одноименно заряженных "голов" молекул CITREM, присоединенных к мальтодекстрину, оказывается не таким существенным.
При взаимодействии CITREM с мальтодекстринами с меньшей степенью полимеризации (MD6 и MD10), их степень ассоциации (значения Mw) увеличивалась не так значительно, как в случае с SA2 (Табл. 8), в то время как возрастание положительной величины Амд-мд, а, следовательно, и термодинамического сродства мальтодекстринов к растворителю, происходило, напротив, значительно более существенно. Такой результат, по-видимому, является отражением возможности спирализации достаточно длинноцепочечных молекул мальтодекстрина SA2 (DE = 2; СП = 50), что, как уже говорилось выше, должно способствовать самоассоциации мальтодекстрина в водной среде [95]. При этом, по-видимому, спирализация и ассоциация мальтодекстрина SA2, которая, очевидно, протекает с участием гидроксильных групп полисахаридов, приводит к уменьшению их общего числа, экспонированных в водную среду. Что, в свою очередь, находит отражение в практически неизменной, в пределах ошибки опыта, величине Амд-мд Для комплексов по сравнению с чистым мальтодекстрином
Влияние мальтодекстринов на структурообразующую способность смесей легумина с низкомолекулярными ПАВ на границе раздела фаз вода/воздух
Приведенные выше данные предполагают, что обнаруженные в тройной системе мальтодекстрин - легумин - НМ ПАВ, как характер парных межмолекулярных взаимодействий в объеме водного раствора, так и изменение конформационной стабильности белка должны оказывать существенное влияние на поверхностную активность компонентов этих тройных систем.
Проведенный термодинамический анализ позволил выделить три основные причины, которые могут лежать в основе найденного влияния мальтодекстринов. В первую очередь, это может быть конкуренция между полисахаридами и белком за молекулы НМ ПАВ, т.е. НМ ПАВ перераспределяется между белком и полисахаридом таким образом, что в условиях нового равновесия поверхностная активность полученной смеси не может достичь значений, характерных для комплекса белка с НМ ПАВ (детальное изучение взаимодействий между легумином и НМ ПАВ представлены в статьях 233, 301, 302). Действительно, оказалось, что добавление мальтодекстринов к смеси легумин - НМ ПАВ приводило к значительному увеличению значений поверхностного натяжения на плоской поверхности вода/воздух, что практически нивелировало синергетический эффект от взаимодействия белка с НМ ПАВ, как это показано на рисунке 22 и в таблице 16 . Кроме этого, рисунок 22 демонстрирует влияние пути смешения компонентов трехкомпонентной системы мальтодекстрин -легумин - НМ ПАВ. В первую очередь, проведенное сравнение указывает на ухудшение поверхностной активности смеси белка с деканоатом натрия в присутствии мальтодекстрина независимо от пути смешения компонентов, и, во-вторых, наибольший эффект мальтодекстрина на поверхностную активность многокомпонентной смеси наблюдался при первоначальном смешении мальтодекстрина с деканоатом натрия и с последующим добавлением к этой смеси белка. Возможно, что в этом случае система либо еще не успела достичь равновесия за время эксперимента, либо взаимодействие деканоата натрия с мальтодекстрином приводило к формированию достаточного прочного комплекса включения, что можно ожидать для мальтодекстрина SA2, способного к спирализации. Однако, то, что трехкомпонентная система имеет промежуточное значение поверхностного натяжения между бинарными смесями НМ ПАВ с белком и мальтодекстринами независимо от пути их смешения, по всей вероятности, действительно свидетельствует о реально существующей конкуренции во взаимодействии с молекулами НМ ПАВ между гидрофобными в целом молекулами легумина и, напротив, в целом гидрофильными ассоциатами мальтодекстрина.
Второй причиной, лежащей в основе обнаруженного влияния полисахаридов на поверхностные свойства смесей белков с НМ ПАВ, можно считать изменение с термодинамической точки зрения взаимодействия модифицированных с помощью НМ ПАВ белка и полисахарида, что, очевидно, влияло на их термодинамическую активность в объеме водной среды. Так обнаруженное как методом калориметрии смешения, так и статическим светорассеянием, термодинамическое сродство в объеме водной среды между молекулами легумина и мальтодекстринов, модифицироанных взаимодействием с НМ ПАВ, и, в частности, даже формирование тройных комплексов мальтодекстрин — легумин - НМ ПАВ в случае с CITREM, однозначно указывает на понижение термодинамического активности модифицироанного легумина в объеме трехкомпонентной системы, что, очевидно, также могло препятствовать его адсорбции на границе раздела фаз.
Третьей причиной, лежащей в основе обнаруженного влияния мальтодекстринов на поверхностную активность комплексов легумина с НМ ПАВ, можно считать изменение конформационной стабильности белка в комплексе с НМ ПАВ в присутствии мальтодекстринов, так как хорошо известно, что способность глобулярных белков к их разворачиванию на границе раздела фаз определяет формирование вязкоэластичных и прочных адсорбционных слоев [340]. Так из данных представленных выше (Табл. 12-14) хорошо видно, что мальтодекстрины эффективно нивелируют уменьшение конформационной стабильности легумина в комплексе с НМ ПАВ, приводя тем самым к менее эффективному разворачиванию белка на границе раздела фаз, что влечет за собой понижение его поверхностной активности.
Обнаруженное понижение поверхностной активности комплексов белка с НМ ПАВ в присутствии мальтодекстринов приводило к формированию очень неустойчивых пен, время полураспада и дисперсность (размер пузырьков воздуха) которых оценивали визуально (Рис. 23 и Табл. 17). Так добавление мальтодекстринов к смешанным растворам белка и НМ ПАВ, как правило, приводило, к уменьшению времени полураспада более грубодисперсных пен (изначальное формирование более крупных пузырьков воздуха в пене), что наглядно продемонстрировано на рисунке 23 (на примере растворов, содержащих CITREM).
При этом здесь следует также отметить, что бинарные смеси мальтодекстрин - НМ ПАВ, а также чистые растворы CITREM и SSL не дают стабильных пен при выбранных для исследования концентраций НМ ПАВ, а именно 0,0005 % вес/объем и 0,0001 % вес/объем, соответственно.
