Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Взаимодействия между биополимерами 35
Глава 1. Роль самоассоциации биополимеров в формировании структуры многокомпонентных водных растворов и коллоидных систем 36
1.1. Параметры, характеризующие самоассоциацию биополимеров в растворе 37
1.2. Определение параметров, характеризующих самоассоциацию биополимеров в растворе, методом лазерного светорассеяния 39
1.3. Взаимосвязь между самоассоциацией биополимеров и их структурообразующей способностью в растворах и коллоидных системах 44
1.3.1. Термодинамический анализ данных светорассеяния по влиянию ионов кальция на молекулярные и термодинамические параметры казеината натрия в водном растворе: взаимосвязь с флоккуляцией прямых эмульсий, типа масла в воде, стабилизированных белком 44
1.3.2. Самоассоциация наночастиц казеината натрия в растворе и в прямых эмульсиях: влияние температуры, рН и содержания ионов кальция 64
1.3.3. Термодинамический анализ факторов, контролирующих притяжение между каплями прямой эмульсии, покрытых белковыми адсорбционными слоями, в поле сил сдвига 76
1.3.4. Термодинамический анализ факторов, контролирующих самоассоциацию и функциональные свойства белков в присутствии низкомолекулярных Сахаров 88
Глава 2. Ключевые факторы, определяющие характер (природу и силу) взаимодействий между различающимися по природе биополимерами в водной среде 115
2.1. Количественная термодинамическая оценка характера (природы и силы) взаимодействий между различающимися по природе биополимерами по величине перекрёстного второго вириального коэффициента 115
2.2. Влияние молекулярной структуры биополимеров на характер их взаимодействия в водной среде 118
Глава 3. Роль характера парных взаимодействий между различающимися по природе биополимерами в формировании структуры многокомпонентных растворов и коллоидных систем 129
3.1. Вклад слабых и обратимых физических взаимодействий между биополимерами в структурообразование растворов и коллоидных систем 129
3.1.1. Смешанные водные растворы 129
3.1.2. Смешанные коллоидные системы 134
3.1.2.1. Влияние нейтрального полисахарида декстрана на эмульгирующую способность глобулярных белков: легумина и бычьего сывороточного альбумина 134
3.1.2.2. Влияние характера взаимодействий между декстраном илегумином на поверхностную активность легумина на плоской границе раздела фаз масло-вода 145
3.1.2.3. Влияние фазового состояния и состава смешанного раствора термодинамически несовместимых декстрана и легумина на изотерму адсорбции легумина на каплях эмульсии типа масла в воде 149
3.1.2.4. Влияние высокометоксилированного пектината на свойства эмульсий типа масла вводе, стабилизированных asi - казеином и /3-казеином 153
3.2. Вклад формирования ковалентных коньюгатов между биополимерами в
структурообразование коллоидных систем 171
Часть II. Взаимодействия биополимеров с низкомолекулярными амфифильными соединениями 198
Глава 1. Модификация структурообразующей функции биополимеров посредством взаимодействия с низкомолекулярными поверхностно активными соединениями (ПАВ) 198
1.1. Бинарные системы: биополимер - ПАВ 199
1.1.1. Бинарные системы: белок-ПАВ 199
1.1.1.1. Термодинамический анализ взаимосвязи между структурными особенностями белков и низкомолекулярных ПАВ и преимущественным характером их взаимодействия в водной среде (ниже ККМ) 203
1.1.1.2. Модификация молекулярных и термодинамическга параметров белков в результате их взаимодействия с индивидуальными молекулами ПАВ в водной среде (ниже ККМ) 214
1.1.1.3. Модификация поверхностной активности белков на границе раздела фаз воздух-вода в результате их взаимодействия с индивидуальными молекулами ПАВ в водной среде (ниже ККМ) 225
1.1.1.4. Особенности, как взаимодействий белок-ПАВ, так и модификации молекулярных и термодинамических параметров белков в комплексе с ПАВ в области концентрации ПАВ выше их ККМ 229
1.1.1.5. Модификация пенообразующей способности казеината натрия в результате его взаимодействия с мицеллами ПАВ в водной среде (выше ККМ) 245
1.1.2. Бинарные системы: полисахарид - ПАВ 256
1.1.2.1. Термодинамический анализ взаимосвязи между структурными особенностями нейтральных полисахаридов и низкомолекулярных ПАВ и преимущественным характером их взаимодействия в водной среде (ниже ККМ) 257
1.1.2.2. Модификация молекулярных и термодинамических параметров полисахаридов в результате га взаимодействия с индивидуальными молекулами ПАВ в водной среде (ниже ККМ) 261
1.1.2.3. Модификагщя поверхностной активности полисахаридов и ПАВ на границе раздела фаз воздух-вода в результате их взаимодействия в водной среде (ниже ККМ) 271
1.2. Тройные системы: белок - полисахарид - ПАВ 278
Глава 2. Взаимодействие биополимеров с ароматобразующими соединениями, как один из ключевых факторов в регулировании аромата биополимер - содержащих систем 296
2.1. Бинарные системы: биополимер - ароматобразующее соединение 297
2.1.1. Роль структуры белка в связывании ароматобразующих соединений..
2.1.2. Влияние связывания гексил ацетата с легумином на молекулярные и термодинамические свойства белка в водной среде
2.1.2.1. Влияние связывания НхАс с легумином на конформационную стабильность белка 312
2.1.2.2. Влияние связывания НхАс с легумином на молекулярные и термодинамические параметры белка в водной среде 318
2.1.3. Роль структуры ароматобразующих соединений в связывании с белком 324
2.1.3.1. Роль длины углеводородного радикала в связывании алкилацетатов с глобулярным белком - легумином 324
2.1.3.2. Особенности связывания с легумином метамерных сложных ароматобразующих эфиров, различающихся положением эфирной группы в углеводородной цепочке (С$) ихмолекул 329
2.1.3.3. Роль структуры ароматобразующих сложных эфиров в их конкурентном связывании с легумином из их смесей 330
2.2. Тройные системы: биополимері - биополимер2 - ароматобразующее соединение 355
2.2.1. Связывание НхАс с мальтодекстринами. Сравнение со связыванием НхАс с легум ином 356
2.2.2. Влияние мальтодекстринов на связывание НхАс с легумином в их эквимассовом растворе: мальтодекстрин +легумин + вода
2.2.2.1. Связывание НхАс с легумином в его эквимассовом смешанном растворе с мальтодекстрином SA-2 360
2.2.2.2. Связывание НхАс с легумином в его эквимассовом смешанном растворе с мальтодекстрином SA-б 362
2.2.3. Влияние образования ковалентных конъюгатов между легумином и мальтодекстринами на связывающую способность легумина по отношению к НхАс 364
2.2.3.1. Связывание НхАс с ковалентным конъюгатом легумина с мальтодекстрином SA-6 364
2.2.3.2. Связывание НхАс с ковалентным конъюгатом легумина с мальтодекстрином SA-2 368
Выводы 372
Список литературы
- Термодинамический анализ данных светорассеяния по влиянию ионов кальция на молекулярные и термодинамические параметры казеината натрия в водном растворе: взаимосвязь с флоккуляцией прямых эмульсий, типа масла в воде, стабилизированных белком
- Влияние молекулярной структуры биополимеров на характер их взаимодействия в водной среде
- Влияние характера взаимодействий между декстраном илегумином на поверхностную активность легумина на плоской границе раздела фаз масло-вода
- Модификация поверхностной активности белков на границе раздела фаз воздух-вода в результате их взаимодействия с индивидуальными молекулами ПАВ в водной среде (ниже ККМ)
Введение к работе
Актуальность проблемы и основные направления исследования
Наиболее широко представленными в природе биополимерами являются белки и полисахариды, которые, благодаря большому разнообразию их молекулярных структур и свойств, выполняют множество важных и хорошо известных биологических функций, как в организме человека и животных, так и в растениях При этом одной из ключевых функций белков и полисахаридов, вытекающих из их полимерной природы, является их структурообразующая функция В ее основе лежат ярко выраженные способности биополимеров к самоассоциации, конформационным изменениям, адсорбции на границах раздела фаз, а также к фазовому расслоению или, напротив, к комплексообразованию с отличающимися по своей молекулярной природе биополимерами и низкомолекулярными соединениями Так, например, благодаря этой функции, биополимеры участвуют в построении клеточных мембран и структур различных тканей и жидких сред в живых организмах и растениях, а также способны гибко регулировать ионный, глюкозныи или липидный обмен между клеткой и ее окружением
В настоящее время во всем мире отмечается растущий интерес к использованию структурообразующей функции биополимеров т vitro для создания продукции, обладающей усовершенствованной или уникальной структурой и свойствами, а также высокой физической стабильностью Этот интерес, с одной стороны, подготовлен накопленными глубокими знаниями о молекулярных свойствах индивидуальных биополимеров, способах их очистки и выделения из природного сырья, а также успехами в их широкомасштабном производстве и длительном хранении С другой стороны, он вызван возрастающей потребностью, в частности, пищевой, фармацевтической и косметической промышленности в разнообразных экологически чистых и высокофункциональных ингредиентах для разработки и выпуска, так называемой, «функциональной» продукции нового поколения, отличающейся ярко выраженным положительным воздействием на здоровье людей и, тем самым, на качество их жизни Положительными особенностями биополимеров, как потенциальных базовых ингредиентов для таких продуктов, наряду с их высокой полифункциональностью, являются также их биосовместимость и нетоксичность Кроме того, перспективность промышленного использования биополимеров, очевидно, определяется большим разнообразием их молекулярных структур и свойств, что открывает широкие возможности для молекулярного дизайна продукции нового поколения с уникальной структурой и свойствами
В дополнение к этому, можно сказать, что растущий интерес к функциональности биополимеров в настоящее время вызван также новыми экологическими требованиями сегодняшнего дня к химической индустрии в целом, а именно к разработке и выпуску биодеградируемых материалов
Однако, в то же время, как показала практика, для целенаправленного использования биополимеров в качестве функционально - активных ингредиентов, знание только их индивидуальных макромолекулярных свойств оказалось абсолютно недостаточным Как правило, если основываться только на этих знаниях, то результат введения биополимеров в реально важные многокомпонентные системы, содержащие смеси различных по природе биополимеров и низкомолекулярных веществ (солей, липидов, низкомолекулярных Сахаров, ароматообразующих соединений, и тд), может оказаться даже противоположным ожидаемому
Таким образом, к моменту начала нашей работы, было уже очевидно, что эффективное, целенаправленное и контролируемое использование биополимеров in vitro станет возможным только при ясном понимании роли межмолекулярных взаимодействий в их функциональности в многокомпонентных системах определенного состава
При этом среди наиболее распространенных и востребованных многокомпонентных систем, особое место занимают системы коллоидного типа на основе водных растворов биополимеров, т е такие, которые наряду с водной фазой (дисперсионной средой) содержат также тонко диспергированную масляную или воздушную фазу Особый интерес к таким коллоидным системам может объясняться тем, что, с одной стороны, они составляют основную массу разнообразной традиционной продукции пищевой, косметической и фармацевтической промышленности, а, с другой стороны, - являются наиболее перспективными с точки зрения инноваций, предоставляя большие возможности для разработки широкой гаммы продуктов нового поколения с легко варьируемым составом и структурой, что, в итоге, могло бы удовлетворить разнообразным и даже эксклюзивным запросам потребителей
Таким образом, основным направлением нашей работы было выяснение роли межмолекулярных взаимодействий в структурообразующих способностях биополимеров в многокомпонентных водных растворах и коллоидных системах При этом для достижения более глубокого понимания этой роли, мы проводили исследования в заданных экспериментальных условиях на модельных растворах и коллоидных системах, содержащих ограниченное число компонентов Кроме того, используя термодинамический подход, мы пытались подойти к пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования, стабилизации и разрушения структуры в таких системах, выявляя основные взаимосвязи в следующем ряду молекулярная структура ключевых компонентов - термодинамика межмолекулярных взаимодействий -функциональность ключевых компонентов - структура и стабильность модельных растворов и коллоидных систем
Цель и основные задачи работы:
Цель работы состояла в термодинамическом анализе роли межмолекулярных взаимодействий в процессах формирования структуры и свойств, в объеме и на границе раздела фаз, в многокомпонентных растворах и коллоидных системах,
содержащих в качестве основных компонентов такие биополимеры, как белки и полисахариды
Для достижения поставленной цели мы поставили перед собой следующие конкретные задачи
Установить основные взаимосвязи между надмолекулярной организацией белков и формированием структуры в водных растворах и коллоидных системах на их основе
Установить ключевые факторы, определяющие характер (природу и силу) взаимодействий, различающихся по природе, биополимеров в водной среде
Установить основные взаимосвязи между характером взаимодействий, различающихся по природе, биополимеров и их способностью к формированию структуры и свойств в водных растворах и коллоидных системах на их основе
Изучить роль взаимодействий биополимеров с низкомолекулярными поверхностно активными веществами (ПАВ) в модификации молекулярных параметров и структурообразующих функций биополимеров в объеме и на границе раздела фаз в водных растворах и коллоидных системах на их основе
Изучить закономерности взаимодействий биополимеров с ароматобразующими соединениями
Научная новизна работы:
1 В данной работе получил свое дальнейшее развитие
термодинамический подход к изучению природы и количественной
характеристике межмолекулярных взаимодействий в многокомпонентных
водных растворах и коллоидных системах на основе биополимеров
Используя термодинамический подход, нам, впервые, удалось установить прямые взаимосвязи между особенностями надмолекулярной организации белков в объеме водной среды, с одной стороны, и микроструктурой, реологическим поведением, и стабильностью водных растворов и прямых эмульсий, стабилизированных белками, с другой Кроме того, впервые, были обнаружены прямые корреляции между характером белок-белковых взаимодействий и силами, действующими между коллоидными частицами, покрытыми белковыми адсорбционными слоями
Впервые, с использованием лазерного светорассеяния, проведен количественный термодинамический анализ ключевых факторов, определяющих характер (природу и силу) взаимодействий между различными по природе биополимерами (белками и полисахаридами) в водной среде Кроме того, на основании сопоставления величин термодинамических параметров парных взаимодействий с особенностями фазовых диаграмм (положением критических точек и бинодалей), были также выявлены ключевые факторы, контролирующие особенности фазового поведения смешанных водных растворов биополимеров
В случае коллоидных систем, в частности, прямых эмульсий масла в воде, стабилизированных смесями биополимеров, впервые на количественном уровне, удалось установить, как определенный характер взаимодействий (физические взаимодействия, ковалентное связывание) между различающимися по природе биополимерами, а также фазовое состояние дисперсионной среды, определяют особенности структуры, реологического поведения и стабильности таких коллоидных систем
В результате проведенного систематического термодинамического исследования, нам впервые удалось раскрыть природу влияния низкомолекулярных Сахаров и, в частности, сахарозы на растворимость, поверхностную активность и гелеобразующую способность целого ряда различающихся по структуре белков, а также на особенности их фазового поведения в смешанных растворах с другими белками и полисахаридами
6 Также, впервые установлены молекулярные механизмы модификации
молекулярных параметров и структурной функциональности биополимеров
(белков и полисахаридов) посредством их взаимодействий с низкими
концентрациями ПАВ в водной среде Выявлена роль структуры, как
биополимеров, так и ПАВ в их взаимодействии и модификации свойств При
этом, впервые изучена природа влияния полисахаридов на изменение
поверхностных свойств комплексов белков с ПАВ
7 Впервые выявлена роль особенностей структуры ароматобразующих
соединений, определяющая специфику их конкурентного связывания с
глобулярным белком из эквимолярных смесей ароматобразующих соединений
Впервые показано влияние взаимодействий ароматобразующих соединений с белком на молекулярные и термодинамические параметры белка в водной среде
Также, впервые, охарактеризованы особенности влияния полисахаридов на способность белков связывать ароматобразующие соединения
Таким образом, в целом, вся совокупность полученной в работе термодинамической информации позволила достичь более глубокого понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования структуры и свойств многокомпонентных водных растворов и коллоидных систем на основе биополимеров
Практическая значимость работы. В первую очередь, в данной работе получил свое дальнейшее развитие термодинамический подход к изучению многокомпонентных водных растворов и коллоидных систем на основе биополимеров, позволяющий глубже понять молекулярные механизмы формирования их структуры и свойств, что, очевидно, вносит свой вклад в дальнейшее развитие методологии современных физико-химических, биохимических и биотехнологических исследований
Кроме того, проведенное систематическое термодинамическое исследование показало возможность направленного регулирования
структурообразующих свойств биополимеров в многокомпонентных растворах и коллоидных системах посредством относительно слабых физических взаимодействий, как с высокомолекулярными, так и с низкомолекулярными компонентами таких систем Такая возможность может служить хорошей основой для разработки и создания широкой гаммы природных эмульгаторов и стабилизаторов нового поколения, а также систем доставки, с легко варьируемым составом и структурой, для пищевой, фармацевтической и косметической промышленности При этом, полученные знания могут также позволить оптимизировать композицию ингредиентов для таких систем, как по положительному влиянию на здоровье человека, так и по структурообразующим свойствам, что, без сомнения, может улучшить качество конечного продукта, как по его оздоровительному эффекту, так и по его общей привлекательности (текстуре, физической стабильности и аромату) для потребителя Таким образом, используя полученные знания, можно не только значительно расширить ассортимент, так называемой функциональной (имеющей положительное влияние на здоровье людей) продукции пищевой, косметической и фармацевтической промышленности, но и осуществить разработку ее принципиально новых видов
Апробация работы. Материалы работы были доложены и обсуждены на следующих конференциях "Biopolymer mixtures (Nottingham, UK, 1994), "Macromolecular Interactions in Food Technology" at International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (Honolulu, Hawaii, USA, 1995), "Food Colloids Proteins, Lipids and Polysaccharides (Ystad, Sweden, 1996), "Food Emulsions and Foams Interfaces Interactions and Stability" (Seville, Spam, 1998), " III международная конференция Пища Экология Человек" (Москва, 1999), " Flavor Release, ACS Symposmm"(New Orleans, USA ,1999), "Химия и биотехнология пищевых веществ" (Москва, 1999), "Food Colloids 2000 Fundamentals of Formulation " (Potsdam, Germany, 2000), «Биохимическая физика на рубеже столетий» (Москва, 2000), «Химия и биотехнология пищевых веществ Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов» (Москва, 2000), "От фундаментальной науки к новым технологиям Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок Экологически безопасные технологии" (Москва - Тверь, 2001), Food Colloids 2002, Biopolymers and Materials" (Waagemngen, Netherlands, 2002), «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва 2002), XI Международная конференция по Крахмалу (Москва 2003), «Colloid Chemistry and Physicochemical Mechanics (Минск, Беларусь, 2003), " Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса" (Москва, 2003), "Food Colloids 2004 Interactions, Microstructure and Processing" (Harrogate, UK, 2004), "The 7th International Hydrocolloids Conference" " (Melbourne, Australia, 2004), "Delivery of Functionality in Complex Food Systems" (Lausanne, Switzerland, 2005), "Food Colloids 2006 Self-Assembly and Material Science" (Montreux, Switzerland, 2006)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 113 работ, из них 56 статей в рецензируемых научных журналах, а также в сборниках докладов международных научных конференций, 4 депонированных рукописи, 5 статей в сборниках научных трудов различных научно-исследовательских учреждений и университетов, тезисы 18 устных и 30 стендовых докладов на указанных выше научных конференциях и симпозиумах
Личный вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, заключался в выборе актуальных целей исследований, в постановке конкретных задач исследований, в разработке путей их экспериментального выполнения, а также в непосредственном участии на всех этапах исследований, интерпретации и теоретической обработки полученных результатов
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 419 страницах машинописного текста, содержит 121 рисунок, 38 таблиц и список литературы, включающий 383 ссылки Работа состоит из 2 частей и 5 глав
Термодинамический анализ данных светорассеяния по влиянию ионов кальция на молекулярные и термодинамические параметры казеината натрия в водном растворе: взаимосвязь с флоккуляцией прямых эмульсий, типа масла в воде, стабилизированных белком
Калориметрические измерения проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Пущино, Россия) в диапазоне температур от 20 до 110 С, при скорости сканирования 2 С мин"1 и избыточном давлении 2.5 атм. Концентрация белка в измерительной ячейке составляла 0.005 г/мл. Точность измерений составляла 10% от значений теплоёмкости. Чувствительность калориметрических измерений составляла 5 х 10"6 Дж/сек. Термодинамические параметры термоденатурации белка рассчитывали из полученных термограмм, как это было предложено в работе [8]. Значения термодинамических параметров термоденатурации белка, приведённые в тексте представляют собой усреднённые данные, как минимум двух повторений каждого измерения.
Оценка молекулярных и термодинамических параметров биополимеров в объёме водной среды методом многоуглового лазерного светорассеяния.
Средневесовую молярную массу, Mw, радиус инерции, RG, и второй вириальный коэффициент, А2, биополимеров и их комплексов определяли методом многоуглового статического светорассеяния в разбавленных растворах. Серию растворов (как правило, 7-8 концентраций) с различной концентрацией готовили, разбавляя растворы биополимеров чистым буфером.
Необходимо отметить, что в случае комплексов биополимеров с ПАВ или ароматобразующими соединениями такое разбавление поддерживает постоянным молярное отношение между составляющими компонентами комплексов, что, как известно, является одним из важнейших факторов, оказывающих влияние на равновесие реакции комплексообразования.
Отношение Рэлея RQ было измерено, используя вертикально-поляризованный свет (633 нм) в диапазоне углов 40 6 140 (13 углов), на приборе VA Instruments Co Ltd LS-01 аппарате с He-Ne лазером (633 нм, мощность лазера составляла 15 мватт) (Россия) откалиброванного по обеспыленному бензолу (i?90 = 11-84 х 10 6 см-!). Растворы обеспыливали фильтрованием через мембранные фильтры (Millipore), с подобранным для каждого изучаемого полимерного образца размером пор (от 0.22 до 0.8 мкм), прямо в измерительную кювету. Подбор размера пор фильтра проводили, определяя концентрацию изучаемого полимерного образца до и после фильтрования. Экспериментально измеренные значения М9 были использованы для расчёта и построения угловых и концентрационных зависимостей HC/ARQ, как правило, по методу Зимма [9] или методу Берри [10]. Здесь, С- концентрация полимера (г/мл), Д#9 - избыточное светорассеяние раствора полимера по отношению к светорассеянию растворителем под углом 9, Н - оптическая константа системы, равная 4л п v /NAX , где NA - число Авогадро, Я - длина волны падающего света в вакууме , п - показатель преломления растворителя, и v = dn/dc инкремент показателя преломления полимера. Значение средневесовой молярной массы, Мт оценивалось из средней величины интерсептов концентрационной HC/ARQ при 9 - 0 (экстраполяция проводилась по 13 углам) и угловой ЯС/А/?е при С - 0 (экстраполяция проводилась по 7-8 концентрациям) зависимостей. Значения второго вириального коэффициента, Аг, рассчитывали из тангенса угла наклона концентрационной зависимости ЯС/А/?е при 9 -» 0. Значение радиуса инерции, RG, находили из тангенса угла наклона угловой зависимости HC/ARd при С - 0.
Уровень полидисперсности исследуемых полимерных образцов оценивали по графику Холтцера, проводя построение величины q(ARQ/HQc=o от величины q RQ z 2 (где, RG - радиус инерции и q = (AnlX) sin (0/2) - волновой вектор) [11]. При этом полученные данные свидетельствовали, что полидисперсность всех изученных биополимеров не превышала 2.
Значения Mw, Аг и RG , представленные в данной работе представляют собой усреднённые данные, как минимум двух повторений каждого измерения. Экспериментальная ошибка в определении Mw и А2, как правило, не превышала 10%. Ошибка в определении RG составляла 5%.
Значения инкрементов показателей преломления, v, оценивали при 436 или 635 нм, при необходимой температуре, используя дифференциальный рефрактометр Shimadzu (Japan). Экспериментальная ошибка в определении v не превышала 10%. Конкретные значения v биополимеров в различных экспериментальных условиях представлены в соответствующих статьях, описывающих данные статического светорассеяния, ссылки на которые приведены в тексте данной диссертационной работы.
Значения гидродинамического радиуса, і?ь биополимеров и их комплексов определяли методом динамического светорассеяния [10, 12]. Временная корреляционная функция интенсивности светорассеяния была измерена при 90, при помощи прибора лазерного светорассеяния VA Instruments Со Ltd LS-01 (Санкт Петербург, Россия) (вертикально-поляризованный свет с длиной волны Х= 633 нм). Значения гидродинамического радиуса, i?h, представленные в этой работе являются результатом усреднения, как минимум, десяти повторных измерений временной корреляционной функции интенсивности светорассеяния для каждого эксперимента. Ошибка в определении і?ь не превышала 10 %. Для определения i?h из временной корреляционной функции интенсивности светорассеяния использовали специальную компьютерную программу (DYNALS Release 1.5, все права принадлежат А. Голдингу и Н. Сидоренко, VA Instruments Со Ltd (Санкт Петербург, Россия)). Измерения характеристической вязкости.
Измерение характеристической вязкости, [г], изучаемых биополимеров и их комплексов проводили в их разбавленных водных растворах при 20 ±0.1 С, используя капиллярный вискозиметр Убеллоде (как правило, с диаметром капилляра да 0.4 мм). Серию растворов с различной концентрацией (5-6 концентраций) готовили, разбавляя растворы биополимеров чистым буфером. Значения характеристической вязкости, [г], были рассчитаны из интерсепта концентрационной зависимости приведённой вязкости г)уд/с при с -» 0, по уравнению Хагтинса [13-15]:
Влияние молекулярной структуры биополимеров на характер их взаимодействия в водной среде
Во-первых, из представленных данных следует, что молекулярные параметры наночастиц казеината натрия в отсутствии ионов кальция находятся в хорошем согласии с раннее полученными данными для образцов казеината натрия, подготовленных для измерений без использования ультрацентрифугирования [69].
Немного большие величины молекулярных параметров, найденные в нашей работе, по сравнению с ранее определёнными, также методом светорассеяния, могут быть объяснены использованием в нашем исследовании мембранных фильтров с большим размером пор (0.65 мкм по сравнению с 0.22 мкм). Что позволило нам изучить образцы белка без их значительного фракционирования в процессе обеспыливания через мембранные фильтры. (Целостность образцов белка контролировалась - определением концентрации белка в растворах до и после их фильтрования через мембранные фильтры). Рис. 1 также свидетельствует, что во всём изученном диапазоне концентраций ионов кальция их добавление к раствору белка сопровождается ассоциацией наночастиц казеината натрия, которое выражается в увеличении их средневесовой молярной массы, Mw (Рис. 1а). При этом наиболее значительная ассоциации белка наблюдалась при концентрациях ионов Са2+ от 8 до 14 мМ. Этот результат может быть обусловлен образованием ионных сшивок между исходными наночастицами белка, за счёт сильного связывания ионов Са с фосфосериновыми аминокислотными остатками asr и р -казеинов [70], представляющих собой основные мономерные составляющие ( 36%) наночастиц казеината натрия. При этом ассоциация белка, в целом, сопровождалась возрастанием величины второго вириального коэффициента, А2, (Рис. 16).
Также из Рис. 1 следует, что минимальная степень ассоциации белка была найдена при 6 мМ ионов Са2+, что также отражается в минимальных значениях размеров белковых наночастиц (Рис. 1в). Т.е., как будто бы при этой концентрации связывание ионов Са2+ происходит, главным образом, в интерьере наночастиц белка, а не между ними. Основываясь на литературных данных о структуре нативных частиц казеина [46,71], такое их поведение может быть обусловлено существованием на их поверхности слоя, состоящего из молекул к-казеина, которые - нечувствительны к ионам Са2+ , и в тоже время тем, что asj- и р - казенны расположены преимущественно в интерьере нативных наночастиц казеина. Кроме того, кажется, что такое связывание ионов Са2+, вызывает также сжатие исходных наночастиц белка, объединяющихся в агрегаты, что выражается в их меньших размерах. Кроме того, ожидается, что нейтрализация отрицательного заряда в интерьере наночастиц белка за счёт связывания ионов Са2+, может также вносить значительный вклад в это сжатие, за счёт уменьшения сил электростатического отталкивания, действующих между одноимёнными зарядами в интерьере белковых наночастиц. По-видимому, наиболее ярко эти процессы проявляются
Влияние ионов Са на молекулярные и термодинамические свойства наночастиц казеината натрия (рН 7.0, ионная сила 0.05М): (а) средневесовую молярную массу Mw (); (б) второй вириальный коэффициент А2 (); (в) радиус инерции RG{к) и гидродинамический радиус i?/,(V); (г) параметр проницаемости y = Rh/RG в минимальных значениях, как RG, так и Rh, найденных при 8 мМ ионов Са , несмотря на достаточно высокую степень ассоциации белка, найденную при этой концентрации ионов Са2+. По всей вероятности, такое предпочтительное связывание ионов Са в интерьере белковых агрегатов, лежит также в основе влияния ионов кальция на молекулярные параметры наночастиц казеината натрия при более высоких концентрациях ионов Са2+ (10-14 мМ) в растворе.
Данное предположение о сжатии наночастиц казеината натрия при связывании ионов Са2+ хорошо согласуется со значениями параметра проницаемости у = Rf/Ra оцененного из комбинации данных статического и динамического светорассеяния и характеризующего степень проницаемости пространства, занятого наночастицами белка в растворе. Полученные данные указывают на высокую плотность и следовательно, низкий уровень проницаемости наночастиц казеината натрия (0.75 у 1.0) при концентрации ионов Са2+, равной 4 - 10 мМ (Рис. 1г). Что подобно уровню проницаемости для гибкоцепных полимеров [13].
В тоже время изменение знака второго вириального коэффициента от отрицательного к положительному при добавлении ионов Са2+ (Рис. 16) предполагает образование наночастиц белка с более высоким термодинамическим сродством к растворителю, т.е. более высокой относительной поверхностной гидрофильностью. Так, как будто бы, относительная гидрофобность исходных наночастиц казеината натрия уменьшается благодаря, объединению гидрофобных участков наночастиц казеината натрия в интерьере белковых ассоциатов и их изолирования от растворителя в результате сшивки исходных наночастиц белка в процессе связывания ионов кальция.
Для того чтобы оценить вклад суммарного заряда образующихся в присутствии кальция ассоциатов белка в их термодинамическое сродство к растворителю, было проведено измерение суммарного заряда на наночастицах белка методом измерения на них -потенциала (Рис. 2).
Влияние характера взаимодействий между декстраном илегумином на поверхностную активность легумина на плоской границе раздела фаз масло-вода
Такое изменение термодинамического сродства наночастиц казеината натрия к растворителю при рН 7.0 и 5.1 может быть обусловлено экспонированием в водную среду гидрофобных участков молекул казеинов, составляющих наночастицы казеината натрия и до этого спрятанных в их интерьере, в результате их диссоциации под влиянием сахарозы. Что, в свою очередь, сопровождается усилением гидрофобного притяжения между наночастицами белка в водной среде. При этом если в случае рН 7.0 это усиление гидрофобного притяжения было вызвано, главным образом, диссоциацией исходных наночастиц белка под воздействием молекул сахарозы (Рис. 22 и 23), то при рН 5.1 оно, кроме того, может быть связано с падением суммарного заряда на белке при его приближении к области ИЭТ.
В отличие от этого, ярко выраженное возрастание термодинамического сродства наночастиц казеината натрия к растворителю в присутствии сахарозы (противоположная зависимость АБ.Б от концентрации сахарозы), зафиксированное при рН 6.0 и 5.5, может быть, наиболее вероятно, обусловлено возрастанием гидрофильности поверхности наночастиц белка. Увеличение гидрофильности белка в присутствии сахарозы наиболее ярко проявляется в более высоких, чем у исходного белка положительных значениях АБ-Б при рН 5.5 практически во всём изученном концентрационном диапазоне добавленной сахарозы, а именно, от 10 до 60 вес/объём%, несмотря на ожидаемый достаточно низкий суммарный заряд белка при этом рН.
В то же время, при содержании сахарозы 60 вес/объём %, термодинамическое сродство наночастиц белка к водной среде значительно падает в области рН ИЭТ. Этот результат, по всей вероятности, указывает на существование сильной конкуренции за молекулы воды между наночастицами белка и большим числом молекул сахарозы, которое приводит к уменьшению уровня гидратации белка, а, следовательно, к возрастанию его поверхностной гидрофобности.
В области же рН ИЭТ найденное ярко выраженное возрастание термодинамического сродства наночастиц белка к водной среде в присутствии сахарозы при рН 3.9, которое находит своё отражение в зависимости АБ-Б ОТ концентрации сахарозы (Рис. 26в), можно объяснить следующими двумя причинами. Во-первых, большим вкладом в величину АБ.Б исключённого объёма, наибольших из обнаруженных в данном исследовании, агрегатов белка (Рис. 23), и, во-вторых, расположение гидрофобных участков наночастиц казеината в интерьере образующихся агрегатов белка.
В то же время, в этой же области рН (рН ИЭТ) было найдено противоположное влияние сахарозы на термодинамическое сродство наночастиц белка к водной среде при рН 3.5, т.е. в условиях большей степени протонирования белка и меньшей степени его ассоциации, чем при рН 3.9 (Рис. 22 и 23). При этом очевидно, что конкуренция между белком и сахарозой за молекулы воды оказывает большое влияние на термодинамическое сродство наночастиц белка к водной среде при увеличении концентрации сахарозы в системе. Это проявляется, либо как возрастание поверхностной гидрофобности белковых наночастиц при рН 3.5, либо как увеличение степени ассоциации белка при рН 3.9.
Формирование сетки геля наночастицами казеината натрия.
При понижении рН от нейтральных значений до ИЭТ белка карбоксильные группы казеината натрия протонируются, суммарный отрицательный заряд белка падает и происходит нейтрализация наночастиц белка. При этом, силы преимущественного электростатического отталкивания между одноимённо заряженными наночастицами белка в водной среде сменяются силами притяжения: гидрофобной природы, электростатической между противоположными по знаку заряженными группами белка, а также Ван дер Ваальсовыми. При этом в условиях ослабления электростатического отталкивания между наночастицами белка, можно также ожидать облегчения формирования множественных водородных связей между ними. Выше определённой концентрации белка в растворе эти силы притяжения приводят к формированию трёхмерной сетки геля в объёме раствора.
На Рис. 27а показано значительное возрастание модуля эластичности G геля казеината натрия при увеличении концентрации сахарозы в системе в области значений рН от 5.5 до 3.9. При этом влияние сахарозы на упрочнение структуры геля наиболее отчётливо проявляется при рН 5.5, т.е. в условиях, когда сам казеинат натрия не способен образовывать гель.
С другой стороны, возрастание фазового угла, 8, гелей казеината натрия при увеличивающейся концентрации сахарозы (Рис. 276) свидетельствует о том, что в присутствии сахарозы эти гели становятся менее эластичными по свойствам. Большие значения фазового угла указывают на рассеивание большей части энергии сдвига в образце. Это можно понять, как то, что составляющие сетку геля агрегированные наночастицы белка легко проскальзывают друг относительно друга под действием сил сдвига в результате деформации и разрыва слабых физических связей между ними, которые имеют более мобильный характер в присутствии сахарозы.
На основании проведённого анализа данных светорассеяния в разбавленных растворах белка, такое влияние сахарозы на реологическое поведение белка может быть обусловлено значительным возрастанием численной плотности взаимодействующих наночастиц белка п (п = С/Мт где С - концентрация белка, Mw -средневесовая молярная масса) в объёме раствора в результате его диссоциации под воздействием сахарозы. Такое увеличение численной плотности наночастиц белка обеспечивает значительное возрастание числа сшивок в микроструктуре белкового геля при снижении рН.
Модификация поверхностной активности белков на границе раздела фаз воздух-вода в результате их взаимодействия с индивидуальными молекулами ПАВ в водной среде (ниже ККМ)
С другой стороны, присутствие более низкомолекулярного декстрана Т40 приводит к улучшению эмульгирующей способности белка во всём изученном диапазоне концентраций белка вплоть до R = 5.
Однако, в обоих случаях, уменьшение значения d43 в присутствии полисахаридов относительно значения d43, характерного для белка, оказывается менее выраженным для эмульсий стабилизированных БСА, по сравнению с эмульсиями, стабилизированными легумином, даже при оптимальных значениях R (сравни Рис. 34 и 35). Отсутствие термодинамической несовместимости между БСА и декстраном может быть одним из объяснений относительно менее выраженного влияния декстрана на эмульгирующую способность белка.
Дальнейшие различия между БСА и легумином отмечаются при рассмотрении стабильности эмульсий во времени в присутствии и отсутствии полисахаридов. В качестве примера, здесь представлены данные по изменению во времени толщины сывороточного слоя и среднего диаметра капель в эмульсиях, содержащих БСА + декстран Т40 при молярном отношении R = 3.
Так было обнаружено, что хотя капли в свежеприготовленной эмульсии были немного меньше в присутствии полисахарида, чем в случае одного белка, однако, они были менее стабильны по отношению к коалесценции и кримингу. При этом природа этой нестабильности вряд ли была обусловлена вытеснительной флоккуляцией в эмульсии, поскольку, как было показано выше, относительно низкомолекулярный декстран Т40 не вызывает вытеснительную флоккуляцию в эмульсиях стабилизированных легумином, т.е. даже при более высокой концентрации (R = 5) и в условиях термодинамически более благоприятных для фазового расслоения декстрана с белком.
Эксперименты по оценке величины адсорбции БСА на поверхности капель в эмульсии показали, что Г = 1.5 ± 0.1 мг/м2. В эмульсиях, приготовленных на основе смеси БСА + декстран Т500 (R = 3) эта величина возрастала до 2.1 мг/м, и, при этом, было также найдено небольшое концентрирование декстрана Т500 в поверхностном слое на каплях эмульсии (Г = 0.06 ± 0.02 мг/м ). В свою очередь, в эмульсиях, содержащих БСА + декстран Т40 (R = 3) величина адсорбции была равна величине, характерной для чистого белка, а именно Г = 1.6 ± 0.1 мг/м2. Таким образом, в пределах экспериментальной ошибки опыта, декстран Т40 не адсорбировался на каплях свежеприготовленной эмульсии, но после 24 часов хранения эмульсии некоторое количество декстрана Т40 было уже обнаружено в поверхностном слое белка (Г = 0.02 ± 0.01 мг/м2), при этом, интересно отметить, что количество белка также увеличивалось и достигало значения 2.4 мг/м2. Таким образом, эти данные по адсорбции указывают на существование слабой ассоциации между декстраном и адсорбированным БСА, что отличается от эмульсий, содержащих легумин. При этом некоторая адсорбция декстрана Т500 наблюдается уже в свежеприготовленной эмульсии, тогда как для декстрана Т40 она становится очевидной только при хранении эмульсий. Величина адсорбции декстрана, конечно, очень мала и лишь немного превышает ошибку метода, но она, при этом, хорошо согласуется с предполагаемым термодинамическим сродством БСА и декстрана (А2з 0), как в объёме раствора, так и на границе раздела фаз. Большая степень адсорбции полимера, обладающего большей молярной массой (декстран Т500), ожидается по термодинамическим причинам.
Приведённые выше данные по адсорбции декстрана на поверхности капель эмульсии, стабилизированных БСА, позволяют нам предположить, что найденное ухудшение стабильности эмульсий обусловлено процессами мостичной флоккуляции, происходящими в эмульсиях. Действительно, мостичная флоккуляция, вызванная присутствием декстранов Т40 и Т500, отмечалась также для частиц полистирольного латекса при ионной силе 0.1М [192], кроме того, также отмечалась адсорбция декстрана на частицах полистирольного латекса, покрытого адсорбционными слоями БСА [185]. Таким образом, такое же поведение декстрана на каплях эмульсии вполне вероятно.
В смешанных биополимерных системах, где один компонент (белок) -очень поверхностно активен, а другой (полисахарид) - не активен, ключевым параметром, указывающим на возможную мостичную флоккуляцию, является перекрёстный второй вириальный коэффициент А2з- Любое слабое термодинамическое сродство между двумя биополимерами (А2з 0) будет способствовать формированию полисахаридных мостиков между каплями эмульсий, покрытых адсорбционными слоями белков. Что в свою очередь будет усиливать криминг в разбавленных эмульсиях, а также, возможно, коалесценцию капель эмульсий в образовавшихся в результате криминга плотных слоях эмульсий. В системах же, где А2з 0 (т.е. легумин- декстран), флоккуляция капель имеет не мостичную природу, а вытеснительную.
