Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Направленный синтез и физико-химические исследования сорбционных материалов с заданным составом и строением 7
1.1. Строение и физико-химические свойства кремнеземов, методы химического модифицирования их поверхности 7
1.2. Строение и свойства углеродных сорбционных материалов 26
1.3. Современная нанотехнология и химия надмолекулярных веществ 33
1.4. Применение биосовместимых сорбентов 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 48
2.1. Материалы для синтеза композиционных кремнеземных сорбентов и гемосорбентов 48
2.2. Химический анализ элементоксидных слоев сорбентов 50
2.3. Физико-химические методы исследования 54
2.4. Биохимические методы исследования 55
2.5. Статистическая обработка результатов исследований 58
Глава 3. Синтез композиционных органокремнезеных сорбентов и исследование их свойств 59
3.1. Получение композиционных органокремнеземных сорбентов и исследование их физико-химических свойств 59
3.2. Получение элементсодержащих сорбентов методом молекулярного наслаивания
3.3. Иммобилизация лизоцима и свойства полученных препаратов 78
Разработка модифицированных углеродных сорбентов 88
Синтез модифицированных образцов углеродных сорбентов методами окисления и аминированйя 88
Исследование кислотно-основных свойств углеродных сорбентов 95
Моделирование ферментативной активности гемосорбентов . 102
Испытания гемосорбентов медицинского назначения 104
Выводы
Библиографический список 127
Приложение
- Строение и физико-химические свойства кремнеземов, методы химического модифицирования их поверхности
- Современная нанотехнология и химия надмолекулярных веществ
- Химический анализ элементоксидных слоев сорбентов
- Синтез модифицированных образцов углеродных сорбентов методами окисления и аминированйя
Введение к работе
Актуальность темы. Надмолекулярные многокомпонентные наноструктуры - композиционные сорбционные материалы вызывают в настоящее время растущий интерес в различных областях физической химии. Получаемые по нанотехнологиям сорбенты, синтетические полиэлектролйты, иммобилизованные биосенсоры, применяются в качестве катализаторов, твердофазных аналитических систем для сорбционно-спектроскопического экспресс-определения объектов окружающей среды, в качестве высокоселективных материалов для очистки биологически активных веществ в медицине.
Весьма перспективным является получение сорбентов с заданным составом и строением для последующего применения в очистке биологических жидкостей, а также в виде аппликационных сорбционных материалов с регулируемыми адсорбционными, противомикробными, пролонгированными свойствами.
В соответствии с этим, актуальным представляется проведение системных исследований по синтезу композиционных органокремнеземных материалов и модифицированных сорбентов на основе активированных углей сферической грануляции с изучением их физико-химических свойств, направленности биохимического действия.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является системное решение научных проблем синтеза сорбентов методами направленного и регулируемого модифицирования функциональных групп, исследование их физико-химических свойств и использование результатов в практике.
При выполнении работы предстояло решить следующие задачи: синтезировать композиционные органокремнеземные сорбенты и исследовать их состав, структурные характеристики, провести анализ ИК -спектров, спектров диффузного отражения, микроструктуры поверхности; методом молекулярного наслаивания получить элементсодержащие сорбенты с заданным составом;' исследовать кинетику ферментативной реакции иммобилизации на поверхности композиционных сорбентов лизоцима и определить термодинамические характеристики термоинактиваций энзима; провести модифицирование' поверхности углеродных сорбентов методом жидкофазного окисления и аминирования, исследовать их физико-химические свойства; исследовать кислотно-основные свойства активированных углей и осуществить моделирование ферментативного катализа; провести испытания углеродных гемосорбентов медицинского назначения для коррекции метаболических сдвигов в консервированной крови.
Научная новизна работы. Впервые проведены исследования по разработке композиционных сорбентов методом формирования пористой структуры кремнеземной матрицы в присутствии хитозана и сульфохитозана, имеющих высокую адсорбционную активность, характеризующихся стандартностью состава и структурных характеристик.
Установлено закономерное увеличение поглощения при 280 - 540 нм в спектрах диффузного отражения сорбентов с увеличением количества хитозана и сульфохитозана. Полученные данные использованы для оптимизации условий синтеза сорбентов, их идентификации.
Иммобилизацией на поверхности композиционных сорбентов лизоцима получены аппликационные материалы для медицинских целей. С использованием уравнения Михаэлиса - Ментен определены кинетические параметры ферментативной реакции. Установлена термодинамическая стабильность иммобилизованного лизоцима.
Проведено модифицирование поверхности углеродных сорбентов методами жидкофазного окисления и аминирования, позволяющее получить сорбционные материалы с катионообменными и анионообменными свойствами. Установлено, что при жидкофазном окислении поверхности углей наблюдается резкое увеличение значения статической обменной емкости, которое достигает 0,8-1,0 мг-экв/г; идентифицированы на поверхности углей про- тонодонорные бренстедовские кислотные центры с концентрацией 0Д9мг-экв/м2.
Практическая значимость. Осуществлена полупромышленная наработка композиционных хитозанкремнеземных сорбентов и окисленных углей сферической грануляции СКН. - ЇМ в ЗАО НПФ «Люминофор», что подтверждено соответствующим актом.
Окисленные формы углеродных гемосорбентов СКН - 1М и «Симплекс» апробированы с положительным результатом в отделении гравитационной хирургии крови Ставропольской краевой клинической больницы и рекомендованы для очистки консервированной крови длительных сроков хранения.
Апробация работы. Результаты работы были представлены: на Всероссийской научной конференции «Современные достижения биотехнологии - вклад в науку и практику XXI века» (Ставрополь, 1999); на 44 научно-методической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 1999); на.III Международной конференции «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии» (С.-Петербург, 2001); на Всероссийской научно-практической конференции «Химия твердого тела и современные микро- и нанотехнологии» (Кисловодск, 2001); на научной конференции, посвященной 70-летию биолого-химического факультета СГУ (Ставрополь, 2001).
Публикации. Результаты исследований опубликованы в 10-ти работах.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и 3 глав, выводов, библиографического списка, приложения. Работа изложена на 132 страницах, содержит 16 рисунков и 18 таблиц. Библиографический список состоит из. 158 наименований.
Строение и физико-химические свойства кремнеземов, методы химического модифицирования их поверхности
В настоящее время одним из перспективных направлений прикладной физической химии является разработка и иссдедование композиционных сорбционных материалов. Для направленного синтеза органокремнеземных сорбентов применяют современные нанотехнологии, которые позволяют получать эффективные энтеро- и- гемосорбенты, носители для иммобилизации биологически активных веществ медицинского назначения.
Медицинские аспекты применения кремнеземов в качестве сорбентов с широким спектром действия и носителей для биопрепаратов и лекарственных веществ выдвигают задачи по дальнейшему изучению химии поверхности кремнеземов с целью выявления наиболее существенных факторов, определяющих особенности иммобилизации биологических объектов на поверхности и влияющих на их активность, и поиска путей целенаправленного модифицирования полезных функций кремнезема. Для понимания характера взаимодействия поверхности адсорбентов с биологически активными веществами, вакцинами, антителами, антигенами, лекарственными препаратами, функциональными элементами крови, продуктами метаболизма, микроорганизмами необходима достоверная информация о строении поверхностного слоя кремнезема, его гидроксильных групп и гидратного покрова, природе активных центров поверхности, механизмах адсорбционных и хемосорбци-онных процессов, эффектах структурной перестройки поверхности при внешних воздействиях.
Для иммобилизации биологически активных веществ широко применяются неорганические сорбенты, в частности, кремнеземы, которые по сравнению с органическими носителями имеют известные преимущества (В.Б. Алесковский, 1976, 1978; Г.Д. Лисичкин, 1989; Ф.Ходж, 1989). Силикагель, аэросил, пористые стекла и силрхромы относятся к сорбентам на основе кремнеземов.
Силикагель - продукт поликонденсацйи ортокремниевой кислоты, которая образуется из силиката натрия при его обработке водными растворами кислот (СИ. Кольцов, В.Б. Алесковский, 1953). Силикагель также получают в процессе гидролиза эфиров кремниевой кислоты (В.Г. Березин и др., 1975). Для увеличения пор в структуре силикагеля, его подвергают гидротермальной обработке в автоклаве при различных температурах и давлении водяного пара. Удельная поверхность и размеры частиц получаемых силйкагелей зависят от рН, температуры, концентрации реагентов, режимов сушки и условий термической обработки. Силикагель имеет глобулярную структуру (А.Г. Карнаухов, 1971), т.е. представляет собой комплекс сферических частиц, от размера и плотности упаковки которых зависит величина его удельной поверхности, объем пор и их размеры.
Непористый кремнезем аэросил получают в результате высокотемпературного парофазного гидролиза четыреххлористого кремния в токе кислорода, с последующей конденсацией в парах воды (К. Оккерс, 1973). Методом ядерного магнитного резонанса показано, что объемная фаза аэросила представлена в равной степени структурными мотивами кварца и кристобалита (Г.Д. Лисичкин, 1989).
Наибольшей химической однородностью по сравнению с силикагелем, аэросиламй обладают аэросйлогели, получаемые спеканием частиц непористого высокодисперсного диоксида кремния - аэросила (А.В. Киселев и др., 1969; А.В. Киселев, В.И. Лыгин, 1972). Данные сорбенты имеют достаточно крупные поры, проводя их термообработку, добиваются получения сорбентов с узким распределением пор по размерам.
В работе В.А. Соболева и др. (1974) представлены данные исследований непористого кремнезема - полисорба, глобулы которого представляют собой мелкие сферические частицы. Анализ результатов изучения строения полисорба с использованием метода импульсной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения в твердой фазе на ядрах кремния-29 позволяет заключить, что объемная структура глобул представлена примерно в равной степени мотивами кварца и кристобалита (Э.Т. Липпмаа и др., 1981). По данным совмещенного ИК-спектроскопическОго и гравиметрического анализа (В.А. Соболев и др., 1974; В.А. Тертых и др., 1971) сделан вывод о преобладаний на поверхности изолированных гидроксилов, расположенных сравнительно равномерно на расстоянии 0,6-0,7 им. Топография поверхностного слоя полисорба определяется фрагментами, содержащими типичные для грани (111) [3-кристобалита гексагональные циклы, и в заметно меньшей степени фрагментами, аналогичными грани (100), с концевыми геминальными гидроксилами (В.В.Брейидр., 1982).
Состояние гидроксильного покрова S1O2 и структуры его поверхностного слоя существенным образом влияют на особенности протекания сорб-ционных процессов. Различный характер электронного распределения на гидроксилированных фрагментах поверхности кремнеземов определяет отличия адсорбции на них биологически активных макромолекул (В.В. Брей и др., 1986).
Не менее важную роль в поверхностных процессах играет гидратная оболочка кремнезема. Содержанием на поверхности адсорбированной воды определяется полнота проведения реакций химического модифицирования и структура модифицирующего покрытия.
Согласно исследованиям А.А. Чуйко (1993) общие закономерности протекания физико-химических процессов на поверхности кремнеземов определяются особенностями электронной структуры твердых веществ, изучаемые методами квантовой химии. С помощью квантово-химических подходов решены такие вопросы как природа первичных центров адсорбции полярных молекул и стереохимия адсорбционных комплексов. Для изучения поверхностных явлений использован кластерный подход, в рамках которого решетка твердого тела моделируется его небольшим фрагментом - кластером. Фрагменты поверхности пирогенного кремнезема представлены кластерами с изолированными силанольной и силандиольной группами и гексагональной циклической ячейкой (гексагоном), типичной для грани (111) 3—кри-стобалита.
Для выявления возможных центров активации и анализа их относительной роли в адсорбционных процессах использованы данные о зарядах на атомах поверхностных функциональных групп и структурных элементов кремнекислородного каркаса SiCV Показано (Ю.И. Горлов и др., 1986), что значительные положительные,заряды на поверхностных атомах кремния, а также сравнительно низкие значения энергии низшей вакантной молекулярной орбитали, локализованной в основном на этих атомах, указывают на заметную электроноакцепторную способность последних. Атомы кислорода кремнекислородного каркаса S1O2 в силу зарядовой стехиометрии несут примерно вдвое меньшие отрицательные заряды. Создаваемый атомами кремния и кислорода каркаса электростатический потенциал даже на довольно значительных расстояниях от поверхности существенно влияет на характер адсорбции и ориентацию полярных молекул. В случае гидроксилированных фрагментов поверхности наличие полярных групп =Si-OH с разноименными зарядами на атомах кислорода и водорода определяет гидрофильность поверхностного слоя и возможность эффективной адсорбции больших электронодонорных молекул за счет водородных связей.
Современная нанотехнология и химия надмолекулярных веществ
В настоящее время к современным способам получения твердых веществ относятся плазмохимический синтез, механосинтез, газофазный синтез, осаждение надмолекулярных веществ из коллоидных растворов (В.А. Тертых, В.В, Павлов, 1978; В.А. Тертых, 1983; X. Дункен, В. Лыгин, 1980; А.А. Дулов и др., 2001).
Одним из перспективных методов синтеза наноструктур на твердых подложках является метод молекулярного наслаивания (МН) из газовой фазы, позволяющий получать высокоорганизованные твердые вещества заданного химического состава и строения (СИ. Кольцов, 1984, 1992).
Многочисленные данные по реализации молекулярного наслаивания веществ различной химической природы на поверхности разного рода твердых объектов показали не только большие возможности практического использования этих реакций для создания материалов целевого назначения (катализаторов, люминофоров, сорбентов, полупроводников, композиционных материалов), но и подтвердили широкое распространение явления молекулярного наслаивания, присущего всем полиатомным объектам (В.Б. Алесковский, 1976, 2001; В.Б. Алесковский, В.Г. Корсаков, 1980; СИ. Кольцов, 1984).
Основной принцип молекулярного наслаивания регламентирует процессы образования полиатомных упорядоченных сложных химических систем с повторяющимися фрагментами структуры. Инициируемая функционалами на Каждой стадии процесса МН определенная последовательность химических реакций, связывающих более или менее крупные структурные фрагменты, приводит к закономерному программируемому формированию вещества заданного состава и химического строения. Таким образом, реакции молекулярного наслаивания - это химически определенная последовательность циклических чередующихся реакций функционалов твердой матрицы с соответствующим компонентом из газовой или жидкой фазы, сопровождающихся направленным присоединением атомов или атомных группировок с образованием химически связанного с матрицей монослоя структурных единиц, из которых при многократном повторении цикла послойно наращивается твердое вещество.
Основными признаками реакций молекулярного наслаивания на поверхности твердых веществ являются следующие: 1) автоматизм химического ограничения каждого цикла реакции моле кулярного наслаивания образованием мономолекулярного слоя структур ных единиц; 2). программируемая цикличность реакций молекулярного наслаивания, определяющая помонослойный синтез вещества с трехмерной структурой; 3) пространственно направленное присоединение структурных единиц к поверхности твердого тела, задаваемое характером размещения на ней функционалов. Для реализации реакций молекулярного наслаивания и устойчивости химического строения синтезируемого слоя продукта существенную роль иг 35 рает характер химических связей между атомами, возникающих на стадии формирования каждого монослоя. Основным условием, обеспечивающим упаковку в единую структуру полиэдров с различными параметрами, является образование в результате реакций молекулярного наслаивания межатомных связей с достаточным вкладом ковалентной составляющей, обеспечивающей их пространственную направленность. Для протекания реакций, молекулярного наслаивания необходимо выполнение условий наличия реакционноспоеобных функциональных групп на поверхности твердого тела и присутствия соответствующего нйзкомолеку-лярного реагента, отсутствие взаимодействия между низкомолекулярными реагентами и продуктами реакции вне поверхности твердого тела, а также необходимо определенное структурное соответствие между поверхностными функционалами и молекулой реагента. Наиболее фундаментально реакции молекулярного наслаивания были изучены на примере синтеза элементоксидных слоев при взаимодействии гидроксогрупп силикагеля с хлоридами элементов II - VII групп Периодической системы Д.И. Менделеева. В качестве матриц были также использованы другие кремнеземы (аэросил, силохром), металлы, углерод (В.Б. Алесков-ский, 1976, 1983). Начальной стадией процесса молекулярного наслаивания является синтез монослоя структурных единиц На поверхности матрицы: n (»Si -ОН) + ЭСЦ - («Si - О - )п ЭС1т„„ + (m-n) НС1 (7) Состав, строение и свойства образующегося монослоя структурных единиц определяется концентрацией исходных -ОН групп, химической природой и строением исходного галогенида и матрицы, устойчивостью образующихся соединений (В.Б. Алесковский, 1983). При этом наличие монослоя может оказать существенное влияние на физико-химические свойства синтезируемых продуктов, например, термическую устойчивость (СИ. Кольцов, А.Н. Волкова, 1975), каталитические, сорбционные, кислотно-основные (В.Б. Алесковский, 1976, 2001). Наличие в титансодержащих группах ( Si - О — )3 Ті-Cl реакционно-способного хлора позволяет при обработке таких продуктов парами Н20 осуществить реакцию по схеме: Образующиеся гидроксильные группы, связанные с атомами титана, способны взаимодействовать вновь с парами TiCU в последующем цикле молекулярного наслаивания. По аналогичным химическим реакциям осуществлен синтез на поверхности кремнеземов монослоев алюминия (В.Б. Копылов, СИ. Кольцов, 1972), германия (СИ. Кольцов, В.Б. Алесковский, 1969), фосфора (СИ. Кольцов, 1992), Хрома (В.Н. Пак и др., 1976). Получение фосфоркислородного слоя проводили путем многократной и попеременной обработки силикагеля парами РС13, СІ2, Н20 (СИ. Кольцов, 1992). В результате на поверхности протекают реакции по схеме: В отличие от хлоридов титана, германия хемосорбция СЮ2С12 на гид-роксилированной поверхности кремнезема приводит к образованию хромсо-держащих группировок, в которых хлор отсутствует. При восстановлений водородом хром (VI)-coдержащего силикагеля на поверхности появляются дополнительные гидроксилы, но уже связанные с трехвалентным хромом в группах (=Si-0-)2OOH (А.А. Малыгин, СИ. Кольцов, 1977).
Химический анализ элементоксидных слоев сорбентов
На стадии 1 образуется гидрогель из аэросила за счет протекающих процессов конденсации с участием силанольных групп кремнезема. На стадии 2 (созревания и синерезиса гидрогеля) протекают дегидратационныё процессы, сопровождающиеся уменьшением объема гидрогеля, его уплотнением. На стадии 3 при термообработке гидрогель превращается в ксерогель, при этом объем его уменьшается более чем в 8-16 раз благодаря действию капиллярных сил. Степень сжатия скелета геля во многом зависит от соотношения капиллярных сил и противодействующей им прочности каркаса геля. Стадии 4-6 отражают завершающий процесс синтеза композиционных сорбентов, обеспечивающий выделение высокодисперсной фракции и получение стерильного сорбционного материала.
Механизм образования пористых органокремнеземных сорбентов можно представить как сложный процесс, сопровождающийся формированием корпускулярной структуры кремнеземного остова из непористых частиц аэросила и включением в него органических полимеров (хитозана, сульфохи-тозана) за счет многоточечной адсорбции на катионообменных центрах поверхности кремнеземного носителя. Таким образом, структура композиционных сорбентов представлена корпускулярной системой, состоящей из частиц кремнезема, покрытых органическими полимерами, связанных друг с другом в едином пространственном каркасе. Размер корпускул определяет величину удельной поверхности, плотность их упаковки, объем и радиус пор. При корпускулярном строении композиционных сорбентов поры представляют собой пустоты между различным образом упакованными корпускулами. Рассмотренный механизм образования композиционных сорбентов согласуется с данными литературы по получению композиционных сорбентов для аффинной хроматографии и носителей для иммобилизованных ферментов (А.В. Брыкалов, 1993; А.В. Брыкалов, А.Н. Кабанкова, 2001).
Получение хитозанкремнеземных сорбентов в соответствии со схемой синтеза осуществляли следующим образом; к 5 г аэросила А-380, добавляли 3% раствор хитозана в 3% уксусной кислоте. Полученный продукт подвергали гелеобразованию от 3 до 24 часов при температуре 295К, предварительно поместив гидрогель в фарфоровые чашки. Далее сорбент высушивали до ксерогеля в течение 2 часов при температуре 368-378К, измельчали, а затем методом рассева выделяли фракции размером частиц 70-150 мкм. В соответствии с данной методикой также получали сульфохитозанкремнеземные композиционные сорбенты.
Проведены исследования структурных характеристик сорбентов. Удельная поверхность была определена методом, основанным на низкотемпературной сорбции азота, суммарный объем пор и диаметр пор определены методом ртутной порометрии.
В табл. 5 представлены характеристики хитозанкремнеземных композиционных сорбентов, полученных методом формирования пористой структуры кремнеземной матрицы в присутствии органического полимера.
Анализ представленных. в таблице данных указывает на то, что при увеличении количества хйтозана в составе композиционного сорбента в 2-4 раза, наблюдается уменьшение величины удельной поверхности на 36-43% и увеличение суммарного объема пор. Обнаруженная закономерность может быть объяснена влиянием природы интермицеллярной жидкости на формирование структуры гидрогеля, а также стабилизирующим действием органического полимера - хйтозана, проявляющимся в противодействии процессу, связанному с укрупнением корпускулярных частиц в структуре получаемых композиционных сорбентов.
Проведены исследования микроструктуры синтезированных композиционных сорбентов на сканирующем электронном микроскопе IMZ - Т 3000 в сравнении с известными кремнеземными материалами, такими как макропористое стекло, силохром и гидротермальный силохром С - 120 по методике, представленной в разделе «Материалы и методы».
Установлено, что силохром С - 120 (рис. 2) имеет однородную глобулярную структуру с размером сросшихся частиц оксида кремния около 20 нм. Топография поверхности макропористого стекла представлена губчатой структурой (рис.3).
Образец композиционного хитозанкремнеземного сорбента имеет измененную глобулярную структуру, сочетающуюся с образованными сростками неправильной формы. В отличие от структуры макропористых стекол, в образцах композиционных сорбентов обнаруживаются обширные участки аморфных образований с губчатой структурой. Микроструктура композиционного сорбента, содержащего в качестве органического полимера сульфо-хитозан, подобна микроструктуре выше описанного хитозанкремнеземного сорбента.
Указанная закономерность подтверждена спектрами диффузного отра жения композиционных хитозанкремнеземных сорбентов, выполненными на приборе AQV - 50 "Shimadzu", в сравнении с аэросилом А - 380 и аэросило гелем на основе данного аэросила (рис. 4). Наличие органического полимера - хитозана в составе композиционных сорбентов приводит к резкому увели чению интенсивности поглощения. Причем с увеличением количества хито зана в составе композиционных сорбентов наблюдается закономерное увели чение поглощения. Полученные результаты по закономерностям изменения спектральных характеристик композиционных хитозанкремнеземных сор бентов сопоставимы со спектром диффузного отражения исходного полиме ра хитозана.
Синтез модифицированных образцов углеродных сорбентов методами окисления и аминированйя
Весьма перспективно получение аппликационных сорбентов с иммобилизованными лекарственными препаратами, что обеспечивает пролонгацию их действия, а также целенаправленное регулирование адсорбционных, про-тивомикробных, противовоспалительных свойств. Существующие при этом проблемы связаны с выбором эффективных лекарственных препаратов, созданием биосовместимых сорбционных материалов, разработкой методов иммобилизации биологически активных соединений, а также сохранением направленности и стабильности свойств медицинских сорбентов.
Целью данного раздела является проведение исследований по разработке биосовместимых сорбентов на хитозанкремнеземной основе, имеющих заданный состав и определенную направленность биохимического действия.
Нами разработана методика иммобилизации на хитозанкремнеземных сорбентах фермента лизоцима. Использованный для иммобилизации лизоцим, согласно литературным данным (Х.Я. Грант и др., 1973), является мурамидазой (N - ацетилгексоза-минидаза) - фермент, гидролизующий глюкозидную связь аминосахаров. Лизоцим разрушает пептидополисахарид клеточных стенок бактерий, в результате чего образуются дисахариды, состоящие из мураминовой кислоты и глюкозамина. Лизоцимы различного происхождения обладают одинаковым молекулярным весом 13900, близким биологическим действием, могут быть отнесены к одной семье лизоцимов.
Предложена ориентировочная формула лизоцима, состоящая из нескольких цепей аминокислот, связанных между собой мостиками S из остатков цистеина. Первая цепь состоит из 60 аминокислот, вторая - из 50, третья - содержит С- концевой глицин, цистеин, аргинин, лейцин. В состав лизоцимов в основном из аминокислот входят лизин, фенилаланин, глицин, аргинин, глютаминовая кислота, цистеин, аланин, гистидин, аспарагиновая кислота, тирозин, серии, триптофан, пролин, валин, метионин.
Установлено антибактериальное, противовирусное, противоопухолевое действие лизоцима. Положительные результаты применения лизоцима в медицине были получены Б хирургической практике, особенно при лечении поверхностных гнойных ран и ожогов. При поражении кожи, роговицы, конь-юктивы глаза применение лизоцима способствовало ускорению рассасывания некротических тканей и быстрому их заживлению.
Разработана методика иммобилизации на хитозанкремнеземных сорбентах фермента лизоцима из, яичного белка, изготовленного на Олайнен-ском заводе химических реактивов. Навеска сорбента массой 100 мг, полученного по методике, описанной в разделе З.1., обрабатывалась 2 мл раствора лизоцима, содержащего 1. мг фермента. Смесь инкубировали при температуре 277 К в холодильной камере в течение 12 часов. Иммобилизованный препарат отмывали фосфатным бу фером, осуществляя контроль содержания белка в промывных фильтратах спектрофотометрически при 540 нм. Далее определяли активность иммоби лизованного лизоцима при его действии на субстрат, используя турбидимит рический метод. В основе метода лежит свойство лизоцима быстро лизировать мукопо-лисахариды клеточных стенок некоторых грамположительных микробов, в частности, Micrococcus lysodeicticus. Построенная из чередующихся остатков N - ацетилглюкозамин и N - ацетилмураминовой кислоты, соединенных /?(1-4) - глюкозидными связями, микробная стенка под действием лизоцима распадается вследствие разрыва указанных связей (Х.Я. Грант и др., 1973). Содержание лизоцима определяли с помощью калибровочного графика. Далее рассчитывали активность фермента при его действии на субстрат. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 9. и К2 - константа скорости первого порядка распада фермент - суб стратного комплекса ES с образованием продуктов реакции Р и регенерацией фермента. При экспериментальных исследованиях, когда концентрация суб страта намного превышает концентрацию фермента ([So] [Ео]), ЧТО является обычным условием изучения кинетики ферментативных реакций, уравнение материального баланса по ферменту можно записать в следующем виде:
