Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы (физико-химические методы при выделении и определении антимикробных пептидов) 12
1.1. Физико-химические закономерности разделения и определения антимикробных пептидов 12
1.1.1. Гель-проникающая колоночная хроматография и твердофазная экстракция как начальные этапы очистки пептидов 12
1.1.2. Применение ВЭЖХ для установления физико-химических характеристик удерживания пептидов и условий их определения на силикагеле С18 и пористом графитированном углероде Гиперкарб 14
1.1.3. ВЭЖХ исследование пептидов на катионообменных носителях 19
1.1.4. Физико-химические основы хроматографической идентификации пептидов 22
1.1.5. Физико-химические характеристики удерживания и их корреляции со свойствами исследуемых молекул 30
1.2. Физико-химические основы масс-спектрометрии пептидов 35
1.2.1. Основные используемые в масс-спектрометрии пептидов методы ионизации и типы масс-анализаторов 35
1.2.2. Пробоподготовка и ионизация пептидов в методе МАЛДИ 43
1.2.3. Особенности фрагментации пептидов в условиях получения МАЛДИ-МС/МС спектров 49
1.2.4. Структурная информация, получаемая на основе МС/МС спектров и ее использование для идентификации пептидов 54
1.2.5. Масс-спектр как физико-химическая характеристика пептида 57
1.3. Антимикробные пептиды: свойства, значение и механизмы действия 60
1.3.1. Значение и свойства антимикробных пептидов 60
1.3.2. Пептиды в насекомых 61
1.3.3. Биологическое тестирование 64
Глава 2. Экспериментальная часть 67
2.1. Реагенты и оборудование 67
2.2. Объекты и пробоподготовка 68
2.3. Методики проведения физико-химического эксперимента 73
Глава 3. Результаты и обсуждение 79
3.1. Оценка эффективности пробоподготовки 79
3.2. Антимикробный тест и его результаты 80
3.3. Сравнение различных физико-химических методов хроматографирования пептидов и выбор оптимальных хроматографических условий 82
3.3.1. Катионообменная гель-хроматография пептидов гусеницы Galleria mellonella на сефадексе СМ-50 82
3.3.2. Сравнительное исследование пептидных фракций гусеницы Galleria mellonella методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 83
3.3.3. Катионообменное ВЭЖХ исследование пептидов Galleria mellonella 89
3.3.4. ВЭЖХ исследование пептидов гусеницы Galleria mellonella на сорбенте Гиперкарб и молекулярно-статистическая оценка теплот адсорбции пептидов 93
3.3.5. Физико-химические характеристики удерживания, используемые для построения корреляций со свойствами исследуемых пептидов 96
3.4. Сравнительное масс-спектрометрическое исследование и идентификация пептидов 109
3.4.1. Изучение антибактериальных пептидных фракций после катионообменной гель-хроматографии методом МАЛДИ 109
3.4.2. Изучение пептидного состава фракций после обращенно-фазовой ВЭЖХ для разных пептидных смесей 110
3.4.3. Изучение пептидного состава фракций после катионообменной ВЭЖХ для разных пептидных смесей 123
3,4.4, Идентификация пептидов Galleria mellonella по базам данных 124
3.4.6. Гидролиз пептидов трипсином в антибактериальных фракциях и масс-спектрометрическое изучение продуктов гидролиза 143
3.4.7. Применение алгоритмов секвенирования de novo для идентификации пептидов гусеницы Galleria mellonella 155
3.4.8. Физико-химическая характеристика пептидов на основе масс-спектрометрических данных. МС/МС спектры 160
3.5. Сочетание хроматографической и масс-спектрометрической идентификации 166
Заключение 171
Выводы 173
Благодарности 174
Список литературы 175
- Физико-химические характеристики удерживания и их корреляции со свойствами исследуемых молекул
- Сравнительное исследование пептидных фракций гусеницы Galleria mellonella методом обращенно-фазовой ВЭЖХ
- Изучение пептидного состава фракций после обращенно-фазовой ВЭЖХ для разных пептидных смесей
- Физико-химическая характеристика пептидов на основе масс-спектрометрических данных. МС/МС спектры
Введение к работе
Актуальность темы: В связи с резким ростом числа новых органических соединений пептидной природы, полученных при секвенировании, проблема установления взаимосвязи между физико-химическими свойствами этих пептидов и их структурой является одной из наиболее актуальных в жидкостной хроматографии. Наиболее информативными в этом плане являются современные варианты высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ, с применением матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации МАЛДИ и масс-селективного детектирования, особенно в тандемном варианте. В настоящее время теория сорбции и разделения органических, а тем более биоорганических, соединений находится практически в стадии разработки, что требует детального изучения адсорбционных свойств большого числа таких соединений, в частности, пептидов. Физико-химическое обоснование процессов в системе сорбат-сорбент-элюент в основном носит описательный характер. В связи с этим такие исследования важны, поскольку накопление физико-химических данных по удерживанию в условиях ВЭЖХ позволяет создавать модели физико-химического поведения соединений и обосновывать оптимальные условия разделения сложных смесей данным методом, а в сочетании с масс-спектроскопией - проводить идентификацию компонентов сложных смесей пептидов.
Пептидные продукты, получаемые на основе иммунных реакций насекомых, могут проявлять разнообразную биологическую активность и могут стать основой для разработки новых фармакологических средств. Врождённая иммунная система восковой моли {Galleria mellonella, GM) производит множество пептидов для защиты от болезнетворных микробов. Из GM выделили ряд пептидов бактерицидного и противогрибкового действия. Перспективным является использование GM в качестве модельной системы при изучении биосинтеза антибактериальных пептидных продуктов, благодаря ее доступности и законодательной урегулированности этической стороны исследований. Такое биопроиз-
водство требует комплексного подхода к исследованию пептидных продуктов, сочетающего физико-химические методы разделения и идентификации.
Физико-химической основой хромато-масс-спектрометрического метода является возможность совместно использовать результаты хроматографических и масс-спектрометрических исследований. При разработке физико-химических основ разделения какого-либо класса соединений проводят определение термодинамических характеристик адсорбции, таких как величины удерживания - In к, изменение свободной энергии Гиббса - AG, изменение энтальпии - АН, изменение энтропии - AS, отражающих связь между структурой молекул и их физико-химическими свойствами (ван-дер-Ваальсов объём, липофильность, поляризуемость, диполь ный момент). Использование разных вариантов ВЭЖХ для таких исследований позволяет устанавливать закономерности удерживания пептидных продуктов и на их основе разделять смеси и идентифицировать отдельные компоненты смесей, оценивать молекулярные массы исследуемых молекул, отделять соли и низкомолекулярные компоненты. Применение метода МАЛДИ-МС/МС позволяет получать информацию о массовых числах, фрагментации пептидных молекул, определять структурные особенности и, таким образом, быстро и эффективно устанавливать аминокислотные последовательности пептидов, используя два подхода к интерпретации масс-спектров: поиск по базам данных и de novo секвенирование (установление аминокислотной последовательности).
Цель и задачи исследований:
Целью работы являлось установление закономерностей хроматографиче-ского удерживания антимикробных пептидов GM, полученных с помощью иммунных реакций, в условиях метода ВЭЖХ и выбор оптимальных условий разделения и идентификации, с использованием хромато-масс-спектрометрии.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
1. Определить физико-химические характеристики удерживания исследуемых пептидов (фактора удерживания, разности дифференциальных мольных энер-
гий Гиббса). Оценить соответствие хроматографического поведения пептидов закономерностям двух наиболее надежных подходов к описанию их удерживания в условиях градиентной обращённо-фазовой (ОФ) ВЭЖХ.
Определить условия проведения иммунизации GM для получения пептидных смесей с высоким содержанием антибактериальных пептидов.
Разработать методологию хроматографического разделения смесей индуцированных пептидов, используя разные режимы и сорбенты; подобрать параметры хроматографического разделения.
Масс-спектрометрически идентифицировать антимикробные пептиды. Изучить фрагментацию антибактериальных пептидов методом МАЛДИ-МС/МС.
На основании данных хроматографического и масс-спектрометрического исследования разных пептидных смесей разработать методику определения их состава.
Провести антибактериальное тестирование, выявить активные пептиды среди всех полученных фракций и разработать способ идентификации охарактеризованных пептидных продуктов, не предполагающий обязательного проведения антимикробного теста.
Научная новизна:
Получены термодинамические характеристики адсорбции антимикробных пептидов, описывающие их разделение в условиях ОФ и катионообменной ВЭЖХ. По результатам сопоставления реальных и расчетных времен удерживания для ряда антибактериальных пептидов проведена их хроматографическая идентификация, в том числе на основании физико-химических характеристик адсорбции и корреляций, связывающих структуру пептидов с удерживанием.
Определены условия проведения иммунизации GM и получения пептидных смесей с высоким содержанием антибактериальных пептидов.
Изучено несколько хроматографических режимов при исследовании пептидных продуктов на трех различных сорбентах и подобраны оптимальные условия разделения сложных смесей пептидов. Впервые проведена ВЭЖХ пептидных продуктов GM на сильном катионите.
На основе МС/МС масс-спектров изученных пептидных продуктов идентифицированы как известные антимикробные пептиды, так и не описанные ранее в литературе. Масс-спектрометрически установлена аминокислотная последовательность впервые обнаруженных антимикробных пептидов.
Сочетание хроматографических и масс-спектрометрических данных позволило подробно изучить состав различных пептидных смесей, прошедших разную пробоподготовку. Показано, что в пептидной смеси, полученной без иммунизации, содержатся три известных антимикробных пептида, а в пептидных смесях, полученных после обработки 1.1-диметилгидразином (НДМГ) и его производным, бактериями В. cereus, детектированы все известные антимикробные пептиды GMn ряд не описанных ранее.
Практическая значимость работы:
Хроматографическое выделение антибактериальных пептидных продуктов может являться альтернативой многостадийному пептидному синтезу, а совершенствование данных процессов и разработка стандартизированных методик могут стать основой для их препаративного и промышленного выделения при создании лекарственных средств.
Изучение действия токсичных компонентов ракетного топлива (НДМГ) на биологические организмы является важной практической задачей. Использование для таких испытаний модельного организма GM может внести существенный вклад в понимание механизмов токсического действия и в разработку средств повышения безопасности ракетно-космической деятельности.
На защиту выносятся следующие положения:
Физико-химические характеристики удерживания пептидов в условиях ОФ и катионообменной ВЭЖХ (фактор удерживания k, Ink и дифференциальные мольные энергии Гиббса и их разности AG). Результаты сопоставления экспериментальных и расчетных времен удерживания.
Способы хроматографического разделения смеси природных пептидов с антибактериальной активностью с использованием различных вариантов ВЭЖХ: катионообменного и обращенно-фазового.
Результаты идентификации аминокислотных последовательностей антимикробных пептидов, полученные на основе исследования МС/МС масс-спектров. Результаты de novo секвенирования для ряда пептидов в составе антибактериальных фракций.
Результаты комплексного исследования пептидных смесей методами жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии МАЛДИ-МС/МС, полученные на основе использования хроматографической информации, характеристик удерживания и установленных физико-химических закономерностей, для увеличения достоверности идентификации пептидов.
Апробация работы: Результаты исследований докладывались на IV Всероссийской конференции-школе «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения» (Москва, 2010), на Всероссийской научно-практической конференции «Хроматография - народному хозяйству» (Дзержинск, 2010), на XIII Всероссийском симпозиуме «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности» (Москва, 2009), на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Москва, 2008).
Публикации: По результатам исследования опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК, и 8 тезисов докладов.
Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы из 246 наименований, материал изложен на 199 страницах машинописного текста, включает 78 рисунков и 29 таблиц.
Физико-химические характеристики удерживания и их корреляции со свойствами исследуемых молекул
Физико-химические процессы оказывают влияние на закономерности разделения в жидкостной хроматографии. Это находит отражение в теориях хро-матографического удерживания, которые решают две основные задачи. Во-первых, устанавливают корреляционные зависимости между временами удерживания сорбатов и условиями эксперимента. Данная задача не решена в настоящее время на строгой физико-химической основе. Во-вторых, устанавливают связи между строением сорбатов и их величинами удерживания, например, на основе молекулярно-статистических расчетов, на основе индексов удерживания и корреляций структура-свойства. Для решения этой задачи используется полуэмпирическое моделирование, основанное на общих представлениях о механизмах сорбции в системах разного типа. Различные приближенные модели используются потому, что невозможно полностью учесть все молекулярные взаимодействия в хроматографической системе [35].
Общий принцип моделирования может быть выражен линейным уравнением у = ах + Ь, где у - параметр удерживания или какая-либо его функция (Ink), а - коэффициент, b - постоянная составляющая параметра у, х - параметр, связанный с особенностями структуры сорбата. Выделяют три вида моделей в зависимости от параметра х. Это аддитивные модели (где х — сумма инкрементов удерживания), модели «удерживание-свойство» (где х - нехроматографическое свойство сорбата), модели «удерживание-строение» (где х - математическая функция строения сорбата).
Использование последнего типа моделирования позволяет создавать.количественные соотношения структура-удерживание в ОФ жидкостной хроматографии. Время удерживания гомологического ряда соединений может быть предсказано в зависимости от номера мономерных звеньев, а иногда и от числа атомов углерода. Оно также может быть связано с молекулярным размером, ван-дер-Ваальсовым объемом и площадью поверхности. Расчеты молекулярных свойств могут быть выполнены с помощью вычислительных химических программ.
Таким образом, существуют физико-химические и аддитивные методы расчета In к. К расчетным методам относятся молекулярно-статистические, корреляционные методы, а также методы, основанные на концепции критической хроматографии и анализе инкрементов [102, 107, 116].
Времена удерживания и все производные от них величины (k, In к, а) являются по существу термодинамическими характеристиками процесса разделения [90]. Однако в хроматографии результат определяется совместным влиянием факторов термодинамического и кинетического типа.
Фазовое отношение колонки ф позволяет связать хроматографический процесс с аналогичным ему по составу фаз статистическим процессом распределения и далее с термодинамическими характеристиками Ф = Vs/Vm (7) где Vs- объем неподвижной фазы в колонке, Vm— свободный объем колонки. Так, коэффициент емкости данной системы к, рассчитанный по формуле: k = (tR0)/to (8) непосредственно связан с константой распределения в данной системе К и свободной энергией сорбции AG:
Коэффициент удерживания (емкости) к не зависит от большинства экспериментальных факторов, однако ср - фазовое отношение (плотность упаковки колонки) влияет на данный параметр.
Сравнительную термодинамическую характеристику двух разделяемых соединений дает селективность а: ai 2=(ti0)/(t2o) (10)
Влияние температуры на величины удерживания представляет интерес с нескольких точек зрения. Представленное выше уравнение (4) позволяет от величин удерживания перейти к термодинамическим параметрам и выяснить некоторые аспекты механизма сорбции. Применение хроматографии для установления физико-химических закомерностей требует максимально возможной воспроизводимости времен удерживания и поэтому важно знать, в какой мере изменение температуры колонки может повлиять на разделение. Проведение хроматографии при повышенной температуре способствует уменьшению вязкости, снижению давления и повышению эффективности, следовательно, изменение температуры может быть средством изменения селективности.
Основная кинетическая характеристика процесса - это высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ). Эта величина соответствует высоте слоя сорбента, при прохождении через который акт сорбции-десорбции успевает совершиться в среднем один раз и отражает качество использованного сорбента, качество заполнения колонки и правильность выбора хроматографиче-ского режима. Данная величина также является мерой интенсивности процессов размывания в колонке [35].
Определение термодинамических характеристик адсорбции, таких как величины удерживания, AG, АН, AS, позволяет отразить связь между структурой биомолекул и их хроматографическими и термодинамическими характеристиками (липофильность, In k, AG). А знание кинетических характеристик процесса позволяет оценивать качество колонки и оптимизировать разделение.
Связь между удерживанием, производными от него физико-химическими характеристиками удерживания и различными физико-химическими характеристиками молекул исследовалась в многочисленных работах [34, 46, 56, 66, 71]. В первую очередь корреляции строились с липофильностью, поляризуемостью, ван-дер-Ваальсовым (мольным) объемом [89, 92, 94]. Известны и более «экзотические» корреляции: с топологическими индексами молекул или потенциалами ионизации [90].
Все эти корреляции «хорошо предсказывают» удерживание для небольших групп молекул. Вместе с тем их использование позволяет получить важную физико-химическую информацию о свойствах молекулы и аналитическую, необходимую для идентификации.
Сравнительное исследование пептидных фракций гусеницы Galleria mellonella методом обращенно-фазовой ВЭЖХ
Выполнено разделение пептидных продуктов методом ОФ ВЭЖХ. Проведено варьирование хроматографических параметров: скорости и состава подвижной фазы, температуры колонки, протяженности градиента, времени изо-кратической промывки перед началом градиента. Реализованы 6 режимов градиентного элюирования, они представлены в таблице 3.
При хроматографии пептидной смеси, полученной по методике № 1 (А) в условиях 20 минутного градиента и скорости подвижной фазы 0.7 мл/мин (режим градиентного элюирования № 1) (рис. 15) в элюате масс-спектрометрически идентифицирована смесь известных антимикробных пептидов и смесь их фрагментов. По-видимому, наличие данных смесей в собранных фракциях обусловлено слишком быстрым увеличением концентрации ацето-нитрила при данной скорости элюирования. Поэтому при дальнейшем исследовании мы использовали более растянутые градиенты и меньшую скорость элюирования.
Проведено сравнение хроматограмм четырех (рис. 16) пептидных смесей (пробоподготовка по методикам № 1 (Б) и № 3 (А)), полученных в 30 минутном режиме градиентного элюирования, отличающимся составом элюирующей подвижной фазы: ацетонитрил (AcCN) или AcCN/0.04 ТФУ (режимы градиентного элюирования № 2 и № 3). При добавлении ТФУ в ацетонитрил были замечены следующие закономерности: изменилась селективность разделения; произошло увеличение удерживания известных антибактериальных пептидов, например, время удерживания Defensine с массой 4715 Д увеличилось с 16 минут до 26, однако порядок элюирования пептидов из колонки не изменился.
При ВЭЖХ с ТФУ как ион-парным агентом возможна реализация катио-нообменного и гидрофобного механизмов. В качестве одного из вариантов элюирования с катионита используется увеличение рН. При градиентном элюировании ацетонитрилом рН увеличивается (концентрация кислоты снижается) за счет уменьшения доли растворителя А, содержащего ТФУ. С этим может быть связано уменьшение удерживания антимикробных пептидов. При присутствии ТФУ и в ацетонитриле - рН постоянно и, соответственно, не происходит его увеличение за счет снижения доли растворителя А.
Проведено сравнение и анализ хроматографических профилей, полученных в одинаковых условиях 40 минутного градиента (режим градиентного элюирования № 4), для различных образцов пептидных смесей, полученных по методу № 1 (Б) (рис. 17). Данные хроматографического анализа сопоставлены с масс-спектрометрическими.
На рисунке 17 наблюдается усложнение хроматографических профилей в ряду пептидных смесей, полученных:
- без иммунизации
- после иммунизации E.coli,
- после иммунизации E.coli и B.cereus за счет увеличения интенсивности сигналов и появления новых пиков. Особенно сложный характер хроматограммы в последнем случае, по-видимому, обусловлен использованием сочетания двух бактерий, вызывающих развитие более интенсивного иммунного ответа, синтез новых соединений и деструктивные процессы.
В результате проведенных исследований подобраны оптимальные условия разделения и пробоподготовки антибактериальных пептидов методом ОФ ВЭЖХ (пробоподготовка по методу № 2 (Б) и режим градиентного элюирова-ния № 5) (рис.18 А). Хроматографии данного образца предшествовала твердофазная экстракция, выполненная, как описано в разделе 2.3. экспериментальной части.
Установлено, что антимикробные пептиды, являющиеся объектами исследования, и их фрагменты элюируются в условиях хроматографического режима № 2 (25 С) в диапазоне концентраций ацетонитрила 35-55 %, в условиях хроматографического режима № 4 (40 С) в диапазоне концентраций ацетонитрила 40-80 %, в условиях хроматографического режима № 5 (25 С) в диапазоне концентраций ацетонитрила 45-75 %. Столь большие различия в элюирующих концентрациях ацетонитрила между хроматографическими режимами № 2 и № 4, № 5 обусловлены содержанием ТФУ в ацетонитриле. В двух последних случаях ТФУ является ион-парным агентом, способствует постоянному рН в течение всего разделения и увеличивает удерживание соединений. Различия в элюирующей концентрации ацетонитрила в случае хроматографических режимов № 4 и № 5 не столь велики и, по-видимому, связаны с изменением температуры.
Полученная хроматограмма (рис. 18 А) позволяет рассчитать хроматогра-фические параметры, которые характеризуют разделение: фактор емкости, разрешение, площадь пика. Результаты расчета приведены в таблице 7.
Для того чтобы количественно оценить содержание пептидов во фракциях, проведена калибровка колонки антибактериальным пептидом низином (рис. 18 Б) (табл. 8). Получена линейная зависимость у = 1415.Зх - 326.26 площади пика от количества пептида, введенного в колонку, с коэффициентом корреляции 0.9995 (рис. 19). Изучены формы пиков для данного стандарта и установлена концентрация пептида, при которой пик перестает быть регистрируемым (интегрируемым). Так, для низина пороговое значение чувствительности при 214 нм составляет 0.6 мкг. В результате такой количественной оценки установлено, что в образце на рисунке 18 А содержание пептидов находится в пределах 1-10 мкг.
Изучение пептидного состава фракций после обращенно-фазовой ВЭЖХ для разных пептидных смесей
Масс-спектрометрический анализ фракций после ОФ ВЭЖХ позволил оценить, как прошла иммунизация и пробоподготовка, узнать состав антибактериально активных фракций и предположить, чем обусловлено биологическое действие: известными антимикробными пептидами или ранее неизвестными, индуцированными (т.е. полученными после воздействия) соответствующим иммунизирующим агентом. В результате работы пептидный состав гемолимфы неиммунизированных личинок, а также личинок, обработанных различными иммунизирующими агентами, полностью охарактеризован в диапазоне масс 5-30 кД. Наряду с шестью известными антимикробными пептидами (таблица 2), выявленными в каждом варианте иммунизации, обнаружено много новых пептидов, не представленных в базах данных и свидетельствующих о том, что на сегодняшний день организм Galleria mellonella по-прежнему представляет большой теоретический и практический интерес как источник пептидных продуктов с антибактериальными свойствами.
Установлено, что в гемолимфе неиммунизированных личинок также содержатся некоторые из изученных антимикробных пептидов, в частности, Anionic antimicrobial peptide 2, Galleria defensin, Lebocin-like anionic peptide 1, Cecropin-D-like peptide. До начала наших работ в неиммунизированных личинках пептидные продукты не определялись, вследствие чего полученные данные представляют самостоятельный интерес, поскольку, по-видимому, именно они определяют антибактериальное действие препарата, получаемого как спиртовой экстракт личинок Galleria mellonella — «Натуральный экстракт доктора Мухина» (НЭДМ, Свид. гос. регистр. № 77.99.23.3.У.8597.7.05).
Образование большого числа неизученных пептидов с массами преимущественно до 3 кД, а также фрагментов от известных антимикробных пептидов в гемолимфах личинок, иммунизированных Bacillus cereus, может быть связано с протеазными механизмами защиты этой бактерии от разрушения или с экспрессией пептидов именно такого состава в результате иммунного ответа.
В случае иммунизации высокими концентрациями НДМГ и его гидразона с ацетоном наряду с индукцией антимикробных пептидов, также наблюдали большое число неизученных пептидов с массами преимущественно до 3 кД, по-видимому, образовавшихся в результате окислительно-восстановительной деструкции для случая НДМГ и иммунного ответа в случае его производного.
В результате проведенных экспериментов отмечена тенденция увеличения числа и разнообразия пептидных продуктов с увеличением концентрации иммунизирующего агента (от преимущественного преобладания известных антимикробных пептидов до «обогащения» множеством новых пептидов).
Антибактериальные пептидные продукты, полученные после обработки НДМГ и его гидразоном При хроматографическом и масс-спектрометрическом анализе пептидных продуктов, полученных после обработки гусениц НДМГ и его гидразоном (методика № 3 (Б)) хроматограммы (режим градиентного элюирования № 6) и состав полученных фракций оказались почти одинаковы.
Качественный состав полученных фракций почти полностью совпадает. Среди пептидных продуктов преобладают пять известных антимикробных пептидов Lebocin-like anionic peptide 1, Galleria defensin, Anionic antimicrobial peptide 2, Proline-rich antimicrobial peptide 2, кроме того детектированы Lysozyme, Apolipophorin-3 и Proline-rich antimicrobial peptide 1. Особенно заметно преобладание Proline-rich antimicrobial peptide 2. Однако среди пептидных продуктов фракции 38-41 минуты, полученных после обработки гидразоном выделяется пептид 5380 Д - предполагаемый фрагмент Inducible serine protease inhibitor 1, которого нет в соответствующей фракции, полученной после обработки НДМГ.
Известно, что биотрансформация гидразина и его производных протекает в печени и кишечнике с участием цитохрома Р450 и флавинсодержащих моноок— сигеназ с образованием диазометана, метил-радикала и ионов метил-диазония [245]. Антибактериальные пептиды, полученные после такого эксперимента с НДМГ, отличаются наличием модификаций, представляющих собой увеличение массы пептидов на 14 Д, наблюдаемое масс-спектрометрически. Мы предполагаем, что протекает метилирование по остаткам глутаминовых и аспараги-новых кислот (D, Е) и С-концевым аминокислотам, которое, по-видимому, происходит в процессе метаболизма НДМГ. Это предположение связано с первичными структурами пептидов, так как наблюдается зависимость между количеством мест метилирования (D, Е) и числом модификаций одного антибактериального пептида.
В литературе есть примеры изучения молекулярного действия НДМГ на белки и пептиды с использованием спектрофотометрических методов. По результатам исследования, проводимого на крови крыс, установили, что НДМГ вызывает окислительные модификации белков и увеличение количества низкомолекулярных пептидов [245]. Однако спектрометрические методы не позволяют измерять массу и ее изменение. Наше исследование отчасти подтвердило и расширило эти литературные данные. При введении высокой концентрации НДМГ (1 %) масс-спектрометрически детектировано, кроме известных антибактериальных пептидов, большое количество пептидов в диапазоне масс 1-3 кД, которые, по-видимому, образовались в результате окислительно-восстановительной деструкции (методика № 3 (А), режимы градиентного элюирования № 2, № 3). При введении более низких концентрации количество низкомолекулярных пептидов уменьшилось. Кроме того первичная структура антимикробных пептидов позволяет говорить о характере модификации: метилирование, а не окисление (увеличение массы на 14-15 Д, а не 16) (рис. ЗО1) и отсутствие в первичной структуре аминокислот, по которым возможно окисление (метионин М, гистидин Н, триптофан W).
Пептиды 1627, 3485, 1822, 2076, 6320, 9188 Д детектированы также как пептидные продукты при обработке B.cereus и E.coli. Здесь 1627 Д - Cecropin-D-like peptide (1-13), 1822 Д - Proline-rich antimicrobial peptide 2 (8-23), 2076 Д -Cecropin-D-like peptide (1-17) - фрагменты известных антимикробных пептидов, а 3485, 6320 и 9188 Д - индуцированные пептиды, не описанные ранее.
Антибактериальные пептидные продукты, полученные после обработки B.cereus и E.coli
Хроматографические фракции, полученные после ОФ ВЭЖХ пептид-содержащей надосадочной жидкости, полученной по методу 1 (А) в режиме градиентного элюирования № 1 были проанализированы масс-спектрометрически. По данным такого анализа интерес представляли две фракции, содержащие смесь пептидов (№ 6 и № 7).
Масс-спектрометрический анализ фракции № 6 позволил идентифицировать фрагменты антимикробных пептидов: 1651 Д - Cecropin-D-like peptide (21-36), 2134 Д - Apolipophorin-3, 2933, 3035 Д - Proline-rich antimicrobial peptide 1 (рис. 32) и индуцированные пептиды - 4897, 4969 Д (не представлены на рисунке).
В составе фракции № 7 (рис. 33) обнаружены антибактериальные пептиды Galleria defensin, Lebocin-like anionic peptide 1, Anionic antimicrobial peptide 2,
Proline-rich antimicrobial peptide 2 и гликопротеин 27 кД hemolymph protein precursor (не представлен на рисунке).
Групповой характер элюирования пептидов связан с резким наклоном градиента и, вероятно, обусловлен межмолекулярными взаимодействиями антибактериальных пептидов.
При разделении пептидной смеси, полученной по методу № 1 (Б), в условиях градиентного элюирования № 4 идентифицированы антимикробные пептиды и их фрагменты. Результаты идентификации и данные об их антибактериальной активности представлены в таблице 21.
Физико-химическая характеристика пептидов на основе масс-спектрометрических данных. МС/МС спектры
Масс-спектрометрия позволяет получать информацию о массовых числах молекулярных ионов пептидов. Однако в сложных пептидных смесях возможно присутствие двух различных пептидов, имеющих одинаковый молекулярный вес. Поэтому для того, чтобы иметь возможность их различать, необходимо получать МС/МС спектры, которые очень характеристичны и позволяют по основным ионам идентифицировать пептиды, даже не зная их первичных структур. Таким образом, информация о молекулярной массе, времени удерживания и МС/МС масс-спектр однозначно характеризуют биомолекулу и позволяют при изменении условий пробоподготовки, разделения идентифицировать пептиды с высокой надежностью. Кроме того, при наличии нескольких характеристичных ионов в масс-спектрах с разными массами молекулярных ионов можно сделать вывод о том, что один пептид имеет общее происхождение с другим, т. е. пептид меньшей массы является фрагментом пептида большей массы (см. раздел 3.4.3).
Масс-спектр пептида Apolipophorin-З характеризуется присутствием, наряду с пиком однозарядного молекулярного иона, пиков двух- и трехзарядных катионов 9036 [М+2Н]2+, 6024 [М+ЗН]3+ (рис. 68 А). Однако по результатам экспериментальных данных в масс-спектре, полученном в режиме рефлектрона (рис. 68 Б), интенсивность пика молекулярного иона мала или он отсутствует вообще, в то время как двухзарядный катионы 9036 [М+2ЕҐ] наблюдается с высокой интенсивностью. Информация о двух и трехзарядных катионах увеличивает надежность идентификации данного пептида Apolipophorin-З в исследуемых пептидных смесях, поскольку известно, что они могут содержать пептид Seroin близкий по массе 18088 Д, который отличить от пептида с массой 18075 Д при получении масс-спектра в линейном режиме невозможно.
Следует отметить, что пик молекулярного иона пептида 27 kDa hemolymph protein precursor даже в линейном режиме наблюдается с малой интенсивностью и с большой ошибкой в массе, однако его двухзарядный ион 11883 [М+2Н]2+ наблюдается практически всегда и является характерным признаком для его идентификации.
Представляет интерес масс-спектрометрическое изучение пептида с массой 3478 Д, обладающего антибактериальными свойствами (табл. 20, 23, 24, см. стр. 114, 119, 120). Пептид имеет интенсивные сигналы в режиме рефлектрона одно- и двухзарядных катионов. Использование задержки экстракции 250 не позволило получить его изотопное распределение, характеризующееся наличием масс от 3478 до 3485 Д, где 3478 Д - моноизотопная масса пептида (рис. 69). Совокупность этих и хроматографических данных (время удерживания пептида в условиях ОФ ВЭЖХ независимо от используемого хроматографического режима меньше, чем у всех остальных исследуемых антимикробных пептидов) позволяет надежно идентифицировать данный пептид в составе пептидных смесей.
К характерным особенностям антибактериальных пептидов можно отнести образование димеров и ассоциатов друг с другом, наблюдаемых масс-спектрометрически (рис. 704), которые стабильны в условиях катионообменной гель-проникающей хроматографии (рис. 13, см. стр. 76, 103). Подтвердить образование ассоциатов удалось с помощью МС/МС масс-спектров (рис. 37, 39). Из них видно, что их фрагментация подобна фрагментации индивидуальных пептидов, составляющих ассоциаты.
На основе масс-спектрометрических данных МС/МС получены предполагаемые аминокислотные последовательности не описанных ранее пептидов в составе антибактериальных фракций (см. раздел 3.4.7). Важной характеристикой, подтверждающей достоверность их идентификации, является наличие зависимости порядка элюирования от гидрофобности, рассчитанной для полученных последовательностей аминокислот. Так, для процесса разделения пептидов № 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 18 из таблицы 28 (подготовленных по методу № 1 (Б)) в условиях режима № 3, получена корреляционная зависимость у = 1.7959х - 0.2683 (рис. 71) логарифма фактора удерживания от рассчитанного с помощью модели SSRCalc логарифма относительной гидрофобности, log Р.
Другой пример структурно похожих пептидов представлен на рисунке 73. По основным характеристическим ионам, опираясь на соотношение интенсив-ностей и расстояние между ионами, из МС/МС масс-спектров удалось выяснить, что пептид с массой 4038 Д образовался после триптического гидролиза пептидов с антибактериальными свойствами 4897 и 4967 Д. Это произошло путем отщепления фрагмента с массой 859 (929) Д предположительно с одного конца пептида при разрыве пептидной связи с аргинином или лизином.
Таким образом, масс-спектр - это важная физико-химическая характеристика пептидов, поскольку он позволяет получать и использовать информацию о молекулярных ионах, о многозарядных ионах, об изотопном распределении, об образовании ассоциатов, о вторичных ионах, которые образуются в условиях тандемной масс-спектрометрии, в силу того, что пептидная связь разрывается определенным образом, что можно успешно применять для установления первичной структуры пептидов.
