Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Природные антиоксиданты и их взаимодействие со свободными радикалами 15
1.1. Теория свободнорадикального цепного окисления. Понятие об антиоксидантах 15
1.2. Классификация антиоксидантов растительного происхождения 21
1.3. Роль антиоксидантов растительного происхождения в жизнедеятельности человека 25
1.4. Механизмы действия и физико-химические свойства антирадикальных антиоксидантов 26
1.5. Общая характеристика методов определения антиоксидантных свойств веществ 31
1.5.1. Прямые методы 33
1.5.2. Непрямые методы 37
1.6. Свойства стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила и его применение в исследованиях антиоксидантов 42
1.6.1. Химическое строение и физические свойства 42
1.6.2. Химические свойства и механизмы взаимодействия с антиоксидантами 43
1.6.3. Применение 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила для исследования антирадикальных свойств природных соединений 50
ГЛАВА II. Объекты и методы исследований 56
2.1. Объекты исследований 56
2.2. Методы исследований 59
2.2.1. УФ-спектроскопические исследования 59
2.2.2. Независимые аналитические методы сравнения 63
2.2.3. Расчёт энтальпии диссоциации ОН-связи фенольных антиоксидантов 67
2.2.4. Математическая обработка данных 68
ГЛАВА III. Стандартизация экстрактов пищевых и лекарственных растений по концентрации антиоксидантов 69
3.1. Стандартизация экстрактов пищевых и лекарственных растений по концентрации веществ, активных в отношении 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила 69
3.2. Сравнительные испытания спектрофотометрического и амперометрического методов количественного анализа антиоксидантов 74
ГЛАВА IV. Изучение кинетики взаимодействия 2,2-дифенил- 1-пикрилгидразила с низкомолекулярными антиоксидантами растительного происхождения 77
4.1. Кинетические эффекты реакционной среды при взаимодействии 2,2- дифенил-1-пикрилгидразила с антиоксидантами растительного происхождения 77
4.1.1. Влияние концентрации соляной кислоты в реакционной среде (этанол) на скорость реакции 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила с индивидуальными фенольными антиоксидантами 77
4.1.2. Влияние силы и концентрации спиртовых растворов кислот на кинетику взаимодействия 2,2-дифенил-1 -пикрилгидразила с экстрактивными веществами растений 81
4.1.3. Сравнительный анализ кинетики взаимодействия 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила с экстрактивными веществами растений в среде спиртового раствора хлороводорода и 1,4-диоксана 90
4.2. Выбор оптимальной реакционной среды для кинетических исследований 93
4.3. Взаимосвязь структуры и активности фенольных антиоксидантов в отношении ДФПГ 95
4.4. Разработка кинетического метода анализа антирадикальной активности экстрактов растений 103
4.4.1. Выбор кинетического параметра для сравнительной характеристики антирадикальной активности экстрактов растений 103
4.4.2. Компьютерная обработка графических данных 106
4.4.3. Сравнительное тестирование антирадикальной активности экстрактов пищевых и лекарственных растений 108
Выводы 113
Список литературы 116
- Общая характеристика методов определения антиоксидантных свойств веществ
- Независимые аналитические методы сравнения
- Сравнительные испытания спектрофотометрического и амперометрического методов количественного анализа антиоксидантов
- Сравнительный анализ кинетики взаимодействия 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила с экстрактивными веществами растений в среде спиртового раствора хлороводорода и 1,4-диоксана
Введение к работе
Актуальность темы. Антиоксиданты (АО), как вещества, предотвращающие зарождение и развитие свободнорадикальных процессов окисления, нашли широкое применение в химической, пищевой, косметической, фармацевтической промышленности, медицине и сельском хозяйстве; они являются неотъемлемой составной частью всех биологических систем. Свободные радикалы и реакции с их участием играют важную роль в этиологии и патогенезе многих заболеваний человека, а также в старении организма в целом.
Важнейшим источником природных АО являются лекарственные и пищевые растения. При этом значительный интерес представляет исследование антиоксидантных свойств не только веществ, выделенных в химически чистом виде, но и неочищенных растительных экстрактов, содержащих в своем составе сотни и тысячи компонентов, поскольку их суммарная антиоксидантная активность и другие полезные свойства часто превосходят таковые индивидуальных соединений (синергизм антиоксидантов).
В литературе предлагается большое число методов анализа количества и активности антиоксидантов в различных объектах. Эти методы основаны на разных модельных системах, зачастую недостаточно изученных. Вопрос о сопоставимости получаемых разными методами результатах во многих случаях остается открытым. Поэтому углубленное изучение существующих модельных реакций и поиск новых подходов к определению антиоксидантов и их активности является весьма актуальной задачей.
Прямые методы оценки антиоксидантной активности (АОА) как индивидуальных химических соединений, так и композиций сложного состава основаны на изучении влияния антиоксидантов на кинетику модельных реакций окисления углеводородов, жирных кислот или биологических материалов, либо на конкуренции изучаемого и модельного АО за радикалы. На практике, однако, очень часто пользуются непрямыми методами, с помощью которых определяются параметры, коррелирующие с антиокислительной активностью антирадикальных антиоксидантов. К их числу относится метод, основанный на взаимодействии АО со стабильным хромоген-радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (ДФПГ). К его достоинствам относятся высокая воспроизводимость, простота выполняемых операций, общедоступность необходимого оборудования, высокая чувствительность, высокая селективность по отношению к антирадикальным АО. В экстрактах растений содержание веществ, взаимодействующих с ДФПГ, хорошо коррелирует с концентрацией фенольных соединений, что указывает на доминирующую роль последних в суммарной активности растительных экстрактов в отношении этого радикала.
Однако до сих пор не был разработан метод определения суммарной эффективной реакционной способности экстрактивных веществ растений в отношении стабильного радикала ДФПГ, полностью отвечающий правилам
химической кинетики. Это связано, в частности, с тем, что почти во всех органических растворителях реакция протекает с большой скоростью, что затрудняет кинетические исследования. Не до конца изучен механизм взаимодействия ДФПГ с антирадикальными АО. Имеющиеся в литературе данные о взаимосвязи химического строения АО и их активности в отношении ДФПГ, на основании которых можно было бы сделать важное заключение о степени сопоставимости этой активности со способностью АО ингибировать реакции цепного перекисного окисления липидов, ведомые алкилперекисными радикалами, основаны на использовании весьма произвольных кинетических параметров.
Цель работы: развитие теории и практики применения стабильного хромоген-радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила для определения количества и активности низкомолекулярных антиоксидантов растительного происхождения. Создание методики кинетического анализа суммарной антирадикальной активности антиоксидантов в экстрактах пищевых и лекарственных растений.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
уточнить и усовершенствовать методику количественного анализа АО в экстрактах растений по их взаимодействию с радикалом ДФПГ;
подобрать оптимальные условия проведения реакции АО растительного происхождения с радикалом ДФПГ для анализа их антирадикальной активности;
выбрать и теоретически обосновать наиболее адекватный кинетический параметр для сравнительного анализа антирадикальной активности экстрактов пищевых и лекарственных растений;
выявить корреляции химической активности фенольных АО в отношении радикала ДФПГ со строением и термодинамическими параметрами их молекул;
уточнить механизм реакции фенольных АО со стабильным радикалом ДФПГ;
провести оценку количества и активности антиоксидантов в экстрактах некоторых пищевых и лекарственных растений и сравнить данные, получаемые с использованием радикала ДФПГ, с результатами, даваемыми другими методами.
Научная новизна:
впервые разработан кинетический метод анализа антирадикальной активности экстрактов пищевых и лекарственных растений по их реакции со стабильным радикалом ДФПГ, соответствующий правилам классической химической кинетики;
выявлено, что зависимость глубины превращения ДФПГ при взаимодействии с АО экстрактов растений по окончании эксперимента (30 мин от момента смешивания реагентов) от начальной концентрации АО в
реакционной системе носит линейный характер, независимо от вида экстракта, в интервале глубин превращения ДФПГ от 0 до 60%, что позволяет производить экстерполяцию и интерполяцию результатов при количественном определении АО; учитывать поздние (медленные) стадии реакции путем увеличения времени реакции свыше 30 мин не целесообразно;
установлено, что при использовании этанола в качестве реакционной среды введение кислоты существенно тормозит реакции стабильного радикала ДФПГ с экстрактивными веществами пищевых и лекарственных растений. Степень торможения находится в прямой зависимости от силы вводимой кислоты;
определены значения концентрации НС1 в реакционной среде (этанол), при которых достигается минимум скорости реакции АО экстрактов пищевых и лекарственных растений, а также некоторых индивидуальных фенольных АО, с ДФПГ и, соответственно, максимально подавляется протекание процесса по механизму SPLET (с. 8, формула 2), что позволяет нивелировать влияние на кинетику реакции органических кислот, содержащихся в экстрактах растений;
- установлено, что с увеличением концентрации НС1 в реакционной
среде (этанол) скорость реакции ДФПГ с фенольными АО растительного
происхождения, после достижения минимума, начинает возрастать, что
может быть объяснено осуществлением ионного механизма реакции
параллельно как по схеме SPLET, так и по схеме ЕТ - РТ (с. 8, формула 3).
Это устраняет противоречия, имеющиеся между публикациями ряда
исследователей;
установлено, что высокой химической активностью в отношении радикала ДФПГ в среде 0,1 мМ раствора НС1 в этаноле обладают только фенольные АО, имеющие в своей структуре о/шо-диоксигруппу в ароматическом кольце, т.е. наблюдаются те же закономерности, что и при взаимодействии фенольных АО с алкилперекисными радикалами. При этом логарифмы констант скорости взаимодействия фенольных АО с ДФПГ линейно убывают с возрастанием значений расчетной энтальпии диссоциации фенольных ОН-групп антиоксидантов;
установлено, что данные о количестве антиоксидантов в экстрактах растений, получаемые с помощью наблюдения за их реакцией с ДФПГ, хорошо коррелируют (коэффициент корреляции 7^0,95) с результатами амперометрического количественного анализа АО.
Практическая значимость работы
Разработанный кинетический экспресс-метод анализа антирадикальной активности экстрактов растений может быть использован в научно-исследовательской практике, а так же в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности для сравнительной оценки антирадикальных свойств продукции растительного происхождения и контроля ее качества.
Выявление характера зависимости глубины превращения ДФПГ в
избранных стандартных условиях проведения реакции его взаимодействия с
АО экстрактов растений от начальной концентрации АО в реакционной
системе дает возможность с большей точностью проводить количественный
анализ антирадикальных АО;
. Полученные данные о влиянии реакционной среды на скорость взаимодействия АО экстрактов растений со стабильным радикалом ДФПГ позволяют подобрать условия проведения реакции, при которых возможно наблюдение за процессом, начиная с малых глубин превращения, без использования специального оборудования для изучения кинетики быстрых реакций.
Результаты, свидетельствующие о наличии сходных соотношений структуры и реакционной способности АО в отношении радикала ДФПГ и алкилперекисных радикалов, позволяют в первом приближении производить относительную оценку их активности при ингибировании цепных свободнорадикальных окислительных процессов.
Установленная корреляция между спектрофотометрическим и амперометрическим методами количественного анализа АО дает возможность проводить прямое сопоставление результатов, полученных этими методами.
Достоверность разработанных научных положений и сформулированных выводов обеспечена корреляцией полученных экспериментальных результатов с теоретическими, хорошей сопоставимостью с литературными данными, получением согласованных результатов сравнительных определений спектрофотометрического метода, основанного на взаимодействии АО с радикалом ДФПГ, с независимыми аналитическими электрохимическими и кинетическими методами.
На защиту выносится:
Кинетический метод анализа суммарной антирадикальной активности АО экстрактов пищевых и лекарственных растений.
Условия проведения анализа суммарной антиоксидантной емкости экстрактов растений по взаимодействию их АО со стабильным радикалом ДФПГ и установленная корреляция получаемых величин с данными амперометрии.
Характер зависимости скорости реакции ДФПГ с индивидуальными фенольными АО природного происхождения, а также АО экстрактов пищевых и лекарственных растений, от реакционной среды и обоснование полученных закономерностей с точки зрения предполагаемого механизма реакции.
Установленная корреляция между реакционной способностью фенольных АО растительного происхождения в отношении синтетического стабильного радикала ДФПГ и алкилперекисных радикалов.
5. Взаимосвязь между реакционной способностью фенольных АО в отношении радикала ДФПГ и их химической структурой, а также величиной расчетной энтальпии диссоциации фенольных ОН-групп.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на следующих научных конференциях: VII Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 25 - 26 октября 2006 г.; III Всероссийской конференции молодых ученых «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты», Москва, 1-3 октября 2008 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Исследования и достижения в области теоретической и прикладной химии», Барнаул, 24-26 сентября 2008 г.; VIII и IX Международных молодежных конференциях «Биохимическая физика» ИБХФ РАН - ВУЗы, Москва, 2008 - 2009 г.г.; XIII - XVI Региональных Каргинских чтениях, Тверь, 2006 - 2009 г.г.; конференции студентов и аспирантов Учебно-научного центра по химии и физике полимеров и тонких органических пленок (г. Дубна, 1-3 апреля 2002 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ (из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования результатов диссертационных работ в области химических наук), список которых приведен в автореферате.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 199 наименований, изложена на 137 страницах текста, содержит 10 таблиц, 36 рисунков.
Общая характеристика методов определения антиоксидантных свойств веществ
Антиоксидантные свойства индивидуальных АО характеризуются двумя параметрами: антиоксидантной активностью (см. раздел 1.1) и антиоксидантной емкостью (число цепей окисления, которое способна оборвать 1 молекула АО). Антиоксидантная емкость вещества (стехиометрия) зависит не только от его химического строения, но и от используемого модельного процесса и условий его осуществления [87]. При исследовании сложных объектов антиоксидантная емкость характеризует число цепей окисления, обрываемое суммой всех веществ-АО, содержащихся в исследуемом образце. Часто ее пересчитывают на стехиометрию какого-либо модельного АО (кверцетин, рутин, аскорбиновая кислота, ионол, тролокс) и выражают единицах концентрации этого АО. Определяемые в этом случае антиоксидантная и антирадикальная активность являются эффективными параметрами, определяемыми активностью и относительной концентрацией каждого из индивидуальных АО в образце, а часто - и их взаимодействием (синергизм АО) [1;88]. Прямые методы определения антиоксидантной емкости и активности АО основываются на наблюдении модельных реакций окисления углеводородов, жирных кислот или биологических материалов, либо на конкуренции исследуемого и модельного АО за радикалы. Реакционная среда может быть гомогенной или микрогетерогенной (мицеллы, липосомы) [89-90]. Использование гомогенных систем более предпочтительно, поскольку в гетерогенных системах определяемые кинетические параметры взаимодействия АО с радикалами зависят также от ряда физических факторов, обусловленных процессами на границе раздела фаз и различием в характеристиках взаимодействия между молекулами АО и среды в гидрофильной и гидрофобной фазах [91]. Введение в такую модельную систему антиоксиданта вызывает уменьшение концентрации свободных радикалов, что отражается на параметрах детектирующей системы. При исследовании АОА чистых веществ математическая обработка получаемых кинетических кривых позволяет вычислить не только численные параметры, являющиеся брутто-характеристикой эффективности ингибирования процесса в целом, но и, во многих случаях, константы скорости элементарных стадий. В работе [1] сформулированы основные требования, предъявляемые к методам определения антиоксидантных свойств объектов, употребляемых в пищу: 1.
Очевидный физический смысл определяемого параметра. При этом должны быть известны в деталях все химические процессы, протекающие в реакционной системе. 2. Воспроизводимость экспериментальных данных не только в рамках одной работы, но и в условиях разных лабораторий. Для достижения этой воспроизводимости тестовая система должна быть сравнительно простой и с использованием доступных реактивов, а результаты исследований не должны быть слишком чувствительны к изменениям условий проведения реакции. 3. Возможность наблюдения за ходом процесса автоматизированным способом. 4. Достаточная экспрессность, позволяющая проводить большое количество измерений. 5. Относительная простота выполняемых экспериментальных процедур. Методы определения АРА и восстановительной активности объекта часто более просты в исполнении и экспрессны, чем методы определения АОА. Кроме того, в объектах растительного происхождения содержатся вещества, мешающие определению суммарной емкости и активности содержащихся в них АО по результатам наблюдения модельных реакций (липиды, особенно ненасыщенные; диоксетаны). Однако, с интерпретацией результатов, получаемых с помощью непрямых методов, следует проявлять осторожность. Необходимо в таких случаях выявление корреляций химической структуры веществ с определяемыми величинами их радикальной и восстановительной активности и сопоставление полученных результатов с данными по АОА этих веществ. Прибор для измерения сверхслабых свечений - хемилюминометр -был изобретен в 1961 году и впоследствии был предложен для исследования АО [92].
Поскольку рекомбинация свободных радикалов сопровождается образованием ЭВС, введение специальных веществ (хелат европия (Еи3+ -1,10 фенантролин-трис (теноил-трифторацетонат), 9,10 - дибромантрацен), повышающих квантовый выход люминесценции, позволяет регистрировать интенсивность свечения и его изменения во времени. Если в качестве модельной реакции используется цепное инициированное окисление углеводорода (например, кумол, этилбензол и т.д.), основной вклад в хемилюминесценцию дает рекомбинация алкилперикисных радикалов, концентрация которых и скорость процесса в целом прямопропорциональны квадратному корню их интенсивности сверхслабого свечения. Введение ингибитора приводит к снижению интенсивности хемилюминесценции на отрезке времени, в течении которого расходуется введенный ингибитор. Этот отрезок времени называется периодом индукции. Метод позволяет определять как количество антиоксиданта, введенного в реакционную систему, так и константу скорости его взаимодействия с алкилперикисными радикалами. Серьезным препятствием на пути использования хемилюминесцентного метода для анализа антиоксидантных свойств экстрактов растений является наличие в них, наряду с АО, легкоокисляемых субстратов, а также 1,2-диоксетанов, образующихся при окислении
Независимые аналитические методы сравнения
Независимым методом сравнения при анализе количественного содержания низкомолекулярных АО в экстрактах растений по их взаимодействию с радикалом ДФПГ был амперометрический метод, основанный на электрохимическом окислении АО на аноде из стеклоуглерода при значении потенциала 1,3 В. Амперометрическая установка ЦветЯуза-01-АА (НПО «Химавтоматика») представляет собой электрохимическую ячейку со стеклоуглеродным анодом и катодом из нержавеющей стали, к которым приложена разность потенциалов 1,3 В [119]. Блок-схема прибора изображена на рис. 2.1. Анализируемая проба с помощью шестиходового крана-дозатора с объемом петли 20 мкл вводится в поток элюента (2,2-10" М водный раствор ортофосфорной кислоты), прокачиваемый насосом через электрохимическую ячейку со скоростью 1,2 мл/мин. При прохождении пробы через ячейку регистрируется ток электрохимического окисления АО, развертка которого во времени выводится на монитор компьютера. Предварительно строили градуировочную зависимость сигнала (площади под амперометрической кривой) образца сравнения, в качестве которого был использован кверцетин, от его концентрации. На рис. 2.2 изображена серия из пяти таких амперометрических кривых для раствора кверцетина одной и той же концентрации. Площади под каждой из них после подсчета усреднялись и полученная величина наносилась на график в виде точки, соответствующей раствору кверцетина данной концентрации, как показано нарис. 2.3. Серия растворов кверцетина возрастающей концентрации для калибровки прибора готовилась следующим образом.
Взвешивали 0,05 г кверцетина, приливали 30 мл дистиллированной воды и подщелачивали раствором NaOH молярной концентрациии 0,1 моль/л до растворения кверцетина (рН 9,5±0,2). После растворения кверцетина объем раствора доводили до 50 мл и отбирали аликвоту, которую разбавляли в 10 раз дистиллированной водой. Полученный раствор снова разбавляли дистиллированной водой в 500; 200; 100; 50 и 25 раз для получения 5 концентраций кверцетина: 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 и 4,0 мг/л (0,66; 1,65; 3,3; 6,6; 13,2 мкМ). Зная площадь под кривой, даваемой исследуемым экстрактом в пределах диапазона градуировки, можно определить в нем содержание АО в пересчете на кверцетин и, соответственно, содержание АО в тканях исследуемого растения (в мг/г или мкмоль/г): где S - площадь под амперометрической кривой исследуемого образца, нА-с; So - площадь под амперометрической кривой кверцетина, нА-с; Со концентрация раствора кверцетина, мг/мл или мкмоль/мл; К — коэффициент разбавления анализируемого экстракта перед введением в прибор, V3KCmp -объем полученного экстракта, мл; т - масса навески анализируемого образца в граммах, взятой для приготовления экстракта в объеме V3KCmp. Коэффициент разбавления исходных экстрактов растений при приготовлении образцов для введения в прибор варьировал от 50 до 200. Метод не требует использования модельной реакции, а время измерения одного образца составляет 10 - 15 мин при наличии градуировочной прямой. Корреляции «структура АО - реакционная способность в отношении ДФПГ» сопоставлялись с таковыми при взаимодействии этих же АО с алкилперекисными радикалами, константы взаимодействия с которыми были рассчитаны И. Тихоновым, В. Рогинским и др. [77] по кривым поглощения кислорода, определяемого волюмометрически в замкнутой модельной системе инициированного AMVN окисления стирола при (37±0,1)С.
Подробно суть этого метода и методика расчета кинетических параметров изложены в главе 1 Расчет энтальпии диссоциации ОН-связей фенольных АО производился в соответствии с аддитивной схемой, предложенной [14] на основе квантовохимических расчетов методом функционала плотности с помощью программного пакета GAUSSIAN 98. Суть этой схемы состоит в том, что к величине расчетной энтальпии диссоциации ОН-связи фенола (364,9 кДж/моль) прибавляются инкременты заместителей, величина которых зависит от природы заместителей и их положения относительно рассматриваемой ОН-группы. Значения инкрементов, использованных в данной работе, приведены в табл. 2.2 и 2.3. Кислородсодержащие функциональные группы в орто-иояожепии по отношению к фенольной ОН-группе могут образовывать с последней внутримолекулярную водородную связь (ВВС). Разность энергий ВВС исходного фенольного АО и феноксильного радикала дает дополнительный вклад в инкремент такой функциональной группы. Однако при наличии заместителей в обоих орто-пояожениях фенольная ОН-группа может образовывать ВВС только с одним из них. Данное обстоятельство должно приниматься во внимание при расчетах (для второго ор/ио-заместителя учитывается только вклад электронных эффектов).
Сравнительные испытания спектрофотометрического и амперометрического методов количественного анализа антиоксидантов
В качестве независимого метода оценки концентрации АО в пищевых и лекарственных растениях был использован амперометрический метод. Определение содержания АО в анализируемых образцах в пересчете на стехиометрию кверцетина производилось в соответствии с формулами (3.3 -3.5). В таблице 3.3 представлены сравнительные данные определения концентрации АО в образцах 14 пищевых и лекарственных растений с помощью метода, основанного на их взаимодействии с ДФПГ, и метода амперометрии [186]. Те же данные представлены на корреляционнаой диаграмме (рис. 3.4.), из которой очевидно, что методы дают хорошо сопоставимые результаты (г=0,95). Тангенс угла наклона линии регрессии равен 0,72±0,06, что означает, что метод, основанный на взаимодействии АО с ДФПГ, дает результаты, превосходящие таковые, получаемые амперометрическим методом, в среднем в 1,4±0,1 раза. Исключение составляют лук и чеснок, при анализе содержания АО в экстрактах которых амперометрический метод демонстрирует результаты, приблизительно на порядок превышающие таковые по взаимодействию с ДФПГ. При сравнении концентрации АО в различных растениях между собой такое сравнение необходимо производить отдельно для высушенных лекарственных трав и чая и отдельно для остальных образцов, поскольку значительно меньшее содержание в них АО на единицу массы объясняется сильной обводненностью тканей. Среди высушенных образцов наибольшая концентрация АО обнаружена в зверобое, что подтверждено обоими используемыми методами. Среди сырых фруктов и овощей наибольшая концентрация АО отмечается в красном винограде, превосходя таковую в плодах цитрусовых и в яблоках в 4 раза по результатам метода, основанного на использовании ДФПГ ив 1,3-3 раза - по методу амперометрии. Высокая концентрация АО в чесноке, обнаружения методом амперометрии, не подтверждается методом ДФПГ. Очень низкий, по данным метода ДФПГ, уровень концентрации АО в луковицах лука, не подтверждается амперометрическим методом. Как уже отмечалось, радикал ДФПГ в большинстве реакционных сред взаимодействует со многими фенольными АО с большой скоростью, что не позволяет регистрировать кинетическую кривую с малых глубин его превращения без использования специального оборудования для исследования кинетики быстрых химических процессов.
Данный факт наглядно иллюстрирует рис. 4.1: кинетическую кривую убывания оптической плотности ДФПГ в ходе его взаимодействия с галловой кислотой, взятой в избытке по отношению к радикалу, спектрофотометр "Specord М40"начинает регистрировать тогда, когда ДФПГ практически весь израсходовался за первые секунды реакции. Введение кислоты в реакционную среду оказывает существенное влияние на кинетические параметры взаимодействия фенольных АО со стабильным радикалом ДФПГ. На рис. 4.2 представлены кинетические кривые падения оптической плотности ДФПГ на длине волны 517 нм в ходе взаимодействия с галловой кислотой в спиртовом растворе НС1 различной концентрации. Кислота резко замедляет процесс, причем наибольшее замедление наблюдается при концентрации НС1 0,07 мМ, а кинетику расходования ДФПГ возможно наблюдать начиная с малых глубин превращения реагентов. На рис. 4.3 - 4.5 показаны зависимости начальной скорости расходования ДФПГ при взаимодействии с 5 фенольными АО от концентрации НС1 в реакционной среде (этанол). На этих рисунках видно, что в диапазоне концентраций НС1 в этаноле от 0 до (0,02 - ОД) мМ скорость расходования ДФПГ монотонно снижается, после чего вновь возрастает. Снижение скорости процесса при введении в реакционную среду микроколичеств НС1 подтверждает, что механизм SPLET (см. гл. 1) действительно реализуется. Благодаря наличию неподеленных электронных пар на атоме кислорода этилового спирта молекулы фенольного АО могут диссоциировать, отдавая протон молекуле растворителя и превращаясь в фенолят-анионы, вследствие чего в данной реакционной среде высока скорость протекания реакции по механизму SPLET. Кислота резко замедляет протекание процесса по механизму SPLET, так как повышение концентрации протонированных молекул растворителя (solv) вследствие введения сильной кислоты приводит к резкому смещению равновесия в сторону недиссоциированных молекул фенольного АО: Увеличение скорости реакции при дальнейшем повышении концентрации НС1 указывает, что, параллельно с механизмом SPLET, процесс протекает еще как минимум по одному механизму, чувствительному к концентрации кислоты. Скорость расходования ДФПГ по механизму HAT (чисто радикальному, без образования ионов и переноса заряда), может убывать, но не возрастать с увеличением концентрации НС1, сопровождающимся ростом диэлектрической проницаемости среды. С другой стороны, последнее может способствовать разделению ионных пар при протекании реакции по механизму ЕТ — РТ, ингибируя обратный процесс, что сопровождается увеличением скорости расходования ДФПГ и служит подтверждением реализации этого механизма параллельно со SPLET. 10"5М эпикатехином (а) и 7,5-10"6 М кверцетином (б) при введении в реакционную среду (этанол) хлороводородной кислоты в различной концентрации растений в среде этанола в присутствии кислот получены результаты, сходные с таковыми для индивидуальных фенольных АО.
Введение уксусной кислоты в реакционную смесь вызывает резкое падение скорости реакции [187-189]. Рис. 4.6 демонстрирует, что наиболее медленное снижение концентрации ДФПГ в реакционной системе при взаимодействии с АО зверобоя продырявленного наблюдается при концентрациях уксусной кислоты 10 и 50 мМ. Минимум скорости реакции при концентрации уксусной кислоты 50 мМ обнаружен и при исследовании взаимодействия ДФПГ с АО экстрактов пижмы обыкновенной и тысячелистника обыкновенного, что демонстрируют кривые на рис. 4.7, выражающие зависимость начальной скорости расходования ДФПГ при взаимодействии с АО экстрактов трех вышеназванных растений от концентрации уксусной кислоты в реакционной системе. Кинетические кривые, приведенные на рис. 4.8, демонстрируют, что если в среде этанола без добавления кислоты регистрация кривых с помощью используемого в данной работе оборудования начинается на поздних стадиях процесса из-за его высокой скорости, особенно в случае взаимодействия ДФПГ с АО экстрактов пижмы и тысячелистника (кривые 2 и 3), как и в случае реакции ДФПГ с индивидуальными фенольными АО, то в присутствии 50 мМ уксусной кислоты не наблюдается такого резкого падения оптической плотности радикала в первые секунды реакции (кривые 2 и 30
Сравнительный анализ кинетики взаимодействия 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила с экстрактивными веществами растений в среде спиртового раствора хлороводорода и 1,4-диоксана
По данным экспериментов по изучению кинетики взаимодействия ДФПГ с некоторыми фенольными АО, описанных в литературе [125], 1,4-диоксан является органическим растворителем, в котором наблюдается замедление реакции по сравнению со всеми другими средами. Поскольку экстракция АО из образцов лекарственных растений осуществлялась этиловым спиртом, необходимо было проверить, влияет ли введение небольших его количеств (до 3 объемных процентов) в диоксан на скорость реакции ДФПГ с экстрактивными веществами растений в среде этого растворителя. 0,2 мл спиртового экстракта зверобоя выпарили под вакуумом и сухой остаток растворили в 4 мл диоксана. К 2,4 мл раствора ДФПГ в диоксане, имеющего оптическую плотность 0,93 на длине волны 517 нм, прилили 0,8 мл экстракта зверобоя в диоксане и 0,1 мл чистого диоксана и регистрировали кинетическую кривую падения оптической плотности реакционной системы. В параллельном опыте вместо 0,1 мл диоксана в систему вводили 0,1 мл этанола. В обоих случаях начальная скорость составила в среднем (7,9±0,6)-10"9 моль/л-с, то есть введение 3% этанола не оказывает заметного влияния на кинетику реакции стабильного радикала ДФПГ с экстрактивными веществами зверобоя в среде диоксана. Таким образом, аликвоты спиртовых экстрактов объемом до 3% от объема реакционной среды можно вводить непосредственно в диоксан, не занимаясь отгонкой спирта.
Кинетические эксперименты с экстрактами лекарственных растений продемонстрировали (табл. 4.1), что начальные скорости их реакций с ДФПГ в среде 1,4-диоксана близки по величине к таковым, полученным в среде 0,1 мМ НС1 в этаноле (реакции проводились при одинаковых начальных условиях). Исключение составил экстракт зверобоя, реакционная способность АО которого в диоксане оказалась на порядок ниже [192-193]. На рис. 4.17 и 4.18 представлены кинетические кривые падения оптической плотности радикала ДФПГ при взаимодействии с экстрактами пижмы обыкновенной (кривая 1), зверобоя продырявленного (кривая 2) и тысячелистника обыкновенного (кривая 3) в среде ОДмМ раствора НС1 в этаноле и диоксана соответственно, по которым были рассчитаны данные табл. 4.1. Динамика изменения спектра ДФПГ при взаимодействии с АО зверобоя продырявленного представлена на рис. 4.19. Спектр и характер его изменений (пики, при которых наблюдаются наибольшие изменения оптической плотности, положение изобестических точек) практически идентичны таковым на рис. 4.9, где была представлена динамика изменения спектра ДФПГ при взаимодействии с АО зверобоя продырявленного в 50 мМ раствора уксусной кислоты в этаноле. Однако эти изменения прогрессируют в среде диоксана значительно медленнее. Таким образом, в качестве реакционной среды для проведения кинетических исследований взаимодействия стабильного радикала ДФПГ с экстрактивными веществами пищевых и лекарственных растений наиболее целесообразно использовать ОД - 10,0 мМ раствор НС1 в этаноле. Данный выбор был сделан, исходя из следующего: 1) при извлечении природных антиоксидантов из растительного сырья в качестве экстрагента чаще всего применяется этанол; 2) введение сильной кислоты в реакционную систему нивелирует влияние на кинетику процесса органических кислот, содержащихся в экстрактах растений в разных концентрациях и имеющих разные значения рКа; 3) обеспечивается многократное по сравнению почти со всеми другими реакционными средами замедление процесса, который обычно протекает настолько быстро, что его наблюдение без применения специального оборудования для исследования кинетики быстрых реакций возможно только на поздних стадиях.
Это позволяет проводить кинетические расчеты с максимальной точностью. 4) относительно малая токсичность этанола по сравнению с другими органическими растворителями, что делает безопасным для здоровья персонала метод анализа антирадикальной активности антиоксидантов, разрабатываемый настоящей работе. В литературе имеются данные, что этиловый спирт может очень медленно взаимодействовать со стабильным радикалом ДФПГ [138]. Однако в опытах, проведенных автором настоящей работы, скорость убывания концентрации раствора ДФПГ в этаноле в присутствии 0,1 мМ НС1 составила 8-Ю-11 моль/л-с при концентрации радикала 5,8-10 5 М (рис. 4.20), в то время как скорость реакции ДФПГ с АО экстрактов растений в среде этанола во всех случаях превышала Ю-8 моль/л-с. Остается невыясненным, является ли это убывание следствием взаимодействия ДФПГ с этанолом либо с остающимися после его очистки следами загрязняющих примесей. Тем не менее, можно констатировать, что вклад данного явления при проведении кинетических экспериментов крайне незначителен и составляет менее 0,5% даже в случае реакции ДФПГ с веществами наименее активных в отношении этого радикала экстрактов в среде этанола в присутствии 0,1 мМ НС1. Для изучения взаимосвязи химического строения и антирадикальной активности фенольных АО были экспериментально получены константы скорости их взаимодействия с радикалом ДФПГ в среде 0,1 мМ раствора НС1 в этаноле [194]. В кювету спектрофотометра к раствору АО приливали раствор НС1 в спирте, а затем раствор ДФПГ, после чего систему быстро перемешивали и начинали запись кинетической кривой падения оптической плотности раствора ДФПГ ігри А = 517 нм. Концентрации и объемы вводимых в реакционную систему растворов подбирались таким образом, чтобы концентрация радикала в начальный момент реакции составляла 6,5-10"5 М, НС1 - 10 4 М, а концентрация АО варьировала в интервале от 6-Ю 4 М до 2,7-10"3 М (производилась запись серии из нескольких кинетических кривых при разных концентрациях АО в условиях псевдопервого порядка при 10-45-кратном избытке АО по отношению к ДФПГ). Примеры кинетических кривых падения оптической плотности стабильного радикала ДФПГ при взаимодействии с исследуемыми фенольными АО, по которым производились расчеты констант скорости, приведены на рис. 4.21 и 4.22.
