Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Теоретические подходы к описанию электропроводности растворов полиэлектролитов 10
1.1.1. Электропроводность растворов полиэлектролитов 10
1.1.2. Модель пористой сферы 14
1.1.3. Модель линейного заряда 17
1.1.4. Модель Маннинга 18
1.2. Влияние различных факторов на подвижность полииона 23
1.2.1. Влияние степени полимеризации 23
1.2.2. Влияние плотности заряда 27
1.2.3. Влияние ионной силы 36
1.2.4. Влияние гибкости цепи 39
1.3. Модификация модели Маннинга с помощью теории скейлинга для конформации полиэлектролитов 42
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 45
2.1. Материалы 45
2.1.1. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) 45
2.1.2. Синтетические полианионы 46
2.1.3. Синтетические поликатионы 48
2.1.4. Полипептиды и белки 50
2.1.5. Бромид этидия (БЭ) 51
2.2. Приборы и методики экспериментов 51
2.2.1. Кондуктометрические измерения 51
2.2.2. Потенциометрические измерения 52
2.2.3. Определение концентрации низкомолекулярных солей 53
2.2.4. Спектрофотометрические измерения 53
2.2.5. Приготовление растворов нестехиометричных полиэлектролитных комплексов (НПЭК) 53
2.2.6. Спектрофлуориметрические измерения 54
2.2.7. Измерения спектров кругового дихроизма (КД) 54
2.2.8. Седиментациоыные измерения 54
2.2.9. Молекулярное моделирование 55
ГЛАВА 3. Конформационные изменения ДНК и линейных синтетических полиэлектролитов в водных растворах 56
3.1. Применение теории полиэлектролитов Маннинга для оценки конформационных изменений полиэлектролитов в водных растворах 56
3.2. Термическая денатурация ДНК в водных растворах 60
3.3. Концентрационная денатурация ДНК в бессолевых растворах 68
3.4. Факторы, влияющие на конформацию полиионов в растворе 74
3.4.1. Влияние длины и жёсткости цепи 74
3.4.2. Влияние температуры 81
3.4.3. Влияние гидрофобных взаимодействий 83
3.4.4. Влияние плотности заряда на полиионе 86
3.4.5. Влияние распределения зарядов на полиионе 90
ГЛАВА 4. Конкурентные интерполиэлектролитные реакции в растворах полиэлектролитных комплексов с участием ДНК 102
4.1. Водорастворимые полиэлектролитные комплексы и интерполиэлектролитные реакции с их участием 102
4.2. Интерполиэлектролитные реакции с участием ДНК 105
4.3. Факторы, влияющие на скорость достижения равновесия в интерполиэлектролитных реакциях с участием ДНК 113
4.4. Факторы, влияющие на положение равновесия в интерполиэлектролитных реакциях с участием ДНК 117
4.4.1. Влияние катионов щелочных металлов 117
4.4.2. Влияние вторичной структуры ДНК 123
4.4.3. Влияние катионов кальция и магния 124
4.4.4. Влияние степени полимеризации синтетических полиионов 129
ГЛАВА 5. Использование бромида этидия для изучения взаимодействия ДНК с поликатионами различной природы и интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК 135
5.1. Взаимодействие бромида этидия с ДНК 136
5.2. Механизм взаимодействия БЭ с ДНК 140
5.3. Влияние интеркаляции БЭ на структуру и свойства ДНК 146
5.4. Тушение флуоресценции интеркалированного в ДНК бромида этидия ионами металлов и низкомолекулярными соединениями 149
5.5. Взаимодействие комплекса ДНК-БЭ с поликатионами различной химической природы 153
5.6. Механизм тушения флуоресценции интеркалированного БЭ поликатионами 160
5.8. Поведение комплексов (ДНКБЭ)-поликатион в водно-солевых растворах 166
5.9. Использование бромида этидия для изучения интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК 171
Выводы 175
Список литературы 178
- Электропроводность растворов полиэлектролитов
- Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК)
- Термическая денатурация ДНК в водных растворах
- Интерполиэлектролитные реакции с участием ДНК
Введение к работе
Актуальность темы
Актуальность изучения физико-химических свойств полиэлектролитов и полиэлектролитных комплексов объясняется потребностями как фундаментальной, так и прикладной науки. Природные, модифицированные природные и синтетические полиэлектролиты и полиэлектролитные комплексы на их основе широко применяются в различных областях химической технологии, биотехнологии, медицины, охраны окружающей среды, а изучение свойств полиэлектролитов и интерполиэлектролитных комплексов является фундаментальной задачей химии и физики полимеров. Функции полиэлектролитов в природе и их главные области применения основываются на их взаимодействиях либо с низкомолекулярными противоионами, либо с заряженными поверхностями, либо с противоположно заряженными полиэлектролитами. Однако особенности этих взаимодействий и связанное с ними взаимовлияние структуры и реакционной способности полиэлектролитов ещё далеки от полного понимания, в значительной степени из-за сложности учёта влияния многих факторов. Особый интерес в рамках этой проблемы представляет изучение биологически значимых полиэлектролитов, в частности, нуклеиновых кислот, а также интерполиэлектролитных реакций с их участием. Комплексы нуклеиновых кислот с белками составляют основу хроматина, рибосом и других компонентов клетки, а также вирусов. Образование комплексов нуклеиновых кислот с гистонами составляет существенный этап в процессах передачи генетической информации. Выяснение механизма таких взаимодействий необходимо как для понимания их нормальных биологических функций, так и их нарушений в процессах канцерогенеза и мутагенеза. Значение таких исследований особенно возрастает в связи с проблемами экологии. Однако основная трудность при изучении этих систем
заключается в том, что биологические полиэлектролиты имеют сложную и изменчивую структуру. В связи с этим большой интерес представляют исследования более простых модельных систем, позволяющие выявить физико-химические закономерности влияния различных факторов на структуру и реакционную способность полиэлектролитов и процессы интерполиэлектролитных взаимодействий. Изучение взаимодействия нуклеиновых кислот с различными высокомолекулярными противоионами весьма актуально также в связи с разработкой эффективных методов доставки генетического материала в клетку. Необходимым условием для таких исследований является, в частности, всестороннее знание о поведении полиэлектролитов в растворах. В то же время имеющаяся информация о свойствах и поведении полиэлектролитов далее в простых модельных системах неполна, фрагментарна или противоречива.
Основная часть диссертационной работы проводилась в рамках темы
«Физико-химические свойства природных и синтетических
полиэлектролитов», номер госрегистрации 01.980.008940. В разное время работа была поддержана грантами INTAS No. 93-1083 "Fabrication of nanostructures for imaging and addressing nanometer scale objects" и РФФИ № 97-03-32302a «Исследование селективности ДНК и синтетических полинуклеотидов к низко- и высокомолекулярным катионам».
Цели работы
1. Изучение конформационных изменений ДНК и линейных
синтетических полиэлектролитов в водных растворах и их связи с
молекулярными характеристиками полиионов.
2. Изучение интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК и
линейных синтетических полиионов в водных растворах, а также факторов,
влияющих на скорость и равновесие таких реакций.
Научная новизна
Показано, что использование кондуктометрических данных совместно с теорией полиэлектролитов Маннинга открывает новые возможности для анализа конформационного поведения полиионов в растворах. Разработанный в диссертации кондуктометрический подход является простым и информативным методом, позволяющим изучать конформационные изменения полиионов в растворах в зависимости от их молекулярных характеристик и внешних условий.
Методом тушения флуоресценции впервые изучены интерполиэлектролитные реакции замещения с участием ДНК и водорастворимых нестехиометричных полиэлектролитных комплексов, образованных линейными синтетическими полиионами. Выявлены особенности таких реакций, обусловленные структурой и ионной селективностью ДНК. Установлены факторы, способные эффективно контролировать скорость и равновесие реакций конкурентного взаимодействия ДНК с полиионами.
Предложен новый подход к изучению взаимодействия ДНК с поликатионами с использованием бромида этидия в качестве флуоресцентной метки. Метод позволяет изучать взаимодействие ДНК и других полинуклеотидов с широким кругом поликатионов, а также интерполиэлектролитные реакции с участием ДНК, не прибегая к трудоёмкому синтезу флуоресцентно меченных полианионов и не ограничиваясь использованием поликатионов-тушителей, что позволяет существенно расширить круг доступных для исследования объектов.
Практическая значимость работы
Результаты изучения растворов полиэлектролитов могут быть
использованы для разработки и дальнейшего усовершенствования
существующих теорий полиэлектролитов и интерполиэлектролитных взаимодействий.
Результаты изучения скорости и равновесия интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК могут быть использованы для направленного синтеза ДНК-содержащих полиэлектролитных комплексов с заданными свойствами и прогнозируемым поведением, что необходимо для разработки лекарственных препаратов в генной терапии и эффективных методов их доставки в клетку.
Предложенный метод изучения комплексообразования ДНК с поликатионами различной природы с использованием бромида этидия может быть использован для исследования широкого круга интерполиэлектролитных реакций с участием нуклеиновых кислот, для разработки схем разделения многокомпонентных биологических смесей, а также для создания простых и высокочувствительных методов диагностики.
Личный вклад автора
Постановка проблем, экспериментальные исследования и анализ полученных результатов проведены автором лично и с участием соавторов совместных научных публикаций.
Работы по изучению ионообменных свойств иммобилизованной ДНК выполнены совместно с И. А. Кузнецовым, Р. X. Хамизовым,
A. Г. Козловым, С. М. Филипповым, В. А. Ивановым, проф.
B. И. Горшковым.
Работы по кондуктометрическому изучению конформационных изменений ДНК в водных растворах выполнены совместно с О. В. Давыдовой и А. Г. Козловым.
Работы по кондуктометрическому изучению конформационных изменений синтетических полиэлектролитов в водных растворах выполнены совместно с О. В. Давыдовой, проф. В. А. Изумрудовым и А. Н. Зеликиным.
Работы по изучению интерполиэлектролитных реакций с участием ДНК и природных и синтетических полиэлектролитов выполнены совместно с проф. В. А. Изумрудовым и М. В. Жиряковой. В обсуждении результатов принимали участие чл.-корр. РАН А. Б. Зезин и акад. РАН В. А. Кабанов.
Публикации и апробация работы
По результатам диссертации опубликовано 22 статьи, список которых приведён в конце автореферата. Результаты работы были представлены на VII международной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991 г.), на международной конференции "Nano-stractures and self-assemblies in polymer systems" (Санкт-Петербург - Москва, 1995 г.), на Российско-Израильском полимерном семинаре (Москва, 1995 г.), на всероссийской конференции «Конденсационные полимеры: синтез, структура, свойства» (Москва, 1999 г.), на втором всероссийском каргинском симпозиуме «Химия и физика полимеров в начале XXI века» (Черноголовка, 2000 г.), международном симпозиуме "Polyelectrolytes 2002" (Лунд, Швеция, 2002 г.), юбилейной научной конференции «Герасимовские чтения» (Москва, 2003 г.), третьей всероссийской каргинской конференции «Полимеры-2004» (Москва, 2004 г.), XII симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Пущино, 2004 г.).
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 220 страницах, включает 77 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 365 наименований.
Электропроводность растворов полиэлектролитов
Электропроводность является экспериментально определяемой величиной, характеризующей транспортные свойства как простых электролитов, так и полиэлектролитов в растворе. Однако общей детально разработанной теории для описания электропроводности растворов полиэлектролитов не существует. В последнее время вопросы электропроводности растворов полиэлектролитов были подробно рассмотрены в различных обзорных публикациях [1—5].
Трудности теоретических подходов к описанию поведения полиэлектролитов являются следствием «асимметрии» полиэлектролитов по отношению к распределению зарядов. Большой, имеющий высокий заряд и часто гибкий полиион окружен малыми точечными противоионами (а иногда и коионами), имеющими единичный или небольшой заряд. Поэтому все теоретические модели основываются на упрощающих допущениях. Кроме того, два предельных случая (растворы полиэлектролитов в присутствии и в отсутствие низкомолекулярного электролита) обычно теоретически описываются отдельно.
Современные теории растворов полиэлектролитов, как правило, основаны на понятии конденсации противоионов, подробно разработанном в теории Маннинга [6, 7]. Основная идея состоит в том, что если плотность заряда на цепи полиэлектролита превышает некоторое критическое значение, определённая доля противоионов «конденсируется» на цепи полииона, т. е. удерживается вблизи полииона, чтобы понизить его заряд. Хотя существует всеобщее согласие по поводу этой качественной картины, которое подтверждается большим количеством экспериментальных данных, детали физического механизма конденсации противоионов и теоретические подходы к описанию распределения противоионов по-прежнему остаются спорной темой [8-26]. С формальной точки зрения эквивалентная электропроводность растворов полиэлектролитов может быть описана следующим выражением [2, 27-30]: A = f(Xc+Xp), (1.1) где Хс - эквивалентная электропроводность (подвижность) противоиона в растворе в отсутствие полииона, Хр - подвижность полииона, /— параметр (О f 1), учитывающий уменьшение электропроводности в результате электростатического взаимодействия полииона с противоионами (и, следовательно, соотносится с долей свободных противоионов). Если считать / равным доле «свободных» противоионов, то взаимодействие полииона с противоионами сводится к так называемому приближению двух состояний: доля / полностью свободна и доля 1 —/ полностью связана. В действительности все противоионы взаимодействуют с полиионами в той или иной степени. Одни из них сконденсированы, т. е. электростатически удерживаются заряженным полиионом в непосредственной близости от него, а другие расположены на некотором расстоянии от полииона и образуют диффузную ионную атмосферу вокруг него. Уравнение (1.1) может быть получено из простых физико-химических соображений. Удельная электропроводность к раствора электролита представляет собой сумму вкладов всех переносчиков заряда в системе, т. е. к = 5 /сА/, (1.2) где с( — концентрация, Х{ — эквивалентная электропроводность (или подвижность) каждого переносчика заряда в растворе. Для бессолевого раствора полиэлектролита из уравнения (1.2) имеем K = zcccXc+zpcpXp (1.3) где индексы сир соответствуют проивоионам и полиионам соответственно. Для однозарядных противоионов (zc=l) в приближении двух состояний справедливы следующие соотношения: сс = /-с, zp = f N и ср - с/N, где с — молярная концентрация мономерных звеньев, N — число мономерных звеньев в цепи. С учетом этих соотношений уравнение (1.3) для однозарядных противоионов принимает вид K = fc(\c+Xp). (1.4) Из этого уравнения с учётом того, что Л = к/с, получаем уравнение (1.1). Уравнение (1.1) можно записать также и в следующем виде [27, 31—33]: А = /(ХС + Хр) (1.5) в котором Хс заменено на Хс, т. е. на предельную подвижность противоиона в чистом растворителе. Полезным отличием этого уравнения от уравнения (1.1) является то, что, используя известные (табулированные) значения Хс, из экспериментальных значений Л можно получать параметры / и Л,р. Так, согласно уравнению (1.5), зависимость Л от Хс (так называемый график Айзенберга) должна представлять собой прямую линию с наклоном и отсекаемым отрезком, равными / и f-Xp соответственно. Действительно, в разных работах были обнаружены линейные зависимости Л от Хс для разных полиэлектролитов, в частности, для бессолевых растворов полиметакрилатов щелочных металлов при концентрациях порядка 1СГ3 М [2, 27, 28, 34, 35]. Кроме того, было показано, что линейные зависимости Л от Хс сохраняются в присутствии добавок низкомолекулярных КОНОНОВ или противоионов [34, 36], что говорит о чисто электростатическом связывании противоионов, т. е. об отсутствии специфического взаимодействия полиионов с противоионами.
Уравнение (1-5) содержит два параметра — долю свободных противоионов f и подвижность полиионов Хр. Различные модели электропроводности растворов полиэлектролитов используют разные подходы к теоретическому описанию этих параметров. Параметр / часто рассматривают в простых терминах доли свободных (т. е. несвязанных) ионов. В то же время, можно также интерпретировать уменьшение элекропроводности с точки зрения релаксационного эффекта [34], который учитывает замедление движения ионов, обусловленное асимметрией расположения заряда вокруг каждого иона во внешнем электрическом поле. Можно также формально связать уменьшение электропроводности с уменьшением эффективного коэффициента диффузии (D) противоионов по сравнению его значением в растворе, не содержащем полиэлектролит ( ) [32, 33], согласно уравнению:
Теоретические подходы к описанию/и Хр существенно различаются в зависимости от условий и от конкретного типа рассматриваемого полиэлектролита. Во всех случаях учёт распределения противоионов требует применения некоторых общих и конкретных модельных приближений.
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК)
Использовали препараты высокополимерной натриевой соли ДНК из эритроцитов цыплят фирмы "Reanal" (Венгрия) и из тимуса теленка фирмы "Sigma" (США) с длиной цепи -10000 пар оснований (молекулярная масса -6-Ю6 Да). Большинство препаратов ДНК использовали без дополнительной очистки, т. к. эксперименты на ДНК, очищенной по методике [142], показали хорошее совпадение данных с полученными на исходных препаратах.
Для приготовления исходных растворов ДНК навески сухой ДНК растворяли в деионизованнои воде или в 1-10 JM растворе NaCl. Растворы хранили при +4С. Концентрацию ДНК в растворе в молях фосфатных групп на литр определяли спектрофотометрически, используя коэффициент молярной экстинкциие2бо = 6600]УГ,-см [143, 144]. Образцы ДНК с длиной цепи 300 и 500 пар оснований (молекулярная масса 1.9-105 и3.2-105Да) из молок лосося были получены из ГосНИИОХТ, Россия. Нативное состояние используемых образцов ДНК было подтверждено с помощью УФ-спектроскопии, а также из увеличения интенсивности флуоресценции БЭ при его добавлении к растворам образцов ДНК.
Термическую денатурацию ДНК осуществляли нагреванием бессолевого раствора ДНК на водяной бане до 100 С в течение 1.5 мин и быстрым охлаждением во льду. Значение гиперхромного коэффициента /г2бо 1-37— 1.40 в максимуме поглощения при 260 нм указывает на практически полную денатурацию ДНК в этих условиях. За время проведения опытов с денатурированной ДНК величина /z26o практически не изменялась, то есть ренатурация ДНК не происходила.
Полиметакриловую кислоту (ПМАК) синтезировали радикальной полимеризацией и фракционировали дробным осаждением в смеси метанол — этилацетат по методике [145]. Использовали фракции ПМАК со среднечисловой степенью полимеризации Рп = 50, определенной эбулиоскопически, и со средневесовыми степенями полимеризации Ру/ = 1200 и 2100, которые определяли методом светорассеяния.
Меченную флуоресцирующими пиренильными группами полиметакриловую кислоту (ПМАК ) синтезировали реакцией тех же фракций ПМАК с пиренилдиазометаном по методике [145]. Варьированием соотношения компонентов получали фракции ПМАК с разным числом пиренильных меток, содержание которых определяли из УФ-спектров растворов ПМАК по характеристической полосе поглощения пиреновых групп при X = 342 нм, принимая коэффициент их молярной экстинкции з42 = 5-10 М -см-1 [145]. Содержание флуоресцентных меток в использованных образцах ПМАК составляло: 1 метка на 450 мономерных звеньев для образцов с DP = 2100 и DP =1200, а также 1 метка на 250 мономерных звеньев для образцов с DP = 50 (в этом случае флуоресцентную метку содержит каждая пятая цепь ПМАК ).
Образцы полиакриловой кислоты были синтезированы, фракционированы и охарактеризованы по методике [146]. Значения средневесовой молекулярной массы Mw определяли методом светорассеяния растворов в метаноле при комнатной температуре. Значения среднечисловой молекулярной массы Мп определяли методом гель-проникающей хроматографии на PW-6000 (Toyo Soda). Полидисперсность образцов составляла Mw/Mn 1.25. Образец с молекулярной массой 2000 Да фирмы "Aldrich" (США) использовали без дополнительной очистки.
Концентрацию растворов полиакриловой кислоты определяли с помощью потенциометрического титрования раствором NaOH. Растворы образцов полиакрилата натрия получали из соответствующих растворов образцов полиакриловой кислоты, нейтрализуя их раствором NaOH. Полистиролсульфонат натрия (ПСС) [-сн2-сн-],г S03-Na+ Использовали образцы полистиролсульфоната натрия Standard monodisperse grade фирмы "Serva" (Германия). Предварительные эксперименты показали, что образцы содержали значительное количество низкомолекулярных примесей, что затрудняло проведение кондуктометрических измерений. Для устранения этой проблемы образцы были диализованы против дважды дистиллированной воды. Концентрацию растворов ПСС определяли измерением оптического поглощения водных растворов при Хтак = 262 нм, для которых использовали значение молярного коэффициента экстинкции Є262 = 400 МГ -см-1.
Образцы полностью алкилированного ПЭВП получали исчерпывающим алкилированием фракций поли-4-винилпиридина с соответствующими степенями полимеризации ("Aldrich", США) бромистым этилом по методике [147]. Степени алкилирования полученных образцов определяли из ИК спектров по полосам поглощения алкилированного (v = 1640 см-1) и неалкилированного (v = 1600 см-) звеньев [148]. Степень алкилирования полученных образцов составляла более 95 %. Концентрацию растворов ПЭВП определяли спектрофотометрически, полагая коэффициент молярной экстинкции равным є257 = 3500 М-1-см-1.
Термическая денатурация ДНК в водных растворах
При исследовании бессолевых растворов ДНК на зависимости удельной электропроводности к от температуры в координатах Аррениуса (1пк- 1/Т) был обнаружен излом [154], который был отнесён к так называемому эффекту предплавления. Исследования более концентрированных растворов ДНК, как бессолевых, так и содержащих поддерживающий электролит, в более широком интервале температур, показали, что на указанной выше зависимости обнаруживается два излома [155-157], а сама кривая состоит их трёх участков, соответствующих электропроводности нативной, денатурированной, а также изменяющейся между ними структуры ДНК.
Видно, что на приведённых зависимостях обнаруживаются два излома, а сами кривые состоят из трёх участков, соответствующих электропроводности нативной, денатурированной, а также изменяющейся между ними в процессе денатурации структуры ДНК. Таким образом, как отмечено выше, эти кривые представляют собой кондуктометриические кривые термической денатурации ДНК.
На рис. 3.4 представлены зависимости среднего расстояния b между зарядами на цепи полииона ДНК от температуры, рассчитанные из данных рис. 3.3 по уравнениям 3.1-3.3. Из рисунка видно, что приведённые зависимости b от температуры имеют -образную форму, характерную для кривых плавления ДНК, по положению точек перегиба которых можно определять температуру плавления биополимера, а по величине b судить о структурных изменениях молекул ДНК в растворе при изменении температуры.
Увеличение удельной электропроводности растворов ДНК при её денатурации в работе [159] было объяснено высвобождением некоторого количества противоионов при денатурации ДНК. Ранее в работе [160] методом потенциометрии было показано, что при денатурации ДНК активность противоионов существенно возрастает. Такое высвобождение противоионов при денатурации, очевидно, оказывает существенно большее влияние на электропроводность раствора ДНК, чем возможное уменьшение подвижности полииона. Полученные в настоящей работе данные показывают, что в процессе денатурации плотность заряда на полиионе ДНК уменьшается, что должно приводить к высвобождению некоторого количества противоионов в раствор. Из рис. 3.4 видно, что величина Ъ для молекулы ДНК в исходном состоянии несколько превышает «классическое» значение этого параметра для правильной двойной спирали молекулы В-формы ДНК, равное 1.7 А [161]. Такое отличие можно объяснить тем, что «идеальная» двухспиральная структура ДНК может существовать, по-видимому, только в растворах, содержащих большой, по сравнению с количеством биополимера, избыток поддерживающего электролита. Хотя, согласно литературным данным, в бессолевых растворах ДНК и растворах, содержащих соизмеримые с концентрациями биополимера количества низкомолекулярной соли, двухспиральная структура молекул ДНК сохраняется [158, 162], ясно, что структурные параметры этой спирали должны отличаться от «идеальных». А, соответствующее полностью вытянутой конформации одиночной цепи ДНК [161]. Этот результат свидетельствует о том, что конформация денатурированной ДНК в растворе далека от полностью вытянутой, и полианионы ДНК в таких растворах в значительной степени свёрнуты. Такой вывод совпадает с оценками, проведенными в литературе на основании данных по термической денатурации ДНК, согласно которым величина Ъ для денатурированной ДНК должна составлять около 4.0-4.5 А [163-165]. Полученное в настоящей работе значение Ъ « 4.5 А хорошо согласуется с этими данными.
На основании полученных данных можно рассчитать энтальпии термической денатурации ДНК. Согласно теории Маннинга [166], энтальпия денатурации («плавления») полинуклеотида в растворе поддерживающего электролита на моль оснований ДНК может быть рассчитана по формуле.
Коэффициент к в этом уравнении представляет собой тангенс угла наклона зависимости в координатах Тт — lg cs, т. е. к = dTm I dig cs. По данным разных авторов этот коэффициент в нейтральной среде колеблется в довольно широких пределах — от 16.7 до 26.6 К. Было также показано, что величина dTm/dlgcs зависит от содержания GC-nap и от природы поддерживающего 1—1 электролита [183, 184].
Интерполиэлектролитные реакции с участием ДНК
В настоящей работе сделан следующий шаг в направлении моделирования процессов с участием биологически значимых полиэлектролитов. В качестве конкурирующего полианиона была впервые использована ДНК — полиэлектролит огромной биологической значимости. Известно, что интерполиэлектролитные реакции между ДНК и катионными белками — гистонами составляют один из важных этапов в процессах передачи генетической информации. Выяснение механизма таких взаимодействий необходимо как для понимания их нормальных биологических функций ДНК, так и их нарушений в процессах мутагенеза и канцерогенеза. Однако основная трудность при изучении этих систем заключается в том, что биологические полиэлектролиты имеют сложную и изменчивую структуру. В связи с этим большой интерес представляют исследования более простых модельных систем, позволяющие выявить физико-химические закономерности влияния различных факторов на структуру и реакционную способность полиэлектролитов и процессы Интерпол иэ л ектролитных взаимодействий.
Кроме того, изучение взаимодействия нуклеиновых кислот с различными поликатионами весьма актуально также в связи с разработкой эффективных методов доставки генетического материала в клетку. Генная терапия, по-видимому, со временем станет эффективным средством для лечения наследственных и раковых заболеваний, а также будет применяться для вакцинации от различных вирусных заболеваний [214, 215]. Важнейшей составной частью генной терапии является транспорт ДНК через клеточную мембрану и её доставка в конечном счете в клеточное ядро. Поэтому разработка эффективных средств доставки генетического материала в клетку является главной задачей в генной терапии [216]. Для доставки генетического материала в клетку используют различные подходы, которые обычно подразделяют на вирусные и невирусные системы доставки [217]. Вирусные системы доставки основаны на создании генетически модифицированных вирусов, которые сохраняют способность эффективно доставлять ДНК в клетки, но лишены своих патогенных характеристик [216]. Хотя вирусные переносчики (векторы) позволяют достичь высокой эффективности трансфекции благодаря выработанным ими высокоспециализированным механизмам проникновения в клетку, но в то же время имеют и существенные недостатки, такие как ограниченный размер «полезного груза» доставляемой ДНК, возможность эндогенной вирусной рекомбинации, противовекторной иммунной реакции или онкогенной активации [218-221]. Поэтому всё более популярной альтернативой вирусным векторам становятся невирусные системы доставки генов [222— 226]. В отличие от вирусных векторов, искусственные средства трансфекции считаются гораздо более безопасными, их можно вводить многократно с низким риском иммунной реакции, их можно производить в больших количествах в соответствии с конкретными потребностями («на заказ») с помощью химической или иммунологической модификации.
Современные системы невирусной доставки генов, как правило, основаны на использовании полиэлектролитных комплексов плазмидной ДНК с природными и синтетическими поликатионами, такими как различные синтетические поликатионы и их сополимеры [227-232], катионные липиды и пептиды [233-236], липосомы [237-241], дендримеры [242, 243] и др.
Несмотря на обилие публикаций по использованию катионных пептидов для переноски генов в клетки, очень мало известно о непосредственном механизме проникновения в клетку комплексов ДНК с поликатионами. Проникновение таких комплексов в клетку происходит, по-видимому, в результате различных вариантов эндоцитоза [244, 245] (рис. 4.2).
Обычно метод включает приготовление комплекса ДНК с поликатионами, которые нейтрализуют отрицательный заряд фосфатных групп и компактизируют макромолекулу ДНК в наночастицы, что облегчает её проникновение в клетку. Кроме того, поликатионы защищают доставленную в клетку ДНК от разрушения клеточными нуклеазами [208, 209, 247, 248].
Тем не менее, эффективность трансфекции с помощью синтетических векторов обычно низка по сравнению с вирусными векторами, что препятствует их успешному клиническому применению [249, 250].
Главными лимитирующими факторами эффективной доставки ДНК в клетку с помощью синтетических векторов являются плохое проникновение в клетку, токсичность, а также недостаточная или избыточная устойчивость векторов в физиологических условиях [251-253]. Поэтому продолжаются интенсивные исследования по усовершенствованию невирусных векторов [254-259].
Результаты представлены в виде зависимости относительной интенсивности флуоресценции 1/1о реакционных смесей (где /о -интенсивность флуоресценции раствора ПМА той же концентрации и в тех же условиях) от концентрации добавленного хлорида натрия. На рисунке также представлена зависимость относительной интенсивности флуоресценции /N/ O раствора НПЭК(ПМА-ПЭВП). Измерения интенсивности флуоресценции проводили спустя сутки после приготовления растворов реагентов с заданными концентрациями NaCl.
Из положения начальных участков кривых 1 и 2 следует, что добавление ДНК к раствору НПЭК(ПМА-ПЭВП) (кривая 1) или ПМА к раствору НПЭК(ДНК-ПЭВП) (кривая 2) в отсутствие NaCl не приводит к изменению интенсивности флуоресценции, то есть в отсутствие соли реакция (4.3) практически не идет и равновесие не достигается даже в течение суток. В этом отношении поведение данной системы не отличается от поведения исследованных ранее интерполиэлектролитных реакций с участием гибкоцепных синтетических полиионов: как известно, такие реакции практически не протекают в бессолевых водных растворах, где частицы НПЭК стабилизированы весьма прочной системой интерполимерных солевых связей [262].
Введение в реакционные смеси хлорида натрия, вызывающего разрушение солевых связей, сопровождается изменением интенсивности флуоресценции. Как видно из рис. 4.3, при [NaCl] 0.1 М кривые 1 и 2 практически совпадают. Это свидетельствует о протекании интерполиэлектролитной реакции (4.3) и означает, что при [NaCl] 0.1 М за время выдерживания растворов (24 часа) в системе успевает установиться равновесие.
Из представленных на рис 4.3 данных следует, что диапазон концентрации соли, доступный для изучения равновесия реакции (4.3), ограничен в этой системе снизу значением [NaCl] « 0.1 М, ниже которого реакция кинетически заторможена. Верхней границей этого диапазона концентрации соли является значение [NaCl]«0.25 М, выше которого происходит разрушение комплекса НПЭК(ПМА -ПЭВП), о чем свидетельствует резкий рост интенсивности флуоресценции раствора (кривая 3) в результате разрушения системы межцепных солевых связей ПМА -ПЭВП и разделения полимерных компонентов [263]. Устойчивость этого НПЭК определяет положение верхней границы области исследования реакции (4.3), так как её продукт - НПЭК(ДНК-ПЭВП3о) разрушается при более высоких значениях [NaCI] (см. ниже рис. 4.11 в разделе 4.4.1).
Как следует из рис. 4.3, при [NaCI] « 0.1 М значения I/IQ растворов реакционной смеси (кривые 1, 2) практически совпадают с величиной IN Но раствора .НПЭЩПМА -ПЭВП) (кривая 3). Это означает, что при этой концентрации соли равновесие реакции (4.3) практически полностью сдвинуто влево. Дальнейшее добавление соли приводит к увеличению значения 1/1о, а при [NaCI] « 0.25 М, то есть на верхей границе доступного для измерений диапазона концентраций соли, оно достигает уже значительной величины, I/I0 = 0.8.
