Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор
1.1. Физико-химические свойства поли (а) и поли(у) 8
1.2. Электропроводность полиэлектролитов 34
2. Экспериментальная часть
2.1. Используемые материалы 52
2.2. Методики экспериментов 52
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Характеристика изоионных растворов полинуклеотйдов 62
3.1.1. Изоионные растворы поли(У) 62
3.1.2. Химическая устойчивость изоионных растворов поли(А) 65
3.2. Потенциомбгрйческое титрование изоионных растворов пож(а): демонстрация трех протонированных форм 66
3.2.1. Кривые титрования Н-поли(А) 66
3.2.2. Расчет рК трех протонированных форм поли(А) 70
3.2.3. Влияние добавок КС на кривые титрования изоионных растворов поли(А) 75
3.2.4. Влияние ионов М^2+ 77
3.3. Электропроводность бессолевых растворов полинуклеотйдов 81
3.3.1. Учет вклада растворителя в электропроводность раствора 81
3.3.2. Концентрационные зависимости эквивалентной электропроводности растворов Н-поли(А), Н-поли(У) и их солей 84
3.3.3. Определение предельных подвижностей полииона для солей поли (У) и поли (А) 89
3.3.4. Причина различий электропроводности солей поли(А), полученных I и II способами 93
3.3.5. Оценка параметра плотности заряда для поли(У), поли(А)- I и поли(А)-П 95
3.3.6. Сравнение экспериментальных и рассчитанных по теории Манинга концентрационных зависимостей электропроводности растворов поли (У), поли (А)-І и поли (А)-ІІ 97
3.3.7. Оценка эффективного заряда полииона из кондуктометричес-ких данных 98
3.3.8. К вопросу о зависимости параметра плотности заряда от концентрации полимера 104
3.3.9. Оценка чисел переноса в растворах полинуклеотидов 13)7
3.3.10. Определение констант диссоциации фосфатных групп из кондуктометрических данных 108
3.3.11. Особенности электропроводности изоионного раствора поли (А) 112
3.4. Взаимодействие поли(а) и поли(у) в концентрированных бессолевых растворах 114
3.5. Взаимодействие иммобилизованных пож(а) и пож(у) с ионами щелочных металлов и аммония, меди и кальция 119
3.5.1. Определение обменной емкости. Полнота иммобилизации. Устойчивость ионитов 120
3.5.2. Исследование селективности поли(А) к ионам щелочных металлов и аммония 123
3.5.3. Уменьшение емкости ионита на основе поли(А) под действием ионов лития 125
3.5.4. Взаимодействие иммобилизованных поли(А) и поли(У) с ионами меди и кальция 127
3.6. Взаимодействие ионов серебра с пож(а) и пож(У) 131
3.6.1. Взаимодействие поли(А) и поли(У) с ионами серебра в растворе 132
3.6.2. Взаимодействие ионов Аа+ с иммобилизованными поли(А) и поли (У) 143
Выводы 150
- Электропроводность полиэлектролитов
- Методики экспериментов
- Потенциомбгрйческое титрование изоионных растворов пож(а): демонстрация трех протонированных форм
- Электропроводность бессолевых растворов полинуклеотйдов
Введение к работе
Биологическая активность ДНК в живой клетке зависит от ее вторичной структуры, которая в большой степени определяется взаимодействием с ионами металлов. В связи с этим выяснение взаимосвязи структуры ДНК и ее ионного окружения является одной из наиболее актуальных проблем современной молекулярной биологии. В последнее время для изучения вторичной структуры широко используются методы, основанные на ее возмущении под действием различных факторов. В частности,к таким факторам можно отнести ионы Н30+,
Аа* , Саг+ , взаимодействие каждого из которых с ДНК особенно сильно и специфически влияет на ее структуру. Последние два иона по-разному взаимодействуют с нативной и денатурированной ДНК. Этот факт некоторые авторы предлагают использовать как тест на вторичную структуру. Однако интерпретация экспериментальных данных по связыванию ДНК с различными низкомолекулярными ионами осложняется тем, что этот гетерополимер содержит основания четырех типов. По этой причине синтетические гомополинуклеотиды, содержащие один тип
ОСНОВаНИЙ, ЯВЛЯЮТСЯ уДОбНЫМИ МОДеЛЯМИ ДЛЯ ИЗучеНИЯ СТРУКТУРЫ И ВЛИ'
яния на нее различных металлов, а также полиэлектролитных свойств ДНК.
В настоящее время, несмотря на большой интерес к проблеме взаимодействия ДНК с ионами металлов, остаются неизвестными механизмы и точно не установлены места связывания этих ионов с ДНК и синтетическими полинуклеотидами. Очень слабо изучены вопросы связывания ДНК с протоном, хотя известно, что протолитические процессы играют большую роль в функционировании клетки. Окончательно не выяснена взаимосвязь между протонированием оснований и изменением вторичной структуры ДНК и других нуклеиновых кислот. Данные, полученные разными авторами, часто противоречивы, что вызвано не только сложно-
стью объекта исследований, но и отсутствием прямых и надежных методов изучения взаимодействия низкомолекулярных ионов с ДНК.
Согласно современным теориям полиэлектролитов, существует однозначная связь между плотностью заряда полииона и электропроводностью полиэлектролита. В литературе подчеркивается," что транспортные методы очень чувствительны к изменениям вторичной структуры полииона. Несмотря на это электропроводность растворов ДНК изучена слабо, а синтетических полинуклеотидов не изучена вовсе.
На кафедре физической химии МГУ были предложены два новых подхода к изучению вторичной структуры ДНК и ее взаимодействия с ионами металлов.
Физико-химическое исследование изоионных растворов, получен*-ных ионообменным методом, и солей ДНК, не содержащих поддерживающего электролита.
Исследование ионообменных и других физико-химических свойств ДНК, иммобилизованной в полиакриламидном геле.
В настоящей работе оба эти. подхода впервые использованы для синтетических полинуклеотидов: полирибоадениловой ( поли(А) ) и полирибоуридиловой ( поли(У) ) кислот, являющихся простыми и удобными для исследования моделями ДНК.
Целью настоящей работы было выявление особенностей взаимодействия поли (А) и поли (У) с ионами щелочных металлов, Со24, Си,*"*, Да* и гидроксония и их влияния на конформацию полинуклеотидов в изоионных растворах, растворах солей, не содержащих поддерживающего электролита,и в иммобилизованном состоянии.
Для решения поставленной задачи в работе были использованы по-тенциометрия, кондуктометрия, измерение УФ-спектров, методы ионного обмена.
В работе впервые исследованы изоионные растворы поли(А),поли(У) и полученные из них соли щелочных металлов, а также их взаимодей-
ствие с ионами Ааи Н^О* . Дня определения констант связывания этих ионов с синтетическими гомополинуклеотидами впервые получены иониты на их основе по методике иммобилизации в полиакриламидном геле.
Исследование кислотно-основного равновесия в изоионных растворах поли (А) позволило уточнить механизм образования двухспиральных участков в изоионных растворах ДНК и показать, что первому перегибу на кривых титрования этих растворов соответствует титрование адениновых оснований одноцепочечных участков ( рК 3,5), а второй перегиб относится к титрованию оснований, входящих в двухспираль-ные структуры ( рК 6,7). Определены количественные соотношения и характеристические константы диссоциации трех протонированных форм поли(А) в изоионном растворе, уточнены механизмы образования двухспиральных форм при протонировании оснований, показано влияние добавок ионов К*> Me24» Д«+ на стабильность и соотношение форм. Показано, что образование компактных структур поли (А), вызываемое протонированием, и обнаруженное ранее в изоионных растворах ДНК, можно отличить от агрегации простым потенциометрическим титрованием.
Измерение электропроводности солей поли(А) и поли(У) позволило определить предельные подвижности полиионов этих полиэлектролитов без измерения чисел переноса, рассчитать параметр плотности заряда ( і ), являющийся ключевым параметром всех современных теорий растворов полиэлектролитов, в бесконечно разбавленных растворах. Показано, что зависит от концентрации полимера в бессолевых растворах. Полученные данные позволяют рассчитать зависимость чисел переноса полиионов полинуклеотидов от концентрации полимера.
Впервые прямым методом получены константы связывания ионов щелочных металлов, А^+ , &tt+ с поли (А) и поли (У). Исследование взаи-
модействия ионов серебра с поли(А) и поли(У) в растворах, а также ионов серебра и меди с иммобилизованными полинуклеотидами позволило уточнить механизмы взаимодействия этих ионов с ДНК.
Полученные результаты представляют интерес для развития теории растворов полиэлектролитов, а также могут быть использованы в спецкурсах по физической химии ДНК.
Предложенные в работе методы контроля за гидролизом полинуклео-тидной цепи и очистки полинуклеотидов от солевых примесей, низкомолекулярных фракций и олигонуклеотидов могут быть использованы в лабораториях, изучающих синтетические полинуклеотиды. Предложенные в работе методы определения концентрации поли(А) и поли(У), основанные на анализе кривых потенциометрического и кондуктометрического титрования изоионных растворов, могут использоваться в заводских лабораториях, связанных с производством синтетических полинуклеотидов.
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списков условных обозначений и цитируемой литературы.
Электропроводность полиэлектролитов
В следующих параграфах литературного обзора остановимся на особенностях и достоинствах очень перспективного для изучения структуры полимера в растворе, но еще не получившего широкого применения для биологических полиэлектролитов, метода - электропроводности . Наряду с другими физико-химическими методами, используемыми для изучения связывания притивоионов в растворе полиэлектролитов, такими как измерение коэффициентов активности (# ), осмотических коэффициентов ( ?) показано, что электропроводность также позволяет получить информацию о связывании противоионов полиионом /80/. Кроме того, в молекулярной теории Манинга показано, что электропроводность полиэлектролитов однозначно связана с плотностью заряда полииона, которая, в свою очередь, определяется конформацией полимера /81/. Основные положения этой теории и вывод уравнения, связывающего параметры электропроводности (% ) и плотности заряда ( ) рассмотрены в 1.2.2. Недавно изучение концентрационных зависимостей солей щелочных металлов ДНК позволило определить значение параметра плотности заряда полииона денатурированной ДНК /82/. Это имеет важное значение как для теории полиэлектролитов, так и для физической химии ДНК, так как до этого времени этот параметр относился к разряду подгоночных. К сожалению, сведения об электропроводности синтетических полинуклеотидов в литературе отсутствуют, если не считать работ /76,83/, поэтому общие закономерности и особенности электропроводности полиэлектролитов рассмотрены на примере ДНК и других классов полиэлектролитов. Выше было отмечено, что Хьюг использовал измерения электропроводности для изучения тепловой денатурации комплекса поли(А поли(У), причем он несрого допускал, что подвижность полиионов поли(А), поли(У) и поли(А поли(У) одинакова, хотя очевидно, что эти полиионы должны иметь различную плотность заряда .В работе /83/ изучали зависимость электропроводности поли(У) от дозы облучения, вызывающего деструкцию полимера и, следовательно, уменьшение его молекулярной массы. Увеличение электропроводности с ростом времени облучения авторы объяснили увеличением степени диссоциации противоионов с уменьшением степени полимеризации поли(У). Это объяснение представляется весьма спорным: скорее всего электропроводность увеличивается за счет возрастания доли вторичных фосфатных групп, образующихся при гидролизе. С этим же, скорее всего связано небольшое понижение рН после облучения раствора. I.2.I. Экспериментальные закономерности и особенности электропроводности полиэлектролитов.
Важнейшая особенность электропроводности растворов полиэлектролитов - независимость от молекулярной массы полимера. Начиная с некоторой степени полимеризации, наряду с коллигативными свойствами, электропроводность и подвижность полииона определяется только числом заряженных групп, приходящихся на единицу длины полииона. Другие же транспортные свойства растворов полиэлектролитов, такие как вязкость, седиментация, диффузия, зависят от степени полимеризации /84,85/. Для ДНК электропроводность перестает изменяться при изменении молекулярного веса, начиная с М = 10 /86/. Такая особенность полиэлектролитов означает, что взаимодействие противоионов с полиионом в растворе определяется в основном заряженными группами относительно коротких сегментов цепи, и вклад более удаленных групп в это взаимодействие незначителен. Это свойство позволяет представить полиион в виде цилиндра бесконечной длины с равномерным распределением заряда. В теориях полиэлектролитов предполагается, что взаимодействие цепи полииона контурной длины L с малыми ионами определяется линейной плотностью заряда где р- число заряженных групп полииона с зарядом Z /84,87/. В то же время, электрофоретическая подвижность ДНК в геле зависит от молекулярной массы, и это свойство используется для определения М и разделения на фракции с различной степенью полимеризации /88/. Высокий электростатический потенциал полииона определяет особенности всех физико-химических свойств полиэлектролита, в том числе и электропроводности. Благодаря высокой плотности заряда часть противоионов прочно удерживается полиионом даже в самых разбавленных растворах. Этим же объясняется тот факт, что X , Y , а также электропроводноеть и коэффициент диффузии противоионов в растворах полиэлектролитов меньше, чем в растворах соответствующих мономеров /84/. Основываясь на многочисленных экспериментах по диффузии, самодиффузии и проводимости полиэлектролитов, Уолл предложил следующее уравнение для электропроводности : А = ( Ас + АР) (I.I), где А, Аси Ар - эквивалентная электропроводность раствора полиэлектролита, подвижности противоиона и полииона в растворе конечной концентрации, соответственно, -f - коэффициент электропроводности, имеющий смысл коццуктометрической степени диссоциации./89/. В качестве Ас было предложено использовать величину подвижности противоиона в чистом растворителе при концентрации, равной концентрации полимера в растворе.
Другие авторы так же придерживаются этой точки зрения относительно Ас/80,81,90/. Но в большинстве случаев принимают Ас=А , то есть предельной подвижности противоиона /91-96/. Для вычисления % по уравнению(I.I) необходимо определить значение Ар. Обычно его находят из измерений чисел переноса: Ар=ЛІр , tp+lc = I» где ip и tc - числа переноса полииона и противоиона, соответственно. Однако, определение чисел переноса в растворах полиэлектролитов часто затруднительно. Особенностью полиэлектролитов, отличающей их от низкомолекулярных электролитов, являются отрицательные числа переноса противоионов, или числа переноса полииона большие единицы, что обусловлено опять-таки высоким потенциалом полииона. Впервые отрицательные числа переноса противоионов в растворе полиакриловой кислоты (ПАК) обнаружил Уолл с сотрудниками /89/. Методом меченных атомов было показано, что часть противоионов движется вместе с полиионом к аноду при наложении электрического поля. Числа переноса полииона, большие единицы, получены в работах /90,92,97,98/. В растворах солей полистиролсульфоновой кислоты (ПССК) число переноса полииона лежит в интервале 1,6 - 1,7 в области концентраций полимера от о о 4-Ю до 1,4-10 М /98/. В работе /90/ для этой же поликислоты найдено, что tp уменьшается от 1,6 до 1,0 с ростом концентрации от 2,5-10 до 8-Ю"" М. Для Li, No., К солей декстрансульфата обнаружена аналогичная зависимость tp от концентрации полимера /92/. В растворе Na-ДНК tp возрастает от 0,5 до 1,3 при изменении концентрации 4 —Я полимера от 10 до 2,5-10 М /97/. Для сравнения отметим, что в растворах низкомолекулярных электролитов отрицательные числа переноса встречаются гораздо реже и наблюдаются только в тех случаях, когда имеется сильная ассоциация ионов (например, комплексообразо-вание) /99/. Не существует единой точки зрения относительно зависимости от концентрации полимера в растворе. Так, в работах /90,92,98,100-102/ для оценки величины $ использовали уравнение (I). Дня этого измеряли электропроводность нескольких солей (обычно щелочных металлов) исследуемых полиэлектролитов и решали систему уравнений относительно /f / г / л Л = г (лс + АР; і Л" = { (Лс+Лр) J (1.2). При этом допускали, что ионы щелочных металлов связываются полиионом одинаково и Ар не зависит от природы противоиона, а штрихами отмечены величины, относящиеся к данной соли полиэлектролита.Определенное таким способом значение т в бессолевых растворах полистирол-сульфоната натрия (NallCC) практически не зависело от концентрации полимера /98/. Долар с соавторами /90/ и Андер и Ковблански /102/ обнаружили заметное увеличение f с ростом концентрации NcJICG. Джоши и Квак /92/ нашли, что в растворах декстрансульфатов -f также слегка увеличивается с ростом концентрации.
Методики экспериментов
В работе использовали калиевые соли полиадениловой и полиуриди-ловой кислот фирмы "Recmal " (ВНР). Для синтеза полиакриламидного геля (ШАГ) использовали акрила-мид и М,М -метилен-бис-акриламид (сшивающий агент) производства фирмы "ktanal ". Катализатором реакции полимеризации служила окислительно-восстановительная система 2, (марки Х.Ч.) и IM,N,l\)jN -тетраметилэтилендиамид ("ТЕМЕД") фирмы "Reanut ". Для ионообменных экспериментов использовали хлориды щелочных металлов и аммония, A%N0$ и кристаллогидраты СаСігі-5 0і Ca,Cz- в НгО марки Х.Ч. и Ч.Д.А.. Для измерения электропроводности и приготовления солей рибонуклеатов использовали хлориды щелочных металлов и аммония квалификации 0.С. Ч.. Использовали деионизованную воду, которую получали дополнительной очисткой дистиллированной воды на смешанном слое ионитов. Смешанный слой представляет собой суспензию из равных объемов катиони-та КУ-2Х8 в Н-форме и анионита AB-I7 в ОН -форме. 2.2. МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТОВ. 2.2.1. Подготовка ионообменных смол к работе. Для обеспечения наиболее полного участия ионоогенных групп ионитов в реакциях ионного обмена промышленные ионообменные смолы несколько раз переводили из одной ионной формы в другую. Этот процесс, который можно представить уравнениями, приведенными ниже, проводили в колонках диаметром 100-120 мм и высотой 30-40 см. на катионите: XNa -f НС -« г ХН + Na.C , -0.5М Naa на анионите: ya + Na0H а5 м Na.H Y0H + NaC. На последней стадии процесса подготовки ионитов к работе (перевод смол КУ-2 8 в И-форму и AB-I7 в ОН-форму) контролировали полноту перевода в соответствующую форму: раствор кислоты через катионит пропускали до исчезновения ионов М«- в элюате, которые регистрировали методом пламенной фотометрии; щелочь пропускали через анионит до полного удаления ионов W , которые обнаруживали качественной реакцией с А$Щ. Для перевода катионита в Ме-форму (Me - ион щелочного металла или аммония) через колонку с Н-КУ-2 8 пропускали 0,5 М раствор МеС до тех пор, пока значение рН элюата не приближалось к рН пропускаемого раствора, после чего колонку промывали дистиллированной водой. Ионообменные процессы для получения различных ионных форм рибонук-леатов проводили в колонках диаметром 10-12 мм и высотой 30-40 см. 2.2.2. Получение изоионных растворов поли(А) и поли(У) и оценка чистоты исходных препаратов. Изоионные растворы поли(А) и поли(У)хполучали двумя способами: I. пропускали водный раствор исходной соли через колонку с катиони-том в Н-форме, 2. через колонку со смешанным слоем ионитов. Во втором случае все низкомолекулярные ионогенные примеси задерживаются смешанным слоем, тогда как в первом катионит обменивает только катионы на ионы гидроксония.
Потенциометрическое титрование изоионных растворов поли(А) и поли(У) показало, что кривые титрования растворов, полученных первым и вторым способами, совпадают, что свидетельствует об отсутствии примесей ионного характера в исходных образцах . В противном случае на титрование одинакового количества поликислот пошло бы разное количество щелочи: больше для образцов, по лученных первым способом. Такая картина означает, что исходные препа-кСтрого говоря, раствор Н-поли(У) нельзя называть изоионным, так как поли(У) не является полиамфолитом. Термин "изоионный" используется, чтобы подчеркнуть отсутствие низкомолекулярных ионов, кроме Н50+ и ОН", и способ получения этого раствора. раты полинуклеотидов содержали незначительное количество олигоме-ров и мономеров. Молекулярную массу поли(У) оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле, используя 6 М мочевину в качестве денатурирующего агента. Маркерами служили образцы Ї6& и 23 S рибосомной РНК. Верхняя граница соответствует по подвижности 23S РНК, нижняя граница - примерно 100 нуклеотидам? 2.2.3. Получение рибонуклеатов щелочных металлов и аммония. Для получения солей поли(У) изоионный раствор пропускали через колонку с катионитом в соответствующей Ме-форме (где Me - Li, Na+, К+, Rb+, Cs NHj). При этом рН повышается от 2,8±0,3 в изоионном растворе до 6,1 0,3 в растворах полирибонуклеотидов. Соли щелочных металлов поли(А) получали фильтрованием через колонку с катионитом в Ме-форме К-раствора поли(А) (получали образцы I) и изоионного раствора Н-поли(А) (образцы II). Полноту перевода К-поли(А) в соответствующую Ме-форму контролировали методом пламенной фотометрии на эмиссионном пламенном фотометре Р1-АРН0(ГДР). При достаточно медленном фильтровании ионы К+отсутствовали в фильтрате. -Дяя оценки степени обмена ионов Нг04 на ион щелочного металла при получении образцов II проводили следующий эксперимент: известное количество М-поли(А) фильтровали через колонку с катионитом в Ме-форме и полностью вытесняли водой раствор полимера из межзе-ренного пространства. После этого через колонку пропускали аликво-ту титрованной щелочи и смывали ее деионизованной водой в мерную колбу. Титрованием определяли количество вышедшего МаОИ. Разница в количестве вошедшего и вышедшего NaOH равна количеству обменявшихся протонов в предыдущем обмене. Оно оказалось равным взятому для Определение молекулярной массы поли(У) проведено м.н.с.Н.В.Чичко-вой на кафедре химии природных соединений Химического ф-та МГУ. обмена количеству молей изоионного раствора. Этот эксперимент покаг зывает, что в пределах ошибки опыта (не более 2-3%) ионы гидроксо-ния обмениваются на ион щелочного металла.
Таким образом показано, что растворы I содержат чистые по катиону соли, а в растворах II могут содержаться небольшие количества ионов гидроксония в качестве противоионов. Значение рН растворов I и II одинаково: около 6,5. 2.2.4. Определение концентрации полинуклеотидов. Концентрацию полинуклеотидов определяли спектрофотометрическим и потенциометрическим методами. Поскольку фильтрование через ионообменные смолы,: приводящее к удалению примесей ионного характера, может влиять на экстинкцию поли (А) и поли(У), проводили предварительный гидролиз полинуклеотидов при температуре кипящей водяной бани 5% -ной HC0q в течение 30-40 минут. Измеряли оптическую плотность гидролизатов при длине волны 273 нм. Показано, что 27з мало зависит от длительности т т гидролиза. Экстинкция гиполи(А)= г?.зПоли(У)= 7200 200 М см /151/ Определяли концентрацию по измерениям оптического поглощения в максимуме поглощения: А =261 , = 9100 для поли (У) и Л=257 нм, 6 = 10100 для поли (А) /15,26/. Оптическое поглощение измеряли на спектрофотометре СФ-І6. Ошибка определения концентрации спектрофотометрическим методом с учетом ошибки разбавления не превышала 5-7%. Концентрацию изоионных растворов определяли потенциометрическим титрованием. Ошибка потенциометрического титрования не более 1-2%. Определенные тремя способами концентрации хорошо согласуются между собой. 2.2.5. Потенциометрическое титрование. Потенциометрическое титрование проводили на рН метре "рН 340". Раствор титранта подавали с помощью автоматического титратора ЕМВ-116 (ЧССР). Использовали 0,030 и 0,038 М растворы NaOH , приготовленные по методу Зеренсена /152/. Этот метод, позволяющий снизить содержание карбонатов , основан на том, что они плохо растворимы в насыщенном растворе щелочи. Используемый раствор титранта готовили разбавлением насыщенного раствора NaOH , который предварительно отстаивался перед употреблением примерно 6 месяцев. Концентрацию титранта периодически проверяли титрованием фиксанала МС . Перед работой рН метр настраивали по стандартным буферным растворам кислого фталиевокислого калия (рН 4,01), двузамещенного фосфорнокислого натрия (рН 6,86) и кислого виннокислого калия (рН 3,56). В процессе титрования через раствор непрерывно барботировали химически чистый аргон. Перемешивание раствора осуществляли с помощью магнитной мешалки. При титровании Н-поли(А) и Н-поли(У) в присутствии солей растворы КОС, М ги А 0Ь добавляли к изоионным растворам примерно за час до проведения измерений. 2.2.6. Измерение активности ионов серебра.
Потенциомбгрйческое титрование изоионных растворов пож(а): демонстрация трех протонированных форм
На рис.3.3 приведена кривая титрования изоионного раствора поли (А) в координатах рН = 4(г ) Она заметно отличается от кривых титрования М-поли(У) (рис.3.1 и 3.2), а также от кривой титрования изоионного раствора ДНК /156/, наличием участка а с высокой буферной емкостью. Средняя длина участков а8 и Вс по результатам двадцати титрований одинакова и имеет значение ЛГав =ЛГ6с = 0,41±0,02. Средняя длина участка cd. дГС( = 0,18 ±0,02. Все ионы гидрок-сония в изоионном растворе поли (A) (Cp 2,7-I0 u М), получившиеся-при обмене противоионов К+ исходного раствора полиаденилата калия, оттитровываются полностью. Равновесие при титровании изоионных растворов поли(А) устанавливается практически мгновенно, и кривые прямо го"й обратного титрования совпадают. Отмечено, что при титровании К -поли(А) в избытке Ш щелочью при температуре ниже 20С ход кривой титрования зависит от времени /47/. По-видимому, это связано с тем, что равновесие в растворе при . низких температурах устанавливается медленнее. Возможно, что равновесность кривой титрования является особенностью изоионных растворов. Результаты рентгеноструктурного анализа волокон, вытянутых из кислых растворов поли(А) /50/ и дисперсии оптического вращения растворов Ц-поли(А) /52/, позволяют приписать участки кривой на рис.3.3 титрованию различных форм поли(А). Фшч и Клуг /50/ обнаружили две протонированные формы (частично протонированную В-форму и полностью протонированную форму А) на рентгенограммах волокон, по лученных при разных рН в_ кислой области. Адлер и Шасман /52/ нашли, что В-форма полностью переходит в А-форму. Однако, на кривых потен-циометрического титрования К-поли(А) в избытке UCI щелочью различия между А и В формами обнаружены не были /47,52/. Известно, что в нейтральной и слабощелочной средах поли(А) находится в виде одноцепочечной спирали с частично стэкированными ос нованиями /12-16/. Из сказанного можно заключить, что устойчивая при г »I односпиральная форма переходит в двухспиральную на участке ас . Из рис.3.3 видно, что протонирование двухспиральной поли(А) происходит в два этапа. На участке о образуется полупротонированная спираль ( В-форма по /50,52/). На образование этой структуры, в состав которой входит 80% всех адениновых оснований, расходуется 0,5 моля протонов на моль адениновых остатков. Дальнейшее протонирова-ние приводит к образованию полностью протонированной двухспиральной поли(А), в отличие от поли(Ц), где добавление протона в количестве большем, чем 0,5 моля на моль цитозина, дестабилизирует двойную спираль вплоть до полного разрушения /36-38/.
Известно, что температура плавления двухспиральной поли(А) монотонно растет с ростом степени протонирования при всех исследованных концентрациях КС , тогда как для поли(Ц) эта зависимость имеет колоколообразную форму /2/. Поэтому в точке в двойная спираль более устойчива, чем при меньших степенях протонирования. В точке і перегиб выражен слабее, чем в точке С , но поскольку В-форма количественно переходит в А-форму /52/, на образование полупротонированной структуры требуется ровно наполовину протонов меньше, чем на образование полностью протонированной. Ясно поэтому, что точка # должна лежать в середине участка а&с . Это подтверждается статистической обработкой двадцати кривых титрования. Таким образом, в точке i QQPA всей поли (А) находится в форме полупротонированной двойной спирали, а "20% в виде непротонированных одноцепочечных участков. На участке вс происходит дальнейшее протонирование двухспиральных участков, но по-прежнему в растворе присутствует односпиральная непротонированная форма поли(А). Переход от В- к А-форме (участок $с ) менее кооперативен, чем переход от нейтральной формы к полупротонированной (участок ai). Далее будет показано, что это подтверждается характером зависимости рКо. от оС для В- и1А-форм. Принципиальное различие этих форм заключается в том, что протоны в А-форме размещены на соседних основаниях. В В-форме они размещены на чередующихся основаниях, что обеспечивает минимальное отталкивание между положительно заряженными основаниями. Появление протонов на соседних основаниях приводит к скачкообразному возрастанию сил отталкивания. В точке С 80% поли(А) находится в двухспиральной протонированной форме и начинается протонирование одноцепочечных участков, которое заканчивается в точке d . Величины кажущихся рКа для каждой из трех протонированных форм титрующихся групп при- различных степенях нейтрализации (об) рассчитывали по формуле, учитывающей собственную диссоциацию групп полимера где СІ- концентрация групп 1-го типа, равная Ср-Д , ДГ(- длина отрезка на оси Г , соответствующая полному количеству групп данного типа. Например,л Г, =0,18 для групп, титрующихся на участке cd , [Н4] - концентрация НаСҐ-ионов, рассчитанная из измерений рН при данной степени нейтрализации групп I -го типа. Эти величины отложены в зависимости от степени нейтрализации для каждой из трех титрующихся форм поли(А) на рис.3.4.
Экстраполяция на нулевые оС полученных прямолинейных зависимостей позволила определить значения характеристических величин рК: pKj = 3,7±0,2; рК ? = 5,9 0,1; pKg = 7,1±0,1 (приведены величины, усредненные для двадцати кривых титрования). Линейные зависимости на рис.3.4 подтверждают правильность определения точек перегибов на кривых титрования. Количество односпиральной поли(А), определенное из кривой поте-нциометрического титрования (участок cd ) совпадает с количеством, определенным из кондуктометрической кривой титрования, которая приведена на рис.3.5. Начальный криволинейный участок а.5% (дГ = 0,18) можно приписать титрованию адениновых оснований, не входящих в двойную спираль. Кондуктометрическая кривая для ДНК более информативна, чем для поли(А). Это, по-видимому, объясняется тем, что все переходы в ДНК при титровании происходят в области более низких рН. Однако, кривую кондуктометрического титрования поли(А) можно использовать для определения концентрации полимера и доли односпи-ральных участков. Значение pKj для групп, титрующихся на участке cd , близко к значению рК ШФ (3,8 по данным /162/). Отмечено, что если полимер не образует двойных спиралей, его ионогенные группы ведут себя, как в мономере /163/. Очень слабый полимерный эффект Ричарде и соавторы /25/ обнаружили при изучении ионизации поли(У). В этом случае рК полимера сдвинута всего на две десятых в щелочную область по сравнению с рК 2 (3 )УШ. В то же время рК гуанина в поли (Г) сдвинута в щелочную область (по сравнению с рК ГМФ) на две единицы, что является следствием существования поли(Г) в растворе в виде многоцепочечной спирали /164/. Близость pKj и рК АМФ служит доказательством того, что на участке cd титруется одноцепочечная про-тонированная структура, а более высокие значения рК р и рКд по сравнению с рК АМФ свидетельствуют о титровании на участках ав и $с двухспиральных форм. Интересно сопостависть полученные результаты с данными Холкомба и Тимашева /47/ (рис.3.6). Хотя эти авторы проводили титрование в присутствии КС, а при расчете рК не учитывали собственную диссоциацию поликислоты (в то время как формула (3.1) позволяет сделать это), характер кривых I и 2 на рис.3.0 одинаков. Обе кривые рассчитаны в предположении, что титруются группы одного типа. Нелинейный характер зависимости рКа =(оС) свидетельствует о конформационных превращениях . поли(А) в процессе титрования. Разбиение кривой на участки в соответствии с перегибами позволяет получить зависимость рКа от об для каждой формы поли (А) (рис.3.4). Полученные результаты позволяют уточнить интерпретацию кривой титрования изоионного раствора ДНК, приведенную в работе /156/. На кривой титрования ДНК имеются два перегиба и группа, соответствующая второму перегибу (группа с рК 6,7), была приписана протону, поделенному между двумя основаниями, входящими в двухспиральные структуры. Сопоставление кривых титрования изоионных растворов по- ли (А) и ДНК позволяет предположить, что в стабилизации двойной спирали ДНК в изоионном растворе некоторую роль может играть образование внутренней солевой связи, а не только связь через поделенный протон.
Электропроводность бессолевых растворов полинуклеотйдов
Учет вклада растворителя в электропроводность раствора. Эквивалентную электропроводность раствора рассчитывают по формуле: А = (3.2), где Ж и К удельная электропроводность раствора, рассчитываемая по формуле (2.1), и удельная электропроводность растворителя, соответственно. Обычно величину Ж принимают равной Ж чистого растворителя. Более корректно, на наш взгляд, определять эту величину экстраполяцией линейного участка зависимости # от Ср , который имеется в области достаточно низких концентраций полиэлектролита, где уменьшаются межмолекулярные взаимодействия, на нулевую концентрацию полимера. Впервые такой способ определения вклада растворителя в электропроводность раствора был предложен Кузнецовым с сотрудниками /82,119,170,171/. Недавно аналогичный подход использовал Винк /96,110/. Он представил эквивалентную электропроводность раствора как сумму предельной электропроводности и некоторой функции от концентрации полимера F (Ср): Л = = A0 + F(cP) (3.3). Выражая из уравнения (3.3) удельную электропроводность раствора, можно записать: Ж = Ж1 + ЛСр + CpRCp) (3.4). Ясно, что при Ср- -0 Cp-F(Cp) стремится к нулю быстрее, чем АСр (так как Л = consi , a F(Cp)- 0 при Ср-О), поэтому, пренебрегая последним членом в уравнении (3.4), получим: Ж = Ж1 + ЛСР (3.5). Винк предложил использовать уравнение (3.5) для определения Э } а также для оценки Л , для любого полиэлектролита, вид функции F(cp) для которого не установлен, в том случае, если удается измерить электропроводность достаточно разбавленных растворов. В настоящей работе X определяли экстраполяцией линейного участка зависимости X от с? на нулевую концентрацию полимера. На рис. 3.9 приведена зависимость от Ср для солей поли (У) (а), поли(А)-I (б) и поли(A)-11 (в). Из рисунка видно, что отклонения от линей-ности зависимостей Ж от Ср начинаются при Ср 1-1,5 10 М. Величины х определенные из зависимости Л от Ср для солей поли(А) и поли (У), лежат в интервале 3-10 10" ом ІСЇ М""1. На рис.3.10 показана зависимость эквивалентной электропроводности Н-поли(У) и ее солей в координатых Кольрауша: . А = А - АЩ (3.6), где А- константа. На рис.3.II приведена аналогичная зависимость для полирибоаденилатов-1 (а) и II (б), а также для W-поли(А). Из рис.3.II видно, что электропроводность полиаденилатов, полученных первым способом, заметно выше, чем полученных вторым, а различия электропроводностей у первых больше, чем у вторых. Следует отметить аномально низкую для кислоты электропроводность М-поли(А). Для всех полинуклеотидов, как видно из рис.3.10 и 3.II, хорошо выполняется линейная зависимость А от VCp.
Ранее такую зависимость электропроводности от концентрации обнаружили для изоионных растворов ДНК /119,170/ и ее солей /82/, полистиролсульфоновой кислоты /98/ и ее солей /100/. В таблице 3.1 представлены значения предельной эквивалентной электропроводности полирибоуридилатов и полирибоаденилатов-1 и II, полученные экстраполяцией по уравнениям (3.5) и (З.б). Совпадение А&# и АКол,свидетельствует о правомерности учета вклада растворителя экстраполяцией Ж на нулевую концентрацию полимера. Существование линейной зависимости А от VCp для солей поли(У) и поли(А) можно рассматривать как формальное выполнение эмпирического закона Кольрауша, установленного для сильных электролитов. Однако второй закон Кольрауша о независимости ионных составляющих электропроводности, справедливый и для сильных, и для слабых низкомолекулярных электролитов, на первый взгляд, для полинуклеотидов не выполняется. Так, по Кольраушу Л = А + Ар, где Ас и Ар -предельные подвижности противоиона и полииона, соответственно. Для поликислот А существенно меньше предельной подвижности ионов гид- роксония (350 ом смиМ"1): Л Н -поли (А) равно 27 ,Л И-поли (У) 312 ом" см М . Для Ma, К+, C Rb/ полиаденилатов-ІІ значения Латакже ниже соответствующих величин с. Это кажущееся несоответствие устраняется введением коэффициента f из уравнения (І.І): Л = \ Ар + Х\ - Ар + Л с (3.7). Здесь штрихом отмечены "реальные" предельные подвижности противои-она и полииона, которые отражают существующее взаимодействие между полиионом и противоионами даже при бесконечном разбавлении. При таком разбавлении можно пренебречь взаимодействием между полиионами, но взаимодействия внутри некоторого объема, занимаемого полиионом и его противоионами, не исчезают из-за ограничений, налагаемых валентными связями. Даже если концентрация поддерживающего электролита стремится к нулю, согласно Манингу /141/, локальная концентрация противоионов вблизи поверхности полииона нативной ДНК, например, достигает величины 1,2 М.Согласно представлениям, развитым Жероном и Вайсбухом /131,132/, концентрация противоионов в непосредственной близости макроиона является важнейшим параметром распределения противоионов в растворе полиэлектролита. Эта величина резко возрастает с ростом . Она не зависит ни от концентрации, ни от природы поддерживающего электролита, и даже при концен-трации низкомолекулярной соли порядка 10 М остается равной нескольким молям на литр, если значение достаточно велико.
Поскольку величины -f и однозначно связаны (см. уравнение (I.I5) для бессолевых растворов), ясно, что Аси Ар будут отличаться от Лс и Лр при любой концентрации полимера, и их различие определяется только структурой полииона, в частности значением параметра плотности заряда . 3.3.3. Определение предельных подвижностей полииона (Ар для поли (У) и полиаденилатов-1 иТП. Если значение AJ не зависит от природы противоиона, то в соот- ветствии с уравнением (3.7) должна существовать линейная зависимость между предельной эквивалентной электропроводностью полиэлектролита (Л) и предельной подвижностью противоиона в растворе (Лс). Ниже приведены зависимости А от Лс для М-поли(У) и ее солей (рис.3.12) и солей поли(А)-1 и поли(А)-ІІ (рис.3.13). Как видно из этих рисунков, для всех полинуклеотидов выполняется линейность в координатах A=t(A .Наклон прямой на рис.3.12 a -f= 0,77, а отрезок, отсекае- i -Т Р -Т мый на оси ординат, Ар = JAp = 43 ом см М . Поскольку предельная подвижность гидроксония значительно выше подвижностей остальных катионов, погрешность в определении А Н-поли(У) может внести большую ошибку в -f и Ар. Поэтому эти величины определены только для полиуридилатов (рис.3.12 б:здесь отложены те же величины, что и на рис.3.12 а, кроме А \\-поли(У), в большем масштабе). Величины и Ар, определенные из рис.3.12 б, совпадают со значениями, полученными из рис.3.12 а. Линейная зависимость Аот А свидетельствует 0 том, что подвижность полииона не зависит от природы противоиона, даже если в его роли выступает ион гидроксония. На рис.3.13 приведена зависимость А от А для полиаденилатов- 1 (а) и II (б). Значение А Н-поли(А) не ложится на эти прямые, а лежит гораздо ниже. Это объясняется тем, что все противоионы в изо- ионном растворе Н-поли(А) гораздо сильнее связаны, чем в поли(У) или в растворах полиаденилатов. В параграфе 3.2 показано, что все адениновые основания в изоионном растворе протонированы, причем около 80% из них входит в двухспиральные (с рК 6), а "20% - в од- носпиральные участки (с рК 3,8). Поэтому Jf и А. рдля полиаденила тов определяли без учета А М-поли(А). Для полиаденилатов-1 и II выполняются линейные зависимости; наклоны прямых ( , ) равны 0,53 / Т Р —Т и 0,35, а отсекаемые на оси ординат значения Ар 35 и 29 ом car М , соответственно. Из сравнения полученных величин видно, что в растворах солей поли(A)-11 противоионы связаны гораздо сильнее, чем в
