Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Исследуемые объекты и методы их анализа 10
1.1. Пигментно-белковые комплексы тилакоидных мембран хлоропластов 10
1.1.1. Структура тилакоидных мембран 10
1.1.2. Фотосистемы I и II 11
1.1.3. Светособирающие комплексы 13
1.2. Световой стресс и адаптация к нему тилакоидов 16
1.2.1. Световой стресс и фотоингибирование 16
1.2.2. Механизмы защиты от светового стресса 17
1.2.3. Фотодинамика фосфорилирования белков фотосистем 21
1.2.4. Протеомный анализ фотодинамики тилакоидных комплексов 22
1.3. Масс-спектрометрия высокого разрешения в протеомном анализе 24
1.3.1. Роль масс-спектрометрии в анализе протеомов 24
1.3.2. Разрешающая способность и точность измерения масс 28
1.3.3. Масс-спектрометрия ИЦР ПФ 29
1.3.4. Анализ модифицированных белков 33
Глава 2. Анализ белков светособирающих комплексов 38
2.1. Методика проведения эксперимента 38
2.1.1. Создание светового стресса 39
2.1.2. Фракционирование тилакоидных мембран и извлечение светособирающих комплексов 40
2.1.3. Использование методов гель-электрофореза для разделения белков 40
2.1.4. Масс-спектрометрический анализ и идентификация белков 41
2.2. Идентификация белков, разделённых двумерным гель-электрофорезом 41
2.2.1. Применение ионизации методом электроспрей 43
2.2.2. Масс-спектрометрический анализ с использованием метода ионизации MALDI 46
2.2.3. Изменения в белковом составе антенны по данным двумерного гель-электрофореза 48
2.3. Анализ белков после одномерного гель-электрофореза 50
2.3.1. Идентификации сложных белковых композиций 51
2.3.2. Сравнительный анализ белков в композиции 57
2.3.3. Обзор вызванных световым стрессом изменений в светособирающих комплексах 59
Глава 3. Фотодинамика протеома тилакоидных мембран 62
3.1. Протеомный анализ тилакоидных мембран 62
3.1.1. Оптимизация методов пробоподготовки и разделения 63
3.1.2. Хромато-масс-спектрометрический анализ 64
3.1.3. Редкие и светоиндуцированные белки 67
3.2. Фотодинампка фосфорнлирования хлорофилл-связывающих белков 71
3.2.1. Идентификация фосфорилированных белков 72
3.2.2. Фотодинамика фосфорнлирования белков фотосистемы II 76
3.3. Нитрирование и другие фото окислительные модификации 77
3.3.1. Нитрирование 78
3.3.2. Окислительные модификации триптофана 81
3.3.3. Фотодинамика нитрирования тирозина и окисления триптофана 84
Глава 4. Реорганизация фотосинтезирующих комплексов 86
4.1. Разделение и анализ пигментно-белковых комплексов 86
4.1.1. Общая стратегия эксперимента 86
4.1.2. Особенности хромато-масс-спектрометрического анализа и идентификации белков 88
4.2. Редкие хлорофилл-связывагощие белки в структуре фотосистем 89
4.2.1. Состав пигментно-белковых комплексов 90
4.2.2. Локализация редких хлорофилл-связывающих белков 90
4.2.3. Диссоциация комплексов фотосистем 94
4.2.4. Общая характеристика фотодинамических процессов в фотосистемах 96
4.3. Роль фосфорнлирования и нитрирования в реорганизации комплексов 99
4.3.1. Уровни регуляции фотофосфорилирования в комплексах фотосистемы II 100
4.3.2. Роль нитрирования в распаде фотосинтезирующих комплексов 101
4.3.3. Взаимное влияние фосфорнлирования и нитрирования 105
Заключение 108
Выводы 113
Список литературы 114
Приложения 126
- Протеомный анализ фотодинамики тилакоидных комплексов
- Идентификация белков, разделённых двумерным гель-электрофорезом
- Фотодинампка фосфорнлирования хлорофилл-связывающих белков
- Общая характеристика фотодинамических процессов в фотосистемах
Введение к работе
Актуальность темы
Физико-химический процесс поглощения и преобразования энергии света в химическую энергию органических веществ, фотосинтез, осуществляется в хлоропластах зелёных растений и некоторых бактерий и представляет собой совокупность фотофизических, фотохимических и химических реакций. У фотосинтезирующих организмов фотохимические процессы световой стадии фотосинтеза локализованы в энергопреобразующих тилакоидных мембранах. Фотоактивные пигментно-белковые комплексы, интегрированные в липидной мембране, и компоненты электротранспортной цепи взаимодействуя друг с другом образуют высокоорганизованную и структурированную систему.
Фотосинтезирующие аппараты высших растений способны
приспосабливаться, в том числе к освещённости. Изучение совокупности количественных и качественных изменений в тилакоидных мембранах, связанных с адаптацией к внешним условиям, играет решающую роль в понимании экологических аспектов фотосинтеза. Особый интерес вызывает воздействие света высокой интенсивности на функционирование фотосинтезирующих аппаратов. Во время светового стресса угроза необратимого окисления и разрушения является главной опасностью. В этих условиях активируются фотозащитные механизмы, ведущую роль в которых играют взаимодействующие с пигментами белки, которые становятся главными объектами исследований.
Высокая степень организации тилакоидных мембран и большое число компонентов фотосинтезирующих комплексов значительно ограничивают применение как методов структурного анализа функциональных единиц, так и высокоспецифичных методов детектирования входящих в их состав белков. Для изучения таких систем одним из важнейших инструментов становится масс-спектрометрия высокого разрешения. Сочетание масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (ИЦР ПФ) с такими методами ионизации биомакромолекул, как ионизация при электрораспылении (ESI, electrospray ionization) и лазерная десорбция/ионизация из матрицы (MALDI, matrix-assisted laser desorption ionization), а также с современными аналитическими методами разделения, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография
(HPLC, high-performance liquid chromatography) и электрофорез, даёт возможность исследовать такую сложную систему, как тилакоидные мембраны, на молекулярном уровне.
Представленный в работе материал посвящен применению масс-спектрометрии ИЦР ПФ для системного анализа совокупности структурных форм белков, составляющих фотосинтезирующие комплексы, а также исследованию фотофизических и фотохимических процессов, происходящих в тилакоидных мембранах хлоропластов в условиях светового стресса. Особое внимание уделено фотодинамическим процессам в фотосистеме II, осуществляющей окисление воды с образованием молекулярного кислорода, протонов и электронов и наиболее подверженной разрушительному воздействию различного рода радикалов и активных форм кислорода.
Работа выполнена при поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (10-04-13306-RTofi и 09-04-00725-а), программ Министерства образования и науки Российской Федерации (14.740.11.0755, и 16.740.11.0369) и Немецкого научно-исследовательского сообщества (Deutsche Forschungsgemeinschaft, AD92/1-3 LA.).
Цели и задачи работы
Главной целью работы была разработка физико-химических методов анализа совокупности белковых компонентов фотосинтезирующих комплексов с применением масс-спектрометрии высокого разрешения и их практическая реализация для исследования динамических процессов в фотосинтезирующих аппаратов растений в условиях светового стресса. Для её выполнения требовалось разработать методики анализа и оценить их погрешности, найти белки и модификации белков, являющиеся биомаркерами изучаемых процессов, и с их помощью охарактеризовать изменения в пигментно-белковых комплексах под действием светового стресса. В работе были поставлены и решены следующие задачи: (1) подобрать условия пробоподготовки, разделения и масс-спектрометрического анализа с использованием методов ионизации MALDI и ESI, обеспечивающие идентификацию и сравнительный анализ белков в динамическом
диапазоне концентраций 1000 и более; (2) провести протеомный анализ фотосинтезирующих мембран хлоропластов растений до и после светового стресса и выявить среди идентифицированных белков и их модифицированных форм светозависимые; (3) разработать методику разделения функционально активных пигментно-белковых комплексов тилакоидов и последующего хромато-масс-спектрометрического анализа входящих в их состав белков; (4) изучить фотохимические реакции белков в тилакоидных мембранах растений и их влияние на динамические процессы в фотосинтезирующих аппаратах.
Научная новизна
Реализован ряд методик, основанных на масс-спектрометрическом анализе и позволяющих проводить мониторинг белков фотосинтезирующих комплексов в широком динамическом диапазоне концентраций. Методика, сочетающая разделение функционально активных неденатурированных белковых комплексов гель-электрофорезом с последующим хромато-масс-спектрометрическим анализом продуктов их протеолиза в геле, впервые применена для описания фотодинамических процессов в тилакоидных комплексах. На основе хромато-масс-спектров высокого разрешения для соответствующих ионов построены профили распределения для 30 хлорофилл-связывающих белков в пигментно-белковых комплексах растений, адаптированных к условиям низкой освещённости и подвергнутых световому стрессу, и с их помощью выявлены функциональные особенности редких белков.
По результатам протеомного анализа с применением масс-спектрометрии высокого разрешения идентифицированы 278 продуктов нитрирования и окисления аминокислотных остатков тилакоидных белков. Впервые показано, что основным типом фотоокислительных модификаций в фотосинтезирующих аппаратах являются нитрирование тирозина и триптофана и окисление триптофана. С помощью хромато-масс-спектрометрии определены связанные со световых стрессом изменения в уровнях модификаций для 7 фосфорилированных и 23 нитрированных аминокислотных остатков хлорофилл-связывающих белков как в общем белковом составе, так и в составе отдельных субкомплексов, комплексов и суперкомплексов.
Физико-химическими методами изучены неизвестные ранее механизмы адаптации фотосистемы II к условиям освещённости: дифференциальное фосфорилирование антенны, регулирующее как диссоциацию антенны, так и мономеризацию повреждённых димеров и суперкомплексов, нитрирование белка реакционного центра, приводящее к распаду комплексов и суперкомплексов фотосистемы, а также противоположная фоторегуляция фосфорилирования и нитрирования в мономерах, димерах и суперкомплексах.
Практическая значимость
Разработанные методики сравнительного анализа белковой композиции фотосинтезирующих комплексов с применением масс-спектрометрии высокого разрешения могут быть применены при анализе динамических изменений в различных органеллах.
Новый подход к изучению функциональной роли белков путём сравнения профилей их распределения между комплексами, построенных на основе хромато-масс-спектров высокого разрешения, с распределением всех других родственных белков, реализованный в данной работе для хлорофилл-связывающих белков, может быть использован для решения подобных задач в будущем.
Полученные данные по идентифицированным белкам и модификациям, распределению редких, фосфорилированных и нитрированных белков расширяют современные представления о фотоокислительных механизмах в хлоропластах, процессах акклимации, фотоингибирования и реорганизации фотосинтезирующих комплексов.
Личный вклад автора
Материал, представленный в диссертации, получен при непосредственном участи автора как в постановке задачи, так и при проведении исследований и выполнении экспериментов. Диссертационная работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, часть работ одновременно выполнялась автором в Университете Констанц (Германия) в период с 2006 по 2011 год.
Апробация работы
Результаты работы докладывались и обсуждались на следующих Российских и международных конференциях: минисимпозиум «Фотохимия, оптическая спектрометрия, сенсорика», Рицлерн, Кляйнвальсерталь, Австрия, 2006; 8-я Европейская конференция по ИЦР масс-спектрометрии и Российско-Немецкий семинар, Москва, 2007; 30-й Европейский пептидный симпозиум, Хельсинки, Финляндия, 2008; 9-я Европейская конференция по ИЦР масс-спектрометрии, Лозанна, Швейцария, 2010; 4-я Всероссийская конференция-школа «Фундаментальные аспекты масс-спектрометрии и её аналитические применения», Звенигород, 2010; 10-я ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-Вузы «Биохимическая физика», Москва, 2010; 1-я международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 2010; 44-я конференция Немецкого общества масс-спектрометрии, Дортмунд, Германия, 2011.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ: 3 статьи в рецензируемых научных журналах (1 статья входит в перечень журналов, рекомендованных ВАК) и 9 публикаций тезисов в сборниках трудов научных конференций.
Структура и объем диссертации
Протеомный анализ фотодинамики тилакоидных комплексов
Увеличение интенсивности света приводит к усилению миграции белков между тилакоидами граны стромы [63, 64]. В процессе state transitions, N-концевые аминокислотные остатки треонина белков LHCII фосфорилируются при участии киназ STN7 и ТАК [65]. Фосфорилированию подвержены как белки тримеров главной антенны LHCII, так и некоторые белки мономерной антенны (СР29 или LHCB4 для Арабидопсиса) Фосфорилированная фракция диссоциирует от фотосистемы II, расположенной в участках граны, мигрирует к тилакоидам стромы и присоединяется к белку PSBS фотосистемы I [66]. Кроме того, процесс диссоциации антенны фотосистемы II под действием света сопровождается увеличением уровня фосфорилирования белков Dl, D2 и СР43 её реакционных центров. В целом следует отметить, что существуют значительные различия в кинетике фосфорилирования белков фотосистемы II под действием света, что предполагает наличие многоступенчатых (а возможно и многоуровневых) процессов реорганизации. Один из возможных механизмов такой реорганизации представлен на рис. 1.3 на примере зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii [38].
Согласно данному механизму, стабильная структура мегакомплексов фотосистемы II связана с отсутствием фосфорилирования белков LHCII. Наличие таких мегакомплексов подтверждается данными структурного анализа [2, 49]. Данная организация (State 1) характеризуется также высокой долей структурно организованных участков граны. Фосфорилирование белков LHCII приводит к мономеризации мегакомплексов, что сопровождается реорганизацией мембран и уменьшению доли тилакоидов граны (State 2) [66]. Следующим этапом является фосфорилирование мономерной антенны (СР26 и СР29), а также белков реакционных центров (D2 и СР43), что приводит к диссоциации антенны.
Реакционные центры PSII наиболее подвержены воздействию ROS, высокая интенсивность света вызывает их необратимое разрушение. Предполагается, что фосфорилирование/дефосфорилирование белков Dl, D2 контролирует процессы, связанные с утилизацией повреждённых белков и их заменой синтезированными копиями [38, 67].
Реорганизация PSII в процессе state transitions на примере Chlamydomonas reinhardtii [38]. В верхней части рисунка со стороны стромы (сверху вниз) представлены процессы мономеризации мегакомплексов и диссоциации антенны. В нижней части (вид сбоку, параллельно тилакоидной мембране) показаны структурные изменения в тилакоидной мембране.
Протеомный анализ тилакоидных мембран проводится с использованием как хроматографических методов, так и гель-электрофореза [61, 68, 69]. Комбинирование различных методов префракционирования путём двух- или трёхфазной экстракции с использованием водных щелочных, органических и поверхностно-активных детергентов значительно увеличивает количество идентифицированных белков [70-72]. Применение масс-спектрометрии ИЦР ПФ в протеомном анализе хлоропластов позволяет проводить не только идентификацию, но и получать информацию о структуре и модификациях белков [73]. Для выделения многокомпонентных белковых комплексов тилакоидных мембран и их дальнейшего анализа применяется дифференциальное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы с последующей гель-фильтрацией [74, 75], или Blue native двумерный гель-электрофорез [61, 76-78]. Интересным представляется анализ белков главной антенны фотосистемы П. Восемь генетических вариантов белков Lhcbl и Lhcb2, имеющих близкую молекулярную массу и изоэлектрическую точку, разделить методами электрофореза и хроматографии практически невозможно. Функциональные роли отдельных белков LHCII сравнительно плохо изучены, высокая степень их структурного сродства значительно осложняет разделение и анализ. Методы одно- и двумерного полиакриламидного гель-электрофореза, а также Blue-native гель-электрофорез, хотя и успешно применяются в протеомном анализе тилакоидов [61, 70, 76, 79-81], однако показывают недостаточную разрешающую способность при разделении белков LHC в диапазоне масс 22 кДа и 25 кДа. Хромато-масс-спектрометрическая методика с использованием обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) и ионизации методом ESI, применяемая для разделения и анализа мембранных белков фотосистем I и II в тилакоидах позволяет анализировать белки LHC [82-85]. При использовании квадруполя [85] или ионной ловушки [84] в масс-спектрометрическом анализе, молекулярные массы белков главной антенны могут быть определены с величиной стандартного отклонения 2-5 Да. Примечательным является тот факт, что разность между экспериментально полученной и рассчитанной молекулярной массой в некоторых случаях превышает величину стандартного отклонения [84]. Такое несоответствие может быть связано как со сложностью системы, так и с наличием возможных модификаций в белках. Применение масс-спектрометрических методов высокого разрешения в анализе белков LHC явилось одной из задач данной работы.
Идентификация белков, разделённых двумерным гель-электрофорезом
Масс-спектрометрический анализ фосфопептидов обычно комбинируется с высокоэффективной обращённофазной жидкостной хроматографией, используемой для предварительного разделения пептидной смеси. Идентификация фосфопептидов основана на точном определении массы и заряда иона, а также на основе специфических ионов полученных в результате фрагментирования. Для фрагментирования ионов фосфопептидов обычно используют столкновительную диссоциацию (CID). СЮ масс спектр положительно заряженных ионов состоит из дефосфорилированного молекулярного иона (-Н3РО4) и продуктов распада боковой цепи фосфорилированных и дефосфорилированных ионов. Наличие в спектре интенсивного сигнала соответствующего с учётом величины заряда является специфичным и может быть использовано для быстрого поиска фосфопептидов. Локализация фосфатной группы основана на - фрагментах соответствующих продуктам распада боковой цепи фосфопептида. Недостатком такого метода является низкая интенсивность сигналов фрагментов фосфопептидов по сравнению с (М-Н3РО4). Альтернативно может проводиться фрагментация иона соответствующего (М-Н3Р04) приводящая к спектру состоящему только из фрагментов разрыва боковой цепи (neutral loss-dependent MS ). Для поиска фосфопептидов при измерении отрицательно заряженных ионов используется фрагмент m/z 79 (НРО3)". Данный вид анализа (precursor ion scaning) отличается высокой чувствительностью и используется в квадрупольных масс-спектрометрах. Для определения фосфотирозина на гибридных масс-спектрометрах с относительно высокой разрешающей способностью используется ион фосфотирозин иммония m/z 216.098.
Окислительные модификации образуются прежне всего в результате реакции с реактивными соединениями кислорода и связаны с образованием различного рода продуктов, образующихся как в результате реакции боковых цепей, так и сопровождающиеся разрывом пептидной цепи. Продукты реакции боковых цепей могут быть относительно легко определены в результате масс-спектрометрического анализа. Наиболее изученными в настоящее время являются реакции белков с гидроксил радикалом, которые используются для изучения структуры макромолекулярных комплексов [114]. Активность боковых цепей аминокислотных остатков в реакции с гидроксил радикалом уменьшается в ряду [115]:
Наиболее реакционноспособными являются серосодержащие цистеин и метионин [116]. Примечателен тот факт, что цистеин практически не содержится в тилакоидных белках, а метионин быстро восстанавливается редуктазами [117]. Необратимое окисление ароматических триптофана, тирозина и фенилаланина катализируется коротковолновым светом и является наряду с окислением гистидина основными реакциями тилакоидных белков.
Многокомпонентными белковыми комплексами тилакоидных мембран хлоропластов являются фотосистемы I и II (PSI и PSII), цитохромный комплекс Ь6/и АТРазный комплекс. Для разделения и анализа таких комплексов в данной работе было использовано центрифугирование в градиенте сахарозы. Применение различных градиентов позволяет селективно извлекать комплексы, наличие окрашенных пигментов облегчает детектирование фотосистем I и И. Поскольку каждая фотосистема состоит из собственно реакционного центра и ассоциированных вокруг него светособирающих или антенных комплексов (LHCI и LHCII) в разной степени связанных с центром, извлечение каждой из фотосистем в градиенте сахарозы приводит к образованию двух зелёных полос. Верхняя полоса соответствует антенным комплексам , нижняя -суперкомплексам (PSI-LHCI или PSII-LHCII).
Целью приведённых в данной главе экспериментов было более полное описание как белкового состава антенных комплексов LHCII, так и количественных изменений в них под действием светового стресса. Извлечение LHCII проводилось центрифугированием в градиенте сахарозы. Для последующего протеомного анализа суперкомплексов был использован одно- и двумерный гель-электрофорез с последующим протеолизом белков трипсином и масс-спектрометрическим анализом образующихся пептидов. Поскольку целью протеомного анализа было исследование изменений в суперкомплексах под действием светового стресса, анализ был проведён параллельно для растений, подвергшихся световому стрессу и растений, не подвергшихся световому стрессу. Идентификация белков проводилась по результатам масс-спектрометрического анализа с помощью методов ионизации MALDI и ESI. Сравнительная оценка изменений в протеомном составе исследуемой системы была проведена как по данным двумерного гель-электрофореза, так и на основе масс-спектрометрического анализа. Схема протеомного анализа приведена на рис. 2.1.
Фотодинампка фосфорнлирования хлорофилл-связывающих белков
Применение сравнительного масс-спектрометрического анализа подтвердило ранее полученные результаты об увеличении количества фибриллина 1, белка HCF136, а таюке двух белков комплекса фруктозы-бисфосфат альдолазы (FBA). Увеличение доли фибриллина 6 и белков малой антенны не подтвердилось. В целом влияние светового стресса на исследуемую систему можно разделить на несколько групп.
В первую группу можно включить общие изменения, вызванные дисбалансом Увеличение доли белков, участвующих в ассимиляции С02, таких как RuBisCO (рубилоза-бисфосфат карбоксилаза оксигеназа) и FBA, сопровождается уменьшением доли переносчиков электронов LFNR (ферредоксин-МАХ)Р+ редуктаза).
В следующую группу, связанную с противодействием оксидативному стрессу и исправлением его последствий, можно включить увеличение количества АРХ (аскорбат пероксидаза) и фибриллинов. Аскорбат пероксидаза катализирует антиоксидативные процессы, а фибриллины, являясь структурными компонентами мембран, участвуют в их «ремонте». Примечательно, что только два из шести идентифицированных фибриллина были определены как светозависимые.
Третья группа охватывает процессы, связанные с реорганизацией реакционных центров фотосистемы II. Уменьшение доли белка PSBA реакционного центра, традиционно являющегося «первой жертвой» светового стресса [4], сопровождается увеличением количества белков PSBC и PSBB, являющихся «соседями» PSBA в фотосистеме II, и белка HCF136, ответственного за процессы реорганизации фотосистемы II, связанные с заменой повреждённых белков PSBA и PSBD [62]. Следует отметить, что лишь небольшая часть реакционных центров находится в данных фракциях градиента сахарозы, что подтверждается отсутствием видимых пятен белков PSBA, PSBD, PSBC и PSBB на электрофореграмме двумерного гель-электрофореза. С другой стороны, количество белка HCF136 в данной фракции достаточно велико. Всё это говорит о том что исследуемые фракции содержат не активные реакционные центры, а скорее промежуточные продукты их реорганизации. В предыдущих исследованиях [61] было установлено, что накопление белков PSBC и PSBB в процессе замены повреждённых белков PSBA и PSBD в условиях светового стресса связано с медленным распадом белков PSBC и PSBB из повреждённых реакционных центров. В другой работе [62] было показано, что белок HCF136 непосредственно участвует в стабилизации переходных комплексов реакционного центра и входит, наряду с белком D2, в состав таких переходных комплексов. Полученные в данной работе результаты показывают примерно двукратное увеличение количества трёх белков PSBC и PSBB и HCF136 под действием светового стресса в исследуемых фракциях, что указывает на возможную связь между этими белками. К сожалению, низкая разрешающая способность при разделении в градиенте сахарозы не позволяет дать ответа на вопросы, образуют ли данные белки комплекс, и если да, то каков состав такого комплекса.
Четвёртая группа связана с процессами, происходящими в фотосистеме I. Считается , что данная фотосистема почти не подвержена изменениям, связанными с изменениями в интенсивности света. Исключением является процесс «state transitions» [59], при котором внешняя популяция LHCII фосфорилируется и мигрирует от граны к ламмеллам стромы тилакоидной мембраны, где находится фотосистема I. Предполагается, что структурные единицы PSAH, PSAL, PSAK фотосистемы I участвуют в образовании связей с LHCII [37, 60]. По результатом анализа именно эти три белка показывают изменения, связанные со световым стрессом, причём количество PSAL увеличивается, a PSAH и PSAK уменьшается. Увеличение доли PSAL сопровождается близким в количественном отношении увеличением доли белков ОНР1 и ОНР2, по крайней мере один из которых связан с фотосистемой I [48]. Данные результаты хотя и являются интересными, нуждаются в дальнейшей проверке.
К пятой группе изменений можно отнести синтез белков ELIP1 и ELIP2 под действием светового стресса. Исследуемые фракции градиента сахарозы содержали практически полную популяцию данных белков, собственно говоря весь процесс фракционирования был оптимирован для их выделения. Так как основными компонентами данных фракций были белки LHCB, то полученные результаты подтверждают данные предыдущих исследований, показывающие, что ELIPs входят в состав комплексов LHCII [42], но, к сожалению, не добавляют к ним ничего нового. Причиной этого является тот факт, что при центрифугировании в градиенте сахарозы подавляющая часть антенны находится в одной фракции, что не позволяет проводить различия между различными частями антенны. В связи с этим, при дальнейших исследованиях были применены другие методы разделения пигментно-белковых комплексов.
В заключение следует отметить, что применяемая методика на основе одномерного гель-электрофореза и масс-спектрометрического анализа при помощи MALDI позволила хорошо охарактеризовать исследуемую систему. Дальнейшим направлением работы был анализ белков в более сложных системах, что напрямую связано с усложнением масс-спектрометрического анализа. Целью данного этапа работы была возможно более полная характеристика белков тилакоидных мембран и определение изменений как в белковом составе, так и связанных с модификациями боковых цепей белков. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. обеспечить возможно более полное соответствие анализируемой пробы исследуемой системе, т.е исключить потери белков во время пробоподготовки и разделения; 2. идентифицировать возможно большее количество белков, в том числе редких и ранее не определённых; 3. провести поиск всех возможных модификаций белков. Успешное выполнение поставленных задач прежде всего связано с эффективностью масс-спектрометрического анализа. По сравнению с предыдущими исследованиями значительно возросли как сложность объекта, так и требования к самому анализу. Всё это потребовало внести качественные изменения в методику масс-спектрометрического анализа, касающиеся используемых методов, приборов и программного обеспечения.
Общая характеристика фотодинамических процессов в фотосистемах
В результате хромато-масс-спектрометрического анализа были установлены значительные различия в количествах белков PSBA, PSBD и PSBC центра PSII в образцах LL и HL (таб. 4.1.). Это подтверждает предыдущие наблюдения, показывающие, что PSII является основной «мишенью» светового стресса при нормальной температуре [67]. Значительное снижение количества белков PSBA, PSBB и PSBD в неассоциированных субкомплексах PSII (BN-PAGE, полосы 1 и 2) в образцах HL по сравнению с LL (таб. 4.1.), может быть связано с ускоренным оборотом центра PSII в условиях сильной освещённости и ограничивающей роли синтеза de novo [61]. Распределение белка PSBC центральной антенны между комплексами отличается от распределения белков PSBA и PSBD реакционного центра. В условиях LL 33% и 21% от популяции PSBC было сосредоточено в полосах 4 и 5 BN-PAGE, соответственно, содержащих димеры PSII и суперкомплексы PSII-LHCII, и только 4% было найдено в полосе 1, соответствующей неассоциированным субкомплексам (таб. 4.1.). После светового стресса распределение белка PSBC в полосах 1, 4 и 5 стало 46%, 18% и 4%, соответственно, а количество белка в полосе 1 BN-PAGE увеличилось в 16 раз по сравнению с LL (таб. 4.1.). Согласно [61], белок PSBC только слабо связан с центром PSII и диссоциирует после повреждения реакционного центра световым стрессом перед распадом комплекса PSII. Увеличение количества PSBC в полосе 1 BN-PAGE и в популяции LHCII (таб. 4.2.) подтверждает данную точку зрения. Количество белка PSBC в неассоциировапной популяции (BN-PAGE, полоса 1) в условиях HL значительно превышает количество других белков центра PSII, таких как PSBA, PSBB и PSBD, что указывает на высокую стабильность данного белка в неассоциированной популяции.
Было показано, что белки внешней антенны LHCB3 и LHCB5 более тесно связаны с центром PSII чем белки LHCB1-2 [37, 38]. Большие количества белков LHCB3 и LHCB5, но не белков LHCB1-2 в полосе 1 в условиях HL (таб. 4.1.) подтверждает данные наблюдения.
К сожалению, нельзя исключать, что некоторые различия в распределении белков PSBC, PSBS и LHCB3-6 между суперкомплексами и неассоциированной популяции PSII в условиях HL по сравнению с LL (таб. 4.1.) могут возникнуть в процессе растворения материала тилакоидных мембран [165]. Световой стресс приводит к значительным изменениям в структуре мембран [64], что может дополнительно влиять на пробоподготовку. Существует вероятность, что неассоциированные субкомплексы PSII, содержащие PSBC, могут в процессе пробоподготовки ассоциироваться с суперкомплексами, что приводит к увеличению количества PSBC в суперкомплексах в условиях LL (таб. 4.1.).
Белок LHCB4 соединяют тримеры LHCII с центром PSII и стабилизирует димер PSII, связывая один мономерный центр с тримером LHCII другого мономерного центра, и играет, таким образом, важную роль в регулировании потоков возбуждённой энергии и в процессе её преобразования в теплоту (non-photochemical quenching, NPQ) [165]. Белок PSBS, являющийся частью внешней антенны PSII участвует в быстрой фазе NPQ [166]. Однако, в отличие от LHCB4, PSBS не ассоциирован стабильно с суперкомплексом и не влияет на образование и стабильность супер комплексов [165]. Светозависимая обратимая диссоциация пентамерного суперкомплекса LHCII, состоящего из мономеров LHCB4 и LHCB6 и тримера LHCII, регулируемая белком PSBS, была отмечена в связи с NPQ [167]. Примечательно, что белки LHCB4, LHCB6 и PSBS содержатся в суперкомплексах в условиях HL в значительно больших количествах, чем другие белки PSII. Это может быть связано с увеличением доли NPQ, что является характерной особенностью фотосинтеза в условиях светового стресса [166].
В предыдущих исследованиях было установлено, что ELIPs являются частью мономеров и тримеров LHCII в условиях светового стресса [42]. Предполагалось, что ELIPs накапливаются в основном в повреждённых комплексах PSII, находящимся в стадии ремонта [42]. В данной работе показано, что ELIP1 и ELIP2 после облучения HL локализованы в BN-PAGE полосах 1 и 3-5, при этом наибольшее количество белка (37-42%) содержится в полосах 4 и 5, представляющих собой, соответственно, димеры PSII и суперкомплексы PSII-LHCII (таб. 4.1.). Значительно меньшие количества ELIPs (3-5%) были детектированы в полосе 1, содержащей неассоциированные субкомплексы. Белки ELIPs, также как и белок PSBS, накапливаются в суперкомплексах в условиях светового стресса, по сравнению с условиями LL, в большей степени, чем другие белки антенны PSII. Количества ELIPs в BN-PAGE полосе 1 в условиях HL сравнимо с количеством LHCB1-2 и LHCB4. Значительные количества ELIPs были также детектированы во фракции LHCII градиента сахарозы (рис. 2.8.). Данные наблюдения подтверждают гипотезу [42], что ELIPs, действуя как часть антенны PSII, вместе с PSBS способствует регуляции NPQ в суперкомплексах PSII-LHCII.
Профили распределения белков LHCA между комплексами и субкомплексами PSI показали отличия в распределении редкого белка LHCA5 от распределения других белков реакционного центра и антенны PSI. Значительные количества белка LHCA5 были найдены в суперкомплексах PSI-LHCI (BN-PAGE, полоса 5, таб. .4.1.), что предполагает возможную роль данного белка во взаимодействиях в суперкомплексах PSI-LHCI. Белок LHCA5 действительно значительно отличается от других белков антенны PSI. В отличие от других транскриптов LHCA, транскрипт LHCA5 регулируется в сторону увеличения в условиях HL [168]. Белок LHCA5 отличается уникальной стехиометрией пигментов, взаимодействия между LHCA1 и LHCA5 значительно слабее, чем между LHCA1 и LHCA4 [169]. Предполагается, что LHCA5 либо заменяет LHCA4, либо дополнительно связывается с PSI, осуществляя таким образом акклимацию к изменениям в качестве и количестве света. Большие количества LHCA5 в BN-PAGE полосе 3, по сравнению с другими белками LHCA поддерживает данную гипотезу и показывает, что LHCA5 только слабо взаимодействует с комплексом PSI.
Белок ОНР2, близкий к LHCA4, по-видимому ассоциируется с PSI [48]. Ничего не известно о локализации ОНР1. В данной работе белки ОНР1 и ОНР2 были обнаружены в популяции LHCII, и их количество в данной популяции значительно больше в образце HL (таб. 4.2.). Количество OHPs под действием светового стресса возросло в неассоциированных субкомплексах и снизилось в фотоактивных комплексах (BN-PAGE, полосы 1 и 4, соответственно). Белки LHCA также были найдены в популяции LHCII, и их количество также было увеличено в образцах HL в неассоциированных субкомплексах. Согласно полученным данным, белки LHCA1-3 сильнее связаны с PSI, чем LHCA5, ОНР2 и, возможно, ОНР1. Большие количества OHPs, по сравнению с LHCA, в BN-PAGE полосах 1-3 содержащих неассоциированные субкомплексы PSI (таб. 4.1.), увеличение их количества в популяции LHCII и уменьшение в комплексах и суперкомплексах PSI (таб. 4.2.) поддерживает гипотезу, что ОНР2 и, возможно, ОНР1 могут присоединяться к тримерам LHCII, ассоциированным с PSI в процессе «state transition».
