Содержание к диссертации
Введение
I. ДРЕВЕСНЫЕ НЕМАТОДЫ РОДА BURSAPHELENCHUS КАК ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ 8
1.1. Карантинные требования стран-импортеров российской лесопродукции к древесным нематодам и вредителям хвойных пород 8
1.2. История изучения древесных нематод 11
1.3. Хозяева и симптомы заболевания 15
1.4. Биологические особенности и экология нематод Bursaphelenchus xylophilus и В. mucronatus 18
1.5. Меры борьбы, применяемые против сосновой древесной нематоды в странах ее распространения 25
II. МЕТОДИКА И ОБЪЕМ ВЫПОЛНЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.. 27
2.1. Метод сбора и анализа древесных проб и культивации выделенных нематод рода Bursaphelenchus 27
2.2. Метод сбора потенциальных переносчиков древесных нематод - насекомых, и выделения из них нематод 31
III. РАСПРОСТРАНЕНИЕ ДРЕВЕСНЫХ НЕМАТОД 33
3.1. Распространение древесных нематод в мире 33
3.2. Климат стран происхождения и распространения древесных нематод 35
3.3. Климат районов проведения экспериментальных работ 42
3.4. Результаты изучения распространения древесных нематод в России 46
IV. ПЕРЕНОСЧИКИ ДРЕВЕСНЫХ НЕМАТОД 55
4.1. Насекомые, отмеченные в качестве переносчиков нематод Bursaphelenchus xylophilus и В. mucronatus 55
4.2. Потенциальные переносчики нематод B.xylophilus и B.mucronatus в России 59
4.3. Результаты изучения роли насекомых в распространении древесных нематод 60
V. ВОЗМОЖНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ ГИБРИДОВ ДРЕВЕСНЫХ НЕМАТОД 63
5.1. Опыты зарубежных исследователей по проверке скрещиваемости нематод Bursaphelenchus xylophilus и Bursaphelenchus mucronatus (Nematoda: Aphelenchoididae) 63
5.2. Метод проведения эксперимента по скрещиванию древесных нематод 69
5.3. Результаты эксперимента по гибридизации древесных нематод 72
VI. РЕЗУЛЬТАТЫ ОЦЕНКИ ПАТОГЕННОСТИ ДРЕВЕСНЫХ НЕМАТОД ДЛЯ ДЕРЕВЬЕВ ХВОЙНЫХ ПОРОД В РОССИИ 79
6.1. Общие сведения о патогенности древесных нематод 79
6.2. Метод проведения экспериментов по патогенности древесных нематод для саженцев сосны 85
6.3. Результаты опытов по проверке патогенности древесных нематод 88
VII. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРОВЕДЕНИЮ КАРАНТИННЫХ ОБСЛЕДОВАНИЙ И ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРЕДОТВРАЩЕНИЮ ЗАНОСА И РАСПРОСТРАНЕНИЯ
НЕМАТОДЫ BURSAPHELENCHUS XYLOPHILUS НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 99
7.1. Рекомендации по проведению карантинных обследований 99
7.2. Инструкция по предотвращению заноса и распространения сосновой древесной нематоды на территорию Российской Федерации 102
ВЫВОДЫ 107
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 109
ПРИЛОЖЕНИЯ 123
- Карантинные требования стран-импортеров российской лесопродукции к древесным нематодам и вредителям хвойных пород
- Метод сбора и анализа древесных проб и культивации выделенных нематод рода Bursaphelenchus
- Распространение древесных нематод в мире
- Насекомые, отмеченные в качестве переносчиков нематод Bursaphelenchus xylophilus и В. mucronatus
- Опыты зарубежных исследователей по проверке скрещиваемости нематод Bursaphelenchus xylophilus и Bursaphelenchus mucronatus (Nematoda: Aphelenchoididae)
Введение к работе
Актуальность темы. Россия, обладая огромными лесными ресурсами, шяется одним из основных поставщиков хвойных лесоматериалов в )льшинство стран мира. В связи с этим возникают многочисленные проблемы ірантинного порядка, вызванные боязнью государств-импортеров российской >евесины завезти к себе опасных, но пока отсутствующих на их территории, іедителей леса и лесоматериалов. При этом наиболее часто требования іставляются по стволовым вредителям и по сосновой древесной нематоде.
Нематода Bursaphelenchus xylophilus, которая в течение последнего олетия являлась причиной массовой гибели сосновых деревьев в Японии и НА /Mamyia 1984, 1986, 1987/ представляет наибольшую опасность для ойных лесов, поэтому большинство стран включило в карантинные списки и у нематоду, и ее основных переносчиков - усачей рода Monochamus /Linit 88,1990/. Для России этот вид входит в перечень 1.А. карантинных ганизмов, отсутствующих на территории страны. Учитывая огромную ологическую и экономическую значимость хвойных насаждений России, учение этого карантинного вида является на сегодняшний день одним из лых актуальных вопросов лесного карантина.
На территории России широко распространен вид-двойник сосновой евесной нематоды Bursaphelenchus mucronatus, поражающий все виды эйных пород, составляющих лесной фонд Российской Федерации. Считается, э этот вид не является патогенным для леса, однако выявление роли этого ганизма и его переносчиков в лесопатологических процессах является также маловажной темой научных исследований.
Цель исследования — изучить возможность акклиматизации сосновой гвесной нематоды на территории Российской Федерации, определить пути ее ;пространения в случае заноса на территорию страны и степень опасности, гдставляемой этим организмом для российских лесов.
Для этого решались следующие задачи:
Сбор и анализ древесных проб в различных регионах России и культивация выделенных нематод рода Bursaphelenchus.
Сбор потенциальных переносчиков древесных нематод - насекомых, и выделение из них нематод.
Изучение возможности образования внутри- и межвидовых гибридов древесных нематод рода Bursaphelenchus.
Проверка патогенносте древесных нематод Bursaphelenchus xylophilus и В.mucronatus и их гибридов для саженцев сосны обыкновенной.
- Разработка рекомендаций по проведению карантинных обследований и инструкции по предотвращению заноса и распространения нематоды Bursaphelenchm xylophilus на территории Российской Федерации Научная новизна. Впервые проведено изучение распространения нематод рода Bursaphelenchus на территории Сибири и Европейской части России. Проведенными исследованиями установлено, что нематода B.xyIophilus на территории России отсутствует. Напротив, древесная нематода B.mucronatus обнаружена во всех обследованных районах. Впервые в мировой практике проведено скрещиваниее российских популяций B.mucronatus с популяциями В xylophilus и B.mucronatus из других стран мира. Гибриды указанных популяций успешно размножились в лабораторных условиях. Выявлены насекомые-переносчики указанных нематод в РФ и проведены опыты определению их патогенности для хвойных пород на территории страны. В ходе исследований выяснено, что древесные нематоды не представляют опасности для лесных насаждений РФ, однако способны выживать и размножаться в климатических условиях средней полосы России. Тем самым доказана опасность, представляемая древесными нематодами для экономики страны в качестве объекта, вызывающего фитосанитарные санкции стран-импортеров лесолродукции.
Практическая ценность работы. Разработанная на основании проведенных исследований методика по сбору, выделению и определению нематод в лесах России, и правила по ввозу и карантинному досмотру древесной продукции из стран распространения B.xylophilus. внедрены в практику работы Госинспекции по карантину растений РФ. Эта методика позволяет успешно осуществлять защиту стратегической безопасности страны. Апробация работы. Основные материалы работы доложены на двух международных Симпозиумах Российского общества нематологов (1997 год -Москва, 1999 год - Санкт-Петербург), на совещании "Проблемы лесной фитопатологии и микологии" (Москва, 1997), на международном симпозиуме "Устойчивость сосновых лесов к увяданию сосны" (Токио, 1998) , на научной конференции МГУЛ (Москва, МГУЛ, 1999 г). Правила по ввозу и досмотру древесной продукции успешно внедрены в практику работы Государственной инспекции по карантину растений Российской Федерации.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ. Объем работы. Диссертация изложена на 133 стр. машинописного текста, содержит 39 таблиц, 8 рисунков и графиков и состоит из введения, 7-ми глав, включая рекомендации по проведению карантинных обследований, выводов, списка использованной литературы, включающего 127 источников, втом числе 91 на иностранных языках, и приложений.
Карантинные требования стран-импортеров российской лесопродукции к древесным нематодам и вредителям хвойных пород
На сегодня в нашем распоряжении имеются карантинные требования 47 стран мира. Помимо древесных нематод B.xylophilus и B.mucronatus (Nematoda: Aphelenchoididae), которые являются хорошо известными карантинными объектами, связанными с импортом и экспортом древесины хвойных пород, требования часто касаются вредителей, в отсутствии которых можно быть уверенным лишь при полной очистке лесоматериалов от коры (в основном это относится к стволовым вредителям - представителям семейств короедов -Scolytidae, усачей - Cerambycidae, и долгоносиков - Curculionidae), или же при обработке древесины по методу Kiln drying.
В Приложении 1. представлен видовой состав лесных вредителей, распространенных на территории РФ, к которым предъявляют требования страны-импортеры российской древесины с указанием пищевой специализации и распространения в пределах бывшего СССР /Council Direktive 77/93 EEC, Smith et al, 1996; Штакельберг, 1955; Воронцов, 1982/. Биологические особенности этих вредителей подробно описаны в монографиях советских ученых /Мозолевская и др, 1991; Гусаковский, 1935; 1947; Плавильщиков, 1940, 1958; Бей-Биенко, 1965; Логовиновский, 1985; Медведев Г.С, 1978, 1986; Медведев СИ., 1951; Кожанчиков, 1950; Холодковский, 1915; Черепанов, 1979, 1985; Мамаев, 1985/. Необходимо отметить, что из числа стволовых вредителей, представленных в Приложении 1, наиболее биологически активными видами являются Dendroctonus micans, Ips typographies, лубоеды рода Tomicus, долгоносики родов Hylobius и Pissodes. Большую опасность представляют усачи рода Monochamus, способствующие распространению нематод рода Bursaphelenchus /Кулинич, Орлинский, Колосова, 1996/.
В 1991 году в американском издании /Pest Risk Assessment, 1991/ были приведены интересные данные - списки насекомых, найденных в неокоренной древесине, импортируемой из азиатской части России шведскими, японскими и корейскими исследователями. Эти данные показывают, какие же именно насекомые могут быть завезены в другие страны с лесоматериалами.
В таблице 1.1. приведен список короедов, обнаруженных в российских хвойных лесоматериалах неевропейского происхождения. Эта группа выбрана нами в связи с тем, что именно короеды чаще всего встречаются на лесоматериалах.
Нельзя не обратить внимание на то, что карантинные для стран-импортеров виды короедов, вывозимые с древесиной (эти виды в таблице выделены меткой) распространены в большинстве своем не только по всей России, но и во всех хвойных лесах Евразии. Был отмечен перенос 10 азиатских видов короедов, но все они являются типично вторичными, не имеющими экономического значения /Воронцов, 1982; Гусев и др., 1961; Маслов, 1988; Лер, 1996; Спесивцев, 1923/.
Метод сбора и анализа древесных проб и культивации выделенных нематод рода Bursaphelenchus
В ходе полевых исследований в 7 российских регионах (табл. 2.1.) проводился отбор древесных проб с целью обнаружения нематод рода Bursaphelenchus. На рисунке 2.1. показаны районы отбора проб. В таблице 2.1. представлен список регионов, где проводился отбор проб, с указанием породного состава древесного материала. Пробы отбирались с усохших или срубленных деревьев в лесу и на складах лесоматериалов. При сборе проб отмечалось наличие ходов различных стволовых вредителей. Для взятия пробы на исследуемом дереве ножовкой делались два поперечных надпила на расстоянии 5-10 см. друг от друга, глубиной 1-5 см. Затем с помощью топора откалывался кусок древесины между сделанными надпилами. На пробе делалась запись с указанием района, даты и древесной породы. Пробы откладывались каждая в отдельный бумажный пакет.
Выделение нематод из древесных проб проводилось в Институте Паразитологии РАН в лабораторных условиях по методу воронок Бермана /Baermann, 1917/. С помощью топорика и секатора пробы измельчались на кусочки 5x5 мм (такого размера вполне достаточно, чтобы нематоды благополучно выделились). Измельченные пробы ставились на выделение в пластмассовые (или стеклянные) воронки по следующей схеме:
В воронку вставлялось маленькое металлическое ситечко, на которое был положен кусочек марли, а затем измельченная древесина так, чтобы верхний слой древесины не превышал высоты стенок воронки. На нижний конец воронки надевалась резиновая трубка с соответствующим диаметром, длиной около 5 см. В свободный конец трубки вставлялась пустая пробирка. При этом трубка и воронка, а также трубка и пробирка были соединены настолько плотно, чтобы в местах соединения не просачивалась вода. Затем воронка с древесиной заливалась тонкой струей воды так, чтобы вода смачивала верхний слой древесины. Воронки с водой ставились в специальную подставку с отверстиями (в полевых условиях в качестве подставки использовалась пустая бутылка из под минеральной воды). Выделение нематод осуществлялось в течение 12 часов при температуре +25С.
Распространение древесных нематод в мире
За неделю до сбора насекомых в маленькие чашки Петри был посеян гриб Botrytis cinerea (при эксперименте на Урале от момента посева гриба до момента лабораторной обработки насекомых прошло 3 недели). Питательная среда - сусло-агар. Чашки с грибом были помещены в термостат, при температуре +25С. К моменту сбора насекомых на чашках Петри образовался тонкий слой мицелия.
Насекомые были расчленены, и поставлены (по одной особи на воронку) на выделение в воду по методу Бермана. Через сутки выделившиеся нематоды были рассмотрены под бинокуляром. Сложность данного процесса вызвана тем, что в момент переноса древесных нематод усачами они находятся в специфической четвертой стадии развития, и видовую принадлежность определить достаточно трудно. Фауна же нематод в усачах достаточно разнообразна. Поэтому выделившиеся нематоды были условно разделены на 2 группы - нематод и личинок, точно не являющихся личинками Bursaphelenchus и личинок, похожих по описанию на четвертую стадию развития изучаемых нематод. Особи, похожие на личинок Bursaphelenchus, были посчитаны и посажены в чашки Петри, на гриб. Причем особи, выделенные из разных насекомых, были помещены в отдельные чашки. Чашки Петри с нематодами были поставлены в термостат, в прежние условия. Через неделю чашки Петри были вынуты из термостата, нематоды выделены по методу Бермана и определены под микроскопом. Следует отметить, что все особи, определенные ранее предположительно как личинки Bursaphelenchus, в завершение опыта развились в имаго этого вида.
Методы исследования возможности образования гибридов нематод и методы проверки патогенности древесных нематод и их гибридов для саженцев хвойных пород, для удобства изложены в соответствующих главах диссертации.
Насекомые, отмеченные в качестве переносчиков нематод Bursaphelenchus xylophilus и В. mucronatus
Перенос сосновой древесной нематоды с дерева на дерево осуществляется при дисперсионном пути ее развития представителями отряда Coleoptera (жуки), преимущественно - усачами рода Monochamus. В то же время особи B.xylophilus обнаруживались и в других жуках, относящихся к семействам усачей (Cerambycidae), златок (Buprestidae) и долгоносиков (Curculionidae) /Link, 1988, 1990/, которые, однако, не считаются специфичными переносчиками, и их роль в переносе нематод весьма мала. Во время нахождения насекомого в куколочной камере, личинки нематод, перешедшие в третью (дисперсионную) стадию, скапливаются вокруг нее, размещаясь не только в осевых и радиальных смоляных каналах, но и в трахеидах /Mamiya & Enda, 1979/. Перед вылетом имаго нематоды переходят в стадию трансмиссионных личинок (L4) и заселяют трахейную систему жуков. Выход нематод из жуков происходит во время их дополнительного питания на ветках хвойных деревьев или во время откладки яиц самками.
Для оценки риска проникновения СДН на территорию России посредством переноса насекомыми необходимо проанализировать видовой состав насекомых, зарегистрированных в качестве переносчиков СДН во всем мире и, основываясь на этих данных, выделить группу видов насекомых, которые являются потенциальными переносчиками СДН на территории России. Кроме этого необходимо знать, какие виды насекомых переносят близкородственный СДН вид - B.mucronatus.
В качестве переносчиков B.xylophilus были зарегистрированы следующие виды жуков:
В Японии - Monochamus alternatus, M.nitens, M.saltuarius, Acaloptera fraudatrix, Acanthocinus griseus, Arhopalus rusticus, Corymbia succedanea, Spondylis buprestoides, Uraecha bimaculata, Asemum spp., Rhagium spp /Mamiya, 1984; Morimoto & Iwasaki, 1972; Linit, 1988, 1990; Smith et al., 1996/. В Китае и Тайване - Monochamus alternatus.
В США и Канаде - Monochamus carolinensis, M.marmoratos, M.obtusus, M.scutellatus, M.titillator, M.mutator, M.notatus, Neoacanthocinus obsoletus, N.pusillus, Xylotrechus saggitatus, Amniscus spp., Arhopalus rusticus obsoletus (Cerambycidae); Chrysobothris spp. {Buprestidae)\ Hylobius pales, Pissodes approximatus (Curculionidae) /Dwinell & Nickle, 1989; Finney-Crawley, 1988; Linit, 1987, 1988, 1990; Smith et al, 1996; Wingfield et al., 1982; Wingfield & Blanchette, 1983).
При этом, основными переносчиками нематоды B.xylophilus в США являются жуки Monochamus carolinensis и M.scutellatus; в Японии -M.alternatus; жуки M.marmoratos, M.mutator, M.nitens, M.obtusus, M.saltuarius и M.titillator являются менее специфичными переносчиками. Представители других родов и семейств (табл. 4.1.) являются неспецифичными переносчиками, не играющими роли в распространении нематод, перенося их как внутри, так и на поверхности тела.
Опыты зарубежных исследователей по проверке скрещиваемости нематод Bursaphelenchus xylophilus и Bursaphelenchus mucronatus (Nematoda: Aphelenchoididae)
Близкородственный к сосновой древесной нематоде вид Bursaphelenchus mucronatus, широко распространенный на территории Евразии, обладает значительно меньшей патогенностью для хвойных пород по сравнению со своим американским и японским двойником Bursaphelenchus xylophilus /Mamiya & Enda, 1979; Braasch, 1994; Riga et al., 1991/. При этом климатические условия России таковы, что в случае заноса какого-либо изо-лята В.xylophilus на территорию страны, нанесение большого ущерба лесу представляется маловероятным. Однако для оценки риска необходимо учитывать вероятность скрещивания в природе российских популяций B.mucronatus с популяциями В.xylophilus и образования жизнеспособного вредоносного гибрида. По этой причине нами были проведены эксперименты по проверке скрещиваемости различных изолятов изучаемых нематод. Экспериментальные работы проводились с учетом наработанного опыта и результатов, полученных зарубежными учеными.
Ниже приводится обзор результатов экспериментов по скрещиванию двух указанных видов нематод, проведенных различными исследователями /Braasch, 1994; de Guiran & Bruguier, 1990; Mamiya, 1986; Riga et al., 1991; Schauer-Blume, 1992/.
Подготовка изолятов к скрещиванию производилась исследователями следующим образом:
Изоляты, используемые в экспериментах, до этого культивировались, как правило, на грибе Botrytis cinerea Pers., выращенном на питательной среде. В качестве питательной среды были использованы солодовый агар /Schauer-Blume, 1992; Braasch, 1994/, картофельно-глюкозный агар [КГА] /Mamiya, 1986; Riga et al., 1991/, или лущеные хлебные зерна /De Guiran et al., 1990/. Чашки (или пробирки) с грибом заражались нематодами и выдерживались при температуре +20-25С. После полного объедания нематодами мицелия гриба большая часть нематод переходит в стадию L4 /De Guiran et al., 1990/. За день до скрещивания нематод выделяли из питательной среды по методу Бермана /Mamyia, 1986; De Guiran et al., 1990; Braasch, 1994/.
Следующим важным этапом является половое разделение нематод. Для получения достоверных результатов скрещивания необходимо работать с девственными самками. У большей части популяций Bursaphelenchus невозможно различить пол личинок последнего возраста, или выявить неоплодо-творенных самок. Schauer-Blume /1992/ для каждого отдельного скрещивания отобрал по 10 самцов одного изолята, и 1 L4 другого изолята, обеспечивая лишь 50%-ю вероятность того, что отобранные личинки разовьются в самок. De Guiran et al. /1990/ после выделения L4, поместили их в 2-х недельную культуру Botrytis cinerea. За 24 часа личинки почти завершили свое развитие. По утверждению авторов в этой стадии "предсамки" легко отличаются по прозрачному пятну в области вульвы. Для подтверждения нематоды были выделены и посажены в воду под стереомикроскоп. Все предполагаемые "предсамки" развились в самок. Mamiya /1986/ после выделения поместил каждую L4 по одной на кусочек агара на предметные стекла. Предметные стекла были выдержаны в чашках Петри при температуре +2 5 С до полного развития нематод, после чего стало возможным разделение их по половому признаку.
