Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Растительные полифенолы — источники фармакологических препаратов 11-37
1.1.1. Фенольные соединения с одним ароматическим кольцом 12-16
1.1.2. Фенольные соединения с двумя ароматическими кольцами 16-23
1.1.3. Полимерные фенольные соединения 24-26
1.2. Антиоксидантное и антирадикальное действие флавоноидов 26-31
1.3. Фармакологические аспекты действия флавоноидов на организм
Глава 2. Материал и методы исследования 38-45
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Влияние экстракта из отжима калины на физиологические и структурные характеристики эритроцитов крыс при стрессе (вертикальная фиксация) 46-56
3.2. Влияние экстракта из отжима калины на физиологические и структурные характеристики эритроцитов крыс при алкогольной интоксикации 57-71
3.3. Влияние экстракта из гребней винограда на физиологические и структурные характеристики эритроцитов крыс при гиперхолестериновом рационе 72-79
Глава 4. Обсуждение результатов 80-101
Выводы. 102-103
Список использованной литературы 104-133
- Фенольные соединения с одним ароматическим кольцом
- Антиоксидантное и антирадикальное действие флавоноидов
- Влияние экстракта из отжима калины на физиологические и структурные характеристики эритроцитов крыс при стрессе (вертикальная фиксация)
- Влияние экстракта из гребней винограда на физиологические и структурные характеристики эритроцитов крыс при гиперхолестериновом рационе
Введение к работе
Актуальность проблемы. Важнейшими аспектами биологического действия растительных полифенольных соединений являются антиокислительные свойства (Хавинсон и др., 2003; Костюк, Потапович, 2004; Меньщикова и др., 2006; Salja et al., 1995; Rice-Evans, Miller, 1996; de Groot, Rauen, 1998; Vasiljeva et al., 1998), способность выступать ловушками свободных радикалов различного типа (van Acker et al., 1998; Packer et al., 1999) и взаимодействие с мембранами, что приводит к изменению их структурных характеристик (Александрова, 2005; Huh et al., 1996; Arora et al., 2000; Hulbert, 2003). Использование эритроцитов как модели для изучения мембранопротекторных свойств растительных препаратов, не имеет такого широкого распространения в модельных экспериментах, как, например, гепатоцитов, микросомальных мембран, эпителиальных клеток кишечника, эндотелиоцитов, тромбоцитов, нейтрофилов и других клеток (Заводник и др., 2006; Стрелкова и др., 2007; Shimoi et al., 1994, 1996; Kuo et al., 1998; Kaneko et al., 1999; Van Acker et al., 2000). Между тем, их изучение представляет интерес для расширения представлений о механизмах мембранозащитного действия растительных полифенолов и разработки на их основе лекарственных препаратов и биологически активных добавок с мембранопротекторными свойствами, а также для проверки этих свойств при проведении клинических испытаний.
На сегодняшний день лекарственные средства биофлавоноидной природы являются препаратами-лидерами в терапии заболеваний печени. Наиболее изучены препараты, содержащие в качестве основного действующего вещества группу полифенольных флавоноидных соединений -Silimarin, выделенных из экстрактов плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum G.). Действие силимарина обусловлено стабилизацией клеточных мембран и включением в них фосфолипидов (Новиков, Климкина, 2005). Однако препараты, содержащие силимарин, зарубежного производства,
поэтому очевидна актуальность и необходимость поиска и изучения новых источников сырья, в частности отходов от переработки растительных, дикорастущих видов Дальневосточной тайги и разработки новых эффективных отечественных мембранопротекторов. В частности, на Дальнем Востоке интенсивно изучается препарат «Максар», полученный из маакии Амурской (Maakia amnrensis Rupr.) (Федореев и др., 2004), экстракты из отходов от переработки (отжим, включающий гребни, кожицу, косточки) калины Саржента (Viburnum Sargentii Koehne), гребней винограда Амурского {Vitis amnrensis), гребней лимонника Китайского (Schizandra chinensis) (Кушнерова, Спрыгин, Фоменко, 1995-2006) в плане восстановления функции печени в условиях экспериментальных токсических гепатитов у животных. Системного исследования мембранозащитных свойств экстракта из отжима калины, включая выделение из него биологически активной субстанции в виде комплекса олигомертных проантоцианидинов (КОПЦ), а также экстракта из гребней винограда до сих пор не проводилось.
Как известно, действие на организм повреждающих факторов (физический и химический стресс) сопровождается нарушением физиологических свойств и существенным сдвигом в липидной составляющей мембран эритроцитов (Молотов-Лучанский и др., 2005; Лесникова, 2006; Кашапова и др., 2007; Lindi et al., 1998; Thompson, 1999). Также показано, что экстракты из отжима калины и гребней винограда, комплексы олигомерных проантоцианидинов способствуют стабилизации мембран лизосом и гепатоцитов в условиях интоксикации четыреххлористым углеродом и этиловым спиртом (Спрыгин и др., 2002, 2004; 2006; Фоменко и др., 2003). Эти данные подтверждают перспективность исследования экстракта из отжима калины, гребней винограда и комплекса олигомерных проантоцианидинов как мембранопротекторных средств.
В настоящем исследовании анализируется действие
мембраноповреждающих факторов (стресс-вертикальная фиксация крыс за дорзальную шейную складку, интоксикация этиловым спиртом и
7 гиперхолестериновый рацион) на физиологические характеристики, систему показателей «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита» и липидную составляющую мембран эритроцитов, а также демонстрируется возможность коррекции наблюдаемых отклонений с помощью водно-спиртового экстракта из отжима калины и гребней винограда, а также комплекса олигомерных проантоцианидинов, выделенного из экстракта отжима калины.
Цель работы — изучить влияние экстрактов из отжима калины и гребней винограда, а также комплекса олигомерных проантоцианидинов из экстракта отжима калины в условиях воздействия мембраноповреждающих факторов.
Задачи:
Изучить физиологические характеристики, систему показателей «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита» и липидныи состав мембран эритроцитов крыс при действии мембраноповреждающих факторов (стресс-вертикальная фиксация за дорзальную шейную складку, интоксикация этиловым спиртом, гиперхолестериновый рацион).
Сравнить мембранопротекторные свойства экстракта из отжима калины и элеутерококка в условиях экспериментальной модели стресса.
Сравнить мембранопротекторные эффекты экстракта из отжима калины и легалона, комплекса олигомерных проантоцианидинов и пикногенола в условиях экспериментальной модели интоксикации этиловым спиртом.
Оценить мембранопротекторные свойства экстракта из гребней винограда в условиях экспериментальной модели гиперхолестеринового рациона.
Научная новизна. Впервые выполнено системное исследование мембранопротекторных свойств водно-спиртовых экстрактов из отжима калины, гребней винограда и комплекса олигомерных проантоцианидинов, выделенного из экстракта отжима калины.
Получено экспериментальное подтверждение наличия у экстрактов из отжима калины, гребней винограда и комплекса олигомерных проантоцианидинов мембранозащитных свойств.
При сопоставлении эффектов экстракта из отжима калины и известного стресс-протектора экстракта элеутерококка в условиях экспериментальной модели стресс-вертикальной фиксации крыс за дорзальную шейную складку у первого обнаружены более выраженные мембранозащитные свойства по способности увеличивать в мембране эритроцитов эфиры жирных кислот и снижать лизофосфатидилхолин и фосфатидную кислоту, что предполагает более активное влияние на биосинтез фосфолипидов.
Установлено, что в период депривации после интоксикации этиловым спиртом экстракт из отжима калины превосходит эталонный полифенольный препарат легалон по способности нормализовать размерные характеристики эритроцитов, повышать концентрацию восстановленного глутатиона, снижать холестерин и сфингомиелин, что обеспечивало увеличение порога осмотической устойчивости эритроцитов к гемолизирующему агенту.
Впервые обнаружено, что комплекс олигомерных проантоцианидинов и эталонный препарат пикногенол в равной степени обеспечивали восстановление мембран эритроцитов крыс после токсического действия этилового спирта.
Получены новые данные о том, что в условиях гиперхолестеринового рациона экстракт из гребней винограда усиливает этерификацию холестерина, чем снижает микровязкость липидной составляющей мембран эритроцитов и восстанавливает их осмотическую устойчивость.
Практическая значимость работы. Исследование расширяет
недостаточно разработанные в науке представления о
мембранопротексторных свойствах растительных полифенолов и, в
частности, олигомерных проантоцианидинов. Материал о
мембранозащитном действии экстрактов из отжима калины, гребней винограда и комплекса олигомерных проантоцианидинов в отношении
9 изменений показателей системы «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита», физиологических и структурных характеристик эритроцитов при действии повреждающих факторов может быть использован при разработке медико-биологической документации на применение этих средств в качестве биологически активной добавки как в нативном виде, так и в составе продуктов питания. Экстракт из отжима калины используется при производстве функционального пищевого продукта - мармелада «Биолад-калина» (ТУ 9128-152-02067936-2006).
Положения, выносимые на защиту:
Экстракт из отжима калины по способности препятствовать стресс-индуцированным отклонениям показателей физиологических и структурных характеристик мембран эритроцитов сопоставим со стресс-протекторным препаратом экстрактом элеутерококка.
Экстракт из отжима калины в период депривации после интоксикации животных этиловым спиртом по способности восстанавливать липидный состав и физиологические характеристики эритроцитов сопоставим с известным полифенольным препаратом легалон, а комплекс олигомерных проантоцианидинов сопоставим с известным препаратом пикногенол.
Экстракт из гребней винограда обладает выраженным гипохолестеринемическим и мембранопротекторным эффектом в условиях гиперхолестеринового рациона.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены, доложены и обсуждены на Всероссийской научной молодежной конференции «Биологически активные добавки и здоровое питание» (Улан-Уде, 2001), П-й и Ш-й Тихоокеанских научно-практических конференциях студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2001, 2002), 9-й Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), Третьем съезде общества биотехнологов России им.
10 Ю.А.Овчинникова (Москва, 2005), III Международном Тихоокеанском конгрессе по традиционной медицине (Владивосток, Сеул 2006).
Работа выполнена при поддержке гранта «Старт» № 7371.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 133 страницах и содержит введение, обзор литературы, характеристику материала и методов исследования, описание результатов собственных исследований, обсуждение результатов и выводы. Список литературы включает 278 работ, в том числе 126 отечественных и 152 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 19 рисунками и 9 таблицами.
Фенольные соединения с одним ароматическим кольцом
Из простых фенольных кислот наиболее широко распространены производные транс-коричной кислоты. Они образуются по шикиматному пути через L-фенилаланин или L-тирозин, при этом основным источником фенольных соединений этого класса является именно L-фенилаланин (Гудвин, Мерсер, 1986; Запрометов, 1996; Croft, 1998; Hollman, 2001). Представители этого класса фенольных соединений присутствуют практически во всех видах растений, где они обычно находятся в виде гликозидов или эфиров с хинной кислотой.
Оксикоричные кислоты (п-кумаровая, кофейная, феруловая и синаповая) в различных комбинациях, в свободном виде или в составе гликозидов и сложных эфиров, содержатся во многих высших растениях. Наиболее распространены в природе кофейная кислота и ее производные (хлорогеновая и ее изомеры), оказывающие противовоспалительное и желчегонное действие. Хлорогеновая кислота в больших количествах присутствует в зернах кофе, листьях черники обыкновенной, арники горной, ромашке лекарственной и др.
Сумма кофейной, хлорогеновой, феруловой, кумаровой и других кофеилхинных кислот оказывает гипоазотемический эффект, усиливает функцию почек, стимулирует антитоксическую функцию печени. Оксикоричные кислоты содержатся также в корнях лопуха, в боярышнике, ревене.
Фенолоспирты и их гликозиды содержатся в родиоле розовой, повышают работоспособность и сопротивляемость организма к неблагоприятным воздействиям. Кумарини - ароматические лактоны, производные бензо-у-пирана. Они широко распространены в растительном мире. Особенно богаты ими представители семейств зонтичных, рутовых, бобовых, сложноцветных (астроцветных), пасленовых. В природе чаще встречаются следующие производные кумаринові фуро- и пиранокумарины, простые эфиры и реже гликозиды. Их содержание в растениях варьирует в пределах 0,2-5%. В природе чаще встречаются фурокумарины, пиранокумарины, простые эфиры, реже встречаются гликозиды. Природные кумарины обладают разносторонней биологической активностью. Некоторым фурокумаринам присуща фотосенсибилизирующая активность. Кумарины бергаптен, виснадин, атамантин оказывают спазмолитическое действие, .эскулетин, эскулин и фраксин обладают Р-витаминной активностью, умбеллиферон оказывает антимикробное действие. Они содержатся в конском каштане, доннике, вздутоплоднике сибирском.
Плоды, содержащие оксикумарины: вишня, черешня,, красная смородина, облепиха, черника, гранаты, инжир, черемуха, - имеют определенное значение в предупреждении инфарктов и инсультов за счет способности этих веществ снижать свертываемость крови. Кумарины и фурокумарины в гликозидированных формах представлены в чернике (1,3-3,6 мг/100 г), морошке (2,0-4,4 мг/100 г), черемухе (2,0-5,0 мг/100 г). В плодах облепихи и чернике содержатся оксикумарины (75-90 мг/100 г).
Хромоны - производные бензо-у-пирана, по структуре близки к кумаринам. Их характерной особенностью является наличие фенольных гидроксильных групп. Наиболее часто встречаются в растениях семейств сельдерейных, лютиковых, миртовых - сельдерей, петрушка, укроп и в других растениях. Обладают спазмолитической, биостимулирующей, антиаллергенной и антибактериальной активностью.
Ксантоны - производные дибензо-у-пирана, по структуре близки к флавоноидам. Характерным признаком ксантонов является наличие свободных метилированных и гликозилированных фенольных гидроксильных групп. В настоящее время известно более 300 соединений этой группы, широко распространенных среди растений семейств зверобойных, горечавковых, тутовых, анакордовых, ирисовых, лилейных и бобовых, где они содержатся в плодах, корнях в количествах от 0,1 до 3%. По химической структуре они подразделяются на восемь групп. Характерным свойством ксантонов является наличие свободных метилированных и гликозилированных фенольных гидроксильных групп. Ксантоны обладают широким спектром биологической активности: являются стимуляторами центральной нервной системы, проявляют кардиотоническую, диуретическую активность, антибактериальное и противотуберкулезное действие.
Хиноны - окисленные формы многих фенольных соединений, возникающие при отдаче соответствующим фенолом двух электронов и двух протонов водорода. Окисление фенола в хинон происходит ступенчато, путем отдачи двух электронов одного за другим.
Бензохиноны, нафтохиноны и антрахиноны особенно характерны для обмена веществ грибов, встречаются и у высших растений. Простейший из них 2,5-диметоксибензохинон найден в корнях и клубнях горицвета и некоторых других растений. Некоторые лучистые грибы синтезируют производное бензохинона - фумигатин. Нафтохиноны (юглон) найдены в кожице незрелых грецких орехов и листьях этого дерева. Особенно широко распространены антрахиноны. Хризофановая кислота и эмодин встречаются в щавеле и ревене. Антрахиноны сенны, ревеня, крушины способны усиливать перистальтику толстых кишок, что обусловливает их слабительное действие. Некоторые антрахиноны хризофтаноловой кислоты и других оксиантрахинонов (получен ряд N-, S- и галоидпроизводных), а также аминоаллоксильных производных обладают протувоопухолевой активностью и являются иммунодепрессантами. Природные антрахиноны относятся к числу малотоксичных веществ, но их производные могут вызывать подострые отравления (снижают уровень гемоглобина и эритроцитов крови, нарушают функцию печени и почек, баланс аскорбиновой кислоты в организме, вызывают раздражение дыхательных путей).
К производным бензохинона относятся также пласто- и убихиноны. Эта небольшая по численности группа фенольных соединений играет огромную роль в процессах жизнедеятельности. Пластохиноны (производные 5,6-диметил-п-бензохинона) находятся в зеленых частях растений в хлоропластах (хлорофилловых зернах), где активно участвуют в процессе фотосинтеза в качестве переносчиков водорода. Наиболее часто встречающая форма — пластохинон-45.
Убихиноны (кофермент Q) - универсальный компонент не только растительных, но и тканей животных и человека. Они входят в состав других клеточных органелл - митохондрий - и являются непременными и постоянными участниками процесса клеточного дыхания. Убихиноны, производные 2-метил-5,6-диметокси-п-бензохинона, - компоненты дыхательной цепи, участвующие в переносе водорода. В хлоропластах и в митохондриях используется способность системы фенол-хинон к легкой и обратимой отдаче электронов и атомов водорода - к ступенчатому окислению. Лигнаны - димерные соединения фенольной природы, состоящие из двух фенилпропановых фрагментов (Сб-С3), которые связаны между собой Р углеродными атомами боковых цепей. Термин «лигнаны» был впервые введен Хеуорсом в 1936 г. Лигнаны разделяют на несколько групп: диарилбутановый тип - лигнаны гваяковой смолы, получаемой из древесины гваякового дерева, например гваяревая кислота; 1-фенилтетрагидронафталиновый тип - лигнаны смолы и подземных органов подофилла щитовидного - подофиллотоксин и пелтатины; циклогексалигнаны (сезаминовый тип) — лигнан сезамин из семян кунжута и сирингарезинол из корневищ и корней элеутерококка колючего; циклоокталигнаны — схизандрин и схизандрол из семян лимонника китайского. Особую группу соединений составляют флаволигнаны, имеющие более сложную структуру и сочетающие в себе свойства флавоноидов и лигнанов, например силибин, силидианин и силихристин из семянок расторопши пятнистой.
Лигнаны довольно широко распространены в растительном мире. Они обнаружены у представителей многих семейств голосеменных и цветковых растений, часто встречаются в семействах сосновые, сложноцветные, аралиевые, барбарисовые, рутовые, кунжутные и др. Существуют в клетках как в свободном виде, так и в форме гликозидов. Накапливаются во всех органах растений, но больше в семенах, корнях и древесных стеблях. Могут содержаться в ядровой древесине и смолистых выделениях из раневых повреждений некоторых видов хвойных.
Антиоксидантное и антирадикальное действие флавоноидов
Одно из ключевых свойств флавоноидов - их антиоксидантная активность, в том числе способность подавлять процессы перекисного окисления липидов, белков, нуклеиновых кислот и других соединений, тормозить развитие синдрома пероксидации (Костюк и др., 1988; Костюк, Потапович, 2004; Kandaswami, Middleton, 1994; Terao, 1999).
Как антиоксиданты, флавоноиды обладают рядом уникальных особенностей: 1. Флавоноиды подавляют перекисные процессы на самой первой -инициирующей стадии, выступая как «ловушки» супероксид-радикала и перекиси водорода, предотвращая образование последующих более токсичных продуктов. В этом плане флавоноиды действуют аналогично антиоксидантному ферменту - супероксиддисмутазе. 2. Флавоноиды функционируют как «ловушки» и вторичных активных форм кислорода - высокотоксичных гидроксил-радикала, синглетного кислорода, пероксинитрита, перекисей липидов, а также свободных радикалов, образующихся при действии на организм ряда токсикантов, например, хлорсодержащих. Это так называемая «цепь-обрывающая» активность флавоноидов. 3. Флавоноиды функционируют как эффективные «хелаторы», связывающие ионы переходных металлов, в том числе стимулирующих перекисные процессы, в силу чего эти соединения являются эффективными ингибиторами металлкатализируемого перекисного окисления липидов, белков и других веществ. По этому же механизму флавоноиды защищают от окисления и аскорбиновую кислоту. Путем хелатирования флавоноиды связывают и ионы токсичных тяжелых металлов, способствуя их элиминированию из организма. 4. Флавоноиды ингибируют ферментативные реакции, в которых продуцируются супероксид-радикал и перекись водорода (например, ксантиноксидазу, пероксидазная активность которой существенно возрастает при ишемии, и др.). 5. Флавоноиды оказывают защитное действие на ферменты антиоксидантной системы клетки, в частности, ферменты первой линии антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазу, пероксидазу и др. Таким образом, антиоксидантный эффект флавоноидов реализуется по комбинированному механизму и зависит от структуры этих веществ. Именно по этой причине наиболее эффективны комбинации или смеси флавоноидов (в первую очередь природные). Более того, флавоноиды (а особенно их комбинации) могут действовать как синергисты других антиоксидантов, в первую очередь, аскорбиновой кислоты и, что особенно важно, мембранного антиоксиданта - витамина Е, способствуя (особенно в комбинации с аскорбиновой кислотой), регенерации активной формы последнего и предотвращая образование токоферилхинона. Так, система витамин Е -флавоноиды - витамин С является эффективной антиоксидантной комбинацией (Powers, Hamilton, 1999).
В настоящее время общепризнанными являются следующие три молекулярных механизма антиоксидантного действия флавоноидов в биологических системах: реакции с биорадикалами (антиоксидантное и антирадикальное действие) (Абрамова, Оксенгендлер, 1985; Гордиенко, 1990; Бунятян и др., 1999; Closa et al., 1997; Jovanovic, 1998; Santos-Buelga, Scalbert, 2000; Venkatesan, Rao, 2000); связывание металлов с переменной валентностью (хелатирующее действие) (Brown et al., 1998; Cheng et al, 2000; Rice-Evans et al, 1997;Sasso, 1989; Robak, Gryglewski et al., 1996; Hollman, 2001); ингибирование прооксидантных ферментов (Saija et al., 1995; Carmona, 1996; Zhu et al, 1997; Hamdaoui, 1997; Chan et al, 1999; Jiao, Wang, 2000; Male et al., 2003).
Флавоноиды, благодаря своей полифенольной природе, имеют выраженные электроно-донорные свойства (Ansel, Lowe, 1999). Из-за высокой разницы в значениях восстановительных потенциалов большинства флавоноидов и анион-радикалов кислорода, алкоксильных, пероксильных и гидроксильных радикалов, они легко вовлекаются в одноэлектронные реакции в соответствии с уравнением: FIOH + R- FIO" + RH
Характерной особенностью образующегося в результате реакции ароксильного радикала FIO является способность к делокализации, то есть передвижению неспаренного электрона в ароматическое кольцо с образованием ряда резонансных структур:
Имеются убедительные экспериментальные данные (рис. 1.3), позволяющие сделать вывод о том, что у большинства флавоноидов первичной мишенью для различных оксидантов являются гидроксильные (катехольные) группы кольца В (Bors et al., 2000). При окислении этих групп образуются короткоживущие семихиноновые анион-радикалы и далее соответствующие ортохиноны.
При расположении гидроксильных групп рядом (орто-положение) легко образуются о-хиноны, если же гидроксильные группы расположены напротив (пара-положение), то образуются п-хиноны (Ueda et al., 2004).
Таким образом, только фенолы с определенным расположением гидроксилов могут легко и обратимо окисляться в семихинон и хинон (Hodnick, et al.,1986), отдавая электроны и протоны водорода и выступая тем самым в роли восстановителей-антиоксидантов. Эта реакция в силу особой легкости отдачи электронов может происходить самопроизвольно при доступе кислорода, причем продукты обратимого окисления - семихинон и хинон - выступают в роли самоускорителей реакции, автокатализаторов.
Влияние экстракта из отжима калины на физиологические и структурные характеристики эритроцитов крыс при стрессе (вертикальная фиксация)
Известно, что одним из основных механизмов в развитии нарушений, снижающих резервы здоровья при стрессе, является активация перекисного окисления липидов и рассогласование каскада химических реакций антиоксидантной системы, изменения углеводно-липидного обмена, сопровождаемые сдвигом окислительно-восстановительного равновесия и нарушением энергообеспечения организма (Панин, 1983; Меерсон, 1986; Барабой и др., 1992; Менщикова и др., 2006; Juurlink et al., 1998; Uchida et al., 1999; Valko et al., 2007). Усиление свободно-радикальных и перекисных процессов, а также оксидативныи стресс лежат в основе патогенеза синдрома адаптационного перенапряжения, хронической усталости, атеросклероза и др. Перспективными корректорами метаболических изменений, возникающих при различных видах стресса, являются природные полифенольные соединения, оказывающие антирадикальное и антиоксидантное действие (Хавинсон и др., 2003; Костюк, Потапович, 2004; Менщикова и др., 2006; Weber et al., 2003; Valko et al., 2007).
Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 180-200 г, содержащихся на стандартном рационе питания. В качестве экспериментальной модели острого стресса использовали вертикальную фиксацию животных за дорзальную шейную складку в течение 22 часов. Непосредственно перед вертикальной фиксацией и через 6 ч. после начала эксперимента крысам вводили внутрижелудочно водный раствор полифенольного комплекса (ПФК) экстракта калины в дозе 0,4 мл/кг (100 мг сухого остатка/кг массы) и, в качестве препарата сравнения, водный раствор полифенольного комплекса аптечного экстракта элеутерококка (100 мг сухого остатка/кг массы). Экстракты калины и элеутерококка предварительно освобождали от спирта путем упаривания в вакууме. Доза в 100 мг/кг для комплекса полифенолов из элеутерококка эквивалентна 5,0 мл/кг его спиртового экстракта (Брехман, 1968). При стрессе без введения препаратов крысам вводили в желудок дистиллированную воду (0,4 мл/кг).
Животные были разделены на четыре группы по 10 крыс в каждой: 1-я — контроль (интактные животные), 2-я - стресс, 3-я - стресс+экстракт калины, 4-я - стресс+элеутерококк. Крыс выводили из эксперимента путем декапитации под легким эфирным наркозом. У животных определяли массу надпочечников и количество изъязвлений на слизистой желудка.
Вертикальная фиксация крыс за дорзальную шейную складку вызывала формирование типичной картины стресса с характерными геморрагическими деструкциями желудка и гипертрофией надпочечников, масса которых повысилась на 42% (8,43+0,25 мг/100 г массы против 5,94+0,55 мг/100 г массы в контроле; Р 0,001). Количество кровоизлияний на слизистой желудка составило 2,7±0,08 шт/жив, в контроле - 0.
При исследовании размерных характеристик эритроцитов (СДЭ и СОЭр) отмечались однонаправленные их изменения в сторону увеличения. Так, СДЭ превышал контрольные значения на 26% ( Р 0,001), а СОЭр - на 97% (Р 0,001) (табл. 3.1.1). Снизился порог начала гемолиза эритроцитов до 0,50±0,02% NaCl и окончания гемолиза при концентрации NaCl 0,45±0,02%. Это свидетельствует о том, что мембрана эритроцитов обладает пониженной устойчивостью к гемолизирующему агенту. Содержание общих фосфолипидов в эритроцитах стрессированных крыс было снижено на 20%) (Р 0,001). При стрессе отмечалась повышенная активность супероксиддисмутазы (СОД), что составляло 19,70±0,66 ед/мг белка по сравнению с 13,49+0,57 ед/мг белка в контроле (Р 0,001) и сниженный уровень антирадикальной активности (АРА) (6,9±0,3 ед тролокса/мг белка против 15,6+0,6 ед тролокса/мг белка в контроле, Р 0,001).
ГруппыЖИВОТНЫХ Средний диаметр эритроцита (СДЭ, мкм) Средний объемэритроцита(СОЭр, мкм3) Осмотическаярезистентность(% NaCl) Общиефосфолипиды (%) Коэффициент ХС/ФЛ 1 группа Контроль(интактные) 6,50±0,02 56,20±1,9 0,45+0,01 0,35+0,01 64,49±1,86 0,32±0,01 2 группа Стресс 8,21±0,18(в 110,66+2,8(в 0,50±0,02(а 0,45+0,02(в 51,62±1,87(в 0543±0,02(в 3 группа Стресс+ Экстракткалины 6,56±0,12(3 56,46±2,2(3 в)0,40±0,02(3 в)0,30±0,01(3 60,73±1,71(3 0,33±0,01(3 4 группа Стресс+ элеутерококк б)7500±0,14(3 в)70,08±2,5(3 в)0,40±0,01(3 в)0,30±0,01(3 а)58,82±1,65(2 в)0,37+0,01(2 Примечание: -(а - Р 0,05;(б - Р 0,01;(в - Р 0,001 сравнение с контролем; - Р 0,05;(2 - Р 0,01; (3 - Р 0,001 - со 2-ой группой. Величина восстановленного глутатиона (Г-SH) была ниже контрольных значений на 25% (РО001), что составляло 1,26±0,07 нмоль/мг белка по сравнению с 1,69±0,08 нмоль/мг белка в контроле. Такие изменения этих показателей свидетельствуют о напряжении системы антиоксидантной защиты.
Анализ состава нейтральных липидов эритроцитов (рис. 3.1.2) показал, что под влиянием стресса происходило увеличение количества холестерина на 7% (Р 0,05), что обусловливало рост коэффициента ХС/ФЛ с 0,32±0,01 в контроле до 0,43±0,02 (Р 0,001). Кроме того, обращает на себя внимание увеличение ТАГ на 14% (Р 0,05) и СЖК на 13%) (Р 0,05), что соответственно составляло 18,45±0,67% и 19,10±0,47% по сравнению с 16,23±0,34% и 16,88±0,59% в контроле (рис. 3.1.2). Р 0,01; -Р 0,001 Достоверно снижалось количество ФХ на 8% (Р 0,01), что составляло 34,03±0,50% по сравнению с 37,09±0,80% в контроле. Одновременно увеличивалось количество ЛФХ на 13% (10,26±0,44% против 9,12±0,44% в контроле; Р 0,05) и ЛФЭ на 15% (8,59±0,37% против 7,48±0,32% в контроле; Р 0,05), что обусловлено активацией фосфолипазы А2 при стрессе (Kohyama et al, 2003). Достоверно повышен уровень сфингомиелина (на 30%, что составляло 16,60±0,48% против 12,81±0,73% в контроле; Р 0,001). Обращает на себя внимание увеличение количества ФИ на 17% (Р 0,01), что составляло 6,11±0,14% (в контроле - 5,24±0,12%), а также ФК на 18% (4,83±0,14% против 4,10±0,16% в контроле; Р 0,01). Изменение в соотношении метаболически активных фракций фосфолипидов (ФИ и ФК) свидетельствует о напряжении системы мембраносвязанной Ыа+К+-АТФазы (Satoh et al., 1993).
На основании выше изложенного следует, что при остром стрессе происходит рассогласование системы антиоксидантной защиты мембран, активация перекисного окисления липидов и нарушение в соотношении липидных составляющих мембран эритроцитов, которое сопровождается изменением их размерных характеристик и снижением устойчивости клеток к гемолитическому агенту.
Влияние экстракта из гребней винограда на физиологические и структурные характеристики эритроцитов крыс при гиперхолестериновом рационе
Перегруженность эритроцитарной мембраны холестерином может приводить к нарушению функции эритроцитов вследствие изменения физических свойств мембраны и активности мембраносвязанных ферментов (Na -К -АТФ-азы, Mg -АТФ -азы, аденилатциклазы и ацетилхолинэстеразы), изменения проницаемости мембраны (Koter et al., 2004), снижения скорости переноса кислорода (Lee et al., 2004). Гиперхолестериновый рацион является одной из распространенных экспериментальных моделей формирования гиперхолестеринемии, при которой происходит встраивание холестерина из липопротеинов в мембраны эритроцитов (Левачев, 1986). Процесс протекает довольно медленно: алиментарное влияние жировых компонентов пищи проявляется лишь через 4-6 недель (Покровский и др., 1977), что обусловило длительность разработанного эксперимента.
В настоящее время установлено, что растительные полифенолы обладают выраженным гипохолестеринемическим действием за счет активации фермента лецитин:холестеринацил-трансферазы (ЛХАТ) (Гаскина и др., 1989). Следовательно, целесообразно использовать растительные препараты и биологически активные добавки, содержащие флавоноиды (полифенольные структуры) для реконструкции липидной составляющей мембран клеток, в частности эритроцитов.
В эксперименте использовали белых крыс-самцов линии Вистар массой 180-200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Экспериментальную гиперхолестеринемию вызывали в течение 6 недель введением в рацион животных повышенного содержания насыщенных жиров (растительное сало 25% от веса рациона), включающих 2,5% холестерина (Мещерская и др., 1966). Водный раствор сухого остатка экстракта из гребней винограда (предварительно освобожденный от спирта под вакуумом) вводили перорально по 0,4 мл/кг, что соответствовало дозе 100 мг общих полифенолов/кг массы в сутки. В эксперименте, продолжительностью в 6 недель, животные были разделены на 3 группы по 10 крыс в каждой: 1-я группа - контроль (интактные, стандартный рацион); 2-я группа -гиперхолестериновый рацион; 3-я группа - гиперхолестериновый рацион +экстракт из гребней винограда.
Гиперхолестериновый рацион (ГХС) вызвал формирование типичной картины гиперхолестеринемии, при которой в крови количество ХС возросло в 2 раза (2,56±0,05 ммоль/л против 1,29±0,02 ммоль/л в контроле; Р 0,001). Изучение размерных характеристик эритроцитов показало, что при гиперхолестеринемии происходит увеличение СДЭ на 37% (Р 0,001) и СОЭр в 2,6 раза (Р 0,001), что определяет развитие макроцитоза (табл.3.3.1). При этом начало и окончание гемолиза эритроцитов происходило позже, чем у контрольных крыс (начало при концентрации NaCl 0,35±0,01%, а окончание - при 0,30±0,01%). В контроле начало гемолиза происходило при 0,45±0,01%, а окончание при 0,35±0,01% NaCl. Гиперхолестеринемия сопровождалась снижением количества общих фосфолипидов до 47,67±1,72%, что на 25% (Р 0,001) меньше контрольных значений (63,57±1,78%). Исследование уровня холестерина в эритроцитах показало, что его содержание на 26% (Р 0,01) превышало контрольный уровень и составляло 28,45±0,89% по сравнению с 22,61±0,68% в контроле (рис. 3.3.1). Обращает на себя внимание значительное увеличение ТАГ до 23,36±0,94% и СЖК до 16,85±0,57%, что равнозначно на 28% (Р 0,001) выше контрольных величин (рис. 3.3.1). Значительно увеличилось количество ЛФХ (на 63%; Р 0,001), что составляло 15,44±0,51% по сравнению с 9,47±0,44% в контроле. Гиперхолестериновый рацион сопровождался снижением количества ФИ до 4,13±0,12% (5,60±0,11% в контроле; Р 0,001) и ФК до 1,3±0,08% (в контроле 2,46±0,08%; Р 0,01), что на 26% и 47% было ниже контроля. Таким образом, введение в рацион больших количеств насыщенного жира (50% по калорийности) и ХС (2,5%) меняет соотношение липидных структур в мембранах эритроцитов по сравнению с нормой. Эти изменения обусловливают увеличение размерных физиологических характеристик эритроцитов: СДЭ и СОЭр за счет увеличения ХС, ТАГ, СМ. В связи с этим, увеличивается осмотическая резистентность эритроцитов к гемолизирующему агенту, что предполагает усиление плотности и жесткости мембран, снижение их фильтрационной способности. При сравнении размерных характеристик эритроцитов крыс 3-й группы (ГХС+экстракт винограда) относительно контрольных значений отмечается нормализация исследованных показателей. В то же время при сравнении изученных параметров с таковыми во 2-й группе (ГХС рацион без препарата) прослеживаются отличия с высокой степенью достоверности. Так, СДЭ составлял 6,60±0,16 мкм, а СОЭр - 58,80±2,40 мкм3 по сравнению с 8,50±0,02 мкм и 122,82±1,55 мкм (Р 0,001), соответственно, при гиперхолестеринемии (табл.3.3.1).
Осмотическая резистентность эритроцитов имела более широкие границы устойчивости, чем таковые во 2-й группе, что составляло 0,40±0,01% NaCl при начале гемолиза (0,35±0,01% во 2-й группе; Р 0,01) и 0,30±0,01% NaCl при его завершении (0,30±0,01% во 2-й группе; Р 0,01) (табл.3.3.1). Следовательно, экстракт из гребней винограда не только восстановил устойчивость мембран к снижению концентрации NaCl, но и расширил границы осмотической резистентности. Отмечался более высокий уровень общих фосфолипидов, чем таковой во 2-й группе (63,57±1,78% против 47,67±1,72%; Р 0,001) (табл.3.3.1). При введении экстракта из гребней винограда одновременно с гиперхолестериновым рационом (3-я группа) обращает на себя внимание факт снижения ХС на 15% (Р 0,001) (рис. 3.3.3), что обусловило уменьшение коэффициента ХС/ФЛ.
Данный феномен обусловлен активацией фермента лецитин-холестеринацил-трансферазы (ЛХАТ) полифенолами препарата (Гаскина и др., 1989) и, соответственно, насыщением липопротеинов эфирами холестерина. Следует отметить сохраняющийся повышенный уровень СЖК (14,86±0,32% против 13,19±0,19% в контроле; Р 0,001), что обусловлено рационом с высоким содержанием насыщенных жирных кислот. При сравнении количественных показателей других фракций нейтральных липидов с таковыми во 2-й группе прослеживается выраженный гипотриглицеридемический эффект экстракта (величина ТАГ составляла 17,73±0,76% против 23,36±0,94% при ГХС; Р 0,001). Анализ фосфолипидного спектра (рис. 3.3.4) показал восстановление фракционного состава до контрольных значений, за исключением ЛФХ, величина которого была выше на 22% (12,00±0,58% против 9,47±0,44% в контроле; Р 0,001). В то же время, при сравнении со 2-й группой отмечались достоверные различия по ряду показателей.
Так, действие экстракта сопровождалось ростом уровня ФХ до 36,73±0,81% (Р 0,001) и снижением ЛФХ и СМ соответственно до 12,00±0,58% и 8,90±0,69%. Обращает на себя внимание более высокие величины ФИ (5,65±0,08%) и ФК (2,50±0,10%). По-видимому, под действием полифенолов экстракта активируется синтез фосфолипидов из ТАГ для восстановления структуры мембран.
Сопоставляя полученные результаты, следует отметить высокий протекторный эффект экстракта из гребней винограда в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии, который проявлялся в снижении холестерина, увеличении его эфиров и метаболически активных фракций фосфолипидов, снижении ТАГ, СМ, ЛФХ и ЛФЭ. Эти изменения обусловили нормализацию размерных характеристик эритроцитов и их осмотическую резистентность.
![Влияние экстрактов ольхи клейкой на развитие перевиваемых опухолей в условиях цитостатической терапии [Электронный ресурс]](/i/i/4449/188653.png "Влияние экстрактов ольхи клейкой на развитие перевиваемых опухолей в условиях цитостатической терапии [Электронный ресурс] Шилова Наталья Владимировна")
