Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Изучение анальгетического действия дерморфина и его пролин модифицированных аналогов . 49
1 Изучение анальгетического действия дерморфина, [D-Pro0]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина в тесте соматической боли, вызванной термическим раздражением. 49
2 Изучение анальгетической активности дерморфина, [DPro6]-дерморфина и [АРгоб]-дерморфина в тесте фазической соматической боли, вызванной механическим стимулом . 53
3 Изучение анальгетической активности дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [ДРго6]-дерморфина в тесте тонической висцеральной боли, вызванной внутрибрюшинным введением кислоты. 53
4 Изучение анальгетической активности дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина в тесте тонической боли, вызванной интрадермальным введением химического вещества. 54
5 Изучение активности дерморфина, [Б-Рго]-дерморфина и [ДРго6]-дерморфина в тесте воспалительной реакции, вызванной конканавалином А. 56
Глава 2 Влияние дерморфина и его пролин-модифицированных аналогов на температуру тела 57
1 Терморегуляторная активность дерморфина, [D-Ргоб]-дерморфина, [ДРгоб]-дерморфина при температуре окружающей среды 4-6 С. 58
2 Терморегуляторная активность дерморфина, Р>Рго6]-дерморфина, [АРгоб]-дерморфина при температуре окружающей среды 27-28 С (термонейтральная среда). 59
3 Терморегуляторная активность дерморфина, [0-Рго6]-дерморфина, [ДРгоб]-дерморфина при температуре окружающей среды 31-32 С 60
Глава 3. Изучение побочных эффектов дерморфина и его пролин-модифицированных аналогов . 62
1 Влияние дерморфина, [D-Pro0]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина на частоту дыхания мышей 62
2 Острая токсичность дерморфина, [0-Рго6]-дерморфина и [ДРго0]-дерморфина через 24 часа и через 7 дней после введения 63
3 Влияние [О-Рго0]-дерморфина на развитие толерантности 63
4 Изучение влияние дерморфина, [О-Рго0]-дерморфина и [ДРго0]-дерморфина на развитие синдрома отмены 67
Глава 4. Изучение нейротропной активности дерморфина и его пролин-модифицированных аналогов . 70
1 Влияние дерморфина, [Б-Рго]-дерморфина и [АРго0]-дерморфина на двигательную активность и ориентировочно-исследовательскую реакцию в тесте открытое поле 70
2 Влияние дерморфина, [О-Рго0]-дерморфина и [АРго]-дерморфина на эмоциональность крыс. 72
3 Влияние дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфииа на уровень тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте. 72
4 Влияние дерморфина, |Т)-Рго6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина на устойчивость к депрессии 73
5 Влияние дерморфина, |Т)-Ргоб]-дерморфина и [ДРго6]-дерморфина на продолжительность сна, вызванного гексеналом 74
Глава 5 Влияние анализаторов нейромедиаторных систем на действие дерморфина и его пролин-модифицированных аналогов 75
1 Влияние неселективного антагониста опнатных рецепторов налоксона на анальгетический эффект дерморфина, [D-Pro6 дерморфина и [ДРго6]-дерморфина в тесте соматической боли 75
2 Влияние неселективного антагониста опиатных рецепторов налоксона на анальгетический эффект дерморфина, [D-Pro6] -дерморфина и [АРго6]-дерморфина в тесте висцеральной боли 75
3 Влияние дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина на эффекты серотониномиметика 76
4 Влияние дерморфина, |Т)-Рго6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина на эффекты холиномиметика 77
5 Влияние дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина на эффекты агонистов дофаминовых рецепторов 78
6 Влияние дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина на повреждение дофаминергических нейронов МФТП у мышей 80
Глава 6 Изучение связывания дерморфина и его пролин-модифицированных аналогов на препаратах изолированных органов 82
Обсуждение результатов 84
Заключение 101
Выводы 103
Список литературы 104
- Изучение анальгетической активности дерморфина, [DPro6]-дерморфина и [АРгоб]-дерморфина в тесте фазической соматической боли, вызванной механическим стимулом
- Терморегуляторная активность дерморфина, Р>Рго6]-дерморфина, [АРгоб]-дерморфина при температуре окружающей среды 27-28 С (термонейтральная среда).
- Влияние [О-Рго0]-дерморфина на развитие толерантности
- Влияние дерморфина, |Т)-Рго6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина на устойчивость к депрессии
Введение к работе
Поиск новых высокоэффективных анальгетиков остается актуальної! проблемой современной фармакологии. Применяемые в настоящее время обезболивающие средства обладают рядом недостатков. Наркотические анальгетики характеризуется сильным обезболивающим действием, что позволяет их применять при травмах и при заболеваниях, сопровождающихся выраженным болевым синдромом (злокачественные новообразования, инфаркт миокарда и другие). Помимо анальгетического эффекта, препараты оказывают влияние на центральную нервную систему человека, выражающееся в развитии эйфории. При повторном применении наблюдаются синдромы психической и физической зависимости, а при снятии препарата после длительного применения развивается синдром отмены. Кроме того, при длительном применении развивается толерантность, и для достижения анальгетического эффекта необходимо увеличение дозы, что сопровождается риском угнетения дыхательного центра (Wintle, 2008).
Ненаркотические анальгетики не оказывают влияния на дыхательный центр, не вызывают эйфории и явлений физической и психической зависимости, однако их обезболивающее действие проявляется только при определенных видах болевых ощущении: главным образом при невралгических, мышечных, суставных болях, при головной и зубной боли. При сильной боли, связанной с травмами, полостными оперативными вмешательствами, злокачественными новообразованиями и т.п.. они практически не эффективны. Некоторые ненаркотические анальгетики характеризуются хорошими жаропонижающим и противовоспалительным эффектами. Негативным побочным действием этих соединений является влияние на систему кроветворения, желудочно-кишечный тракт, выводящую систему (Krenzischek et al., 2008).
Перспективным направлением поиска эффективных анальгетиков представляется создание веществ на основе структуры эндогенных пептидов. В настоящее время установлены общие механизмы систем ноцицепции и терморегуляции. Показано, что вещества, проявляющие гипотермическое действие, могут оказывать влияние на болевую чувствительность (Woods et al., 1994). Среди изученных эндогенных пептидов наиболее выраженным гипотермическим действием обладают пептиды групп бомбезина (Lin, Lin, 1986) и дерморфина (Broccardo et al., 1981, Emel yanova et al., 1996).
Дерморфин (Tyr-D-Ala-Phe-Glyyr-Pro-Ser) - эндогенный опиатный пептид, выделенный из кожи южноамериканской лягушки (Montecucchi et al., 1981) - обладает преимущественным сродством к ц-опиатным рецепторам (Broccardo et al., 1981). Анальгетическая активность дерморфина в 3-5000 раз превосходит по уровню эффективных доз морфин в тестах горячей пластины, отдергивания хвоста и корчей (Stevens et al., 1986). У людей, дерморфин вызывает анальгезию в 100 раз сильнее морфина (Basso et al., 1985). В анальгетических и даже кататонических дозах дерморфин не влияет на частоту дыхания (Paakkari et al., 1993). У крыс и мышей центральное и периферическое введение дерморфино-подобных пептидов вызывало достоверно более медленное развитие толерантности анальгетического эффекта, чем у морфина (Broccardo et al., 1985; Negri et al., 1995). Синдром отмены, провоцируемый налоксоном, значительно слабее у крыс хронически получавших дерморфин и его аналоги, чем у крыс, потреблявших морфин (Broccardo et al., 1985; Nakata et al., 1986; Chaki et al., 1989; Negri et al,. 1995; Ribaetal., 2002).
Исходя из вышеизложенного, поиск эффективных анальгетиков из группы аналогов дерморфина представляется перспективным. Группа оригинальных аналогов дерморфина с замещениями пролина в шестом положении была синтезирована под руководством академика РАН Н.Ф. Мясоедова в Институте молекулярной генетики РАН. Эти соединения обладают сильным анальгетическим действием (Гузеватых и др. 2002).
Целью настоящего исследования является изучение анальгетической, нейротропной активности, побочных эффектов, толерантности и синдрома отмены пролин-модифицированных аналогов эндогенного пептида дерморфина.
Для выполнения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) Исследовать анальгетическую активность пролин-модифицированных аналогов дерморфина при использовании широкого диапазона тестов определения анальгетической активности и выбрать наиболее активные соединения.
2) Оценить развитие синдрома отмены пролин-модифицированного аналога дерморфина.
3) Изучить развитие толерантности анальгетического действия пролин-модифицированного аналога дерморфина.
4) Изучить нейротропную активность и сопутствующие побочные эффекты, в том числе на систему дыхания и терморегуляцию, пролин-модифицированных аналогов дерморфина.
5) Оценить возможный механизм действия пролин-модифицированных аналогов дерморфина на нейромедиаторном и рецепторном уровне.
Научная новизна Впервые показано, что стереохимическая модификация или дегидрирование пролина в шестом положении в молекуле дерморфина на фоне усиления анальгетической активности,, уменьшает противовоспалительное и седативное действие пептида.
Дерморфин, [ -Рго6]-дерморфин и [Д-Рго6]-дерморфин проявляют анальгетическую активность в тестах соматической и висцеральной болевой чувствительности, вызванной механическими, термическими и химическими стимулами. В тесте соматической болевой чувствительности, вызванной термическим стимулом анальгетическая активность [)-Pro ]-дерморфина сопоставима с активностью морфина и снижается неселективным антагонистом опиоидных рецепторов налоксоном.
Впервые установлено, что дерморфин, Х -Рго6]-дерморфин и [Л-Рго6]-дерморфин уменьшают частоту дыхания при увеличении терапевтических доз в 500 раз. Синдром отмены [1)-Рго6]-дерморфина, провоцируемый налоксоном, протекает с менее выраженными симптомами, по сравнению с морфином. При субхроническом 7-дневном введении к анальгетическому и седативному эффекту [)-Ргоб]-дерморфина развивается толерантность.
Впервые установлено, что бомбезин и его фрагмент бомбезин-(1-2) обладают анальгетической активностью. Показано, что бомбезин и его фрагмент бомбезин-(1-2) связываются с периферическими и- и 5-опиатными рецепторами препаратов изолированных органов подвздошной кишки морской свинки и семявьшосящсго протока мыши.
Научно-практическая значимость.
В результате проведенных исследований выявлены новые соединения, пролиновые аналоги дерморфина - [D-Pro6]-дерморфин и [А-Рго6]-дерморфин, обладающие высокоэффективным обезболивающим действием в широком диапазоне тестов определения анальгетической активности. Пептиды обладают высоким сродством к периферическим ц- и 8-опиоидным рецепторам препаратов изолированных органов и анальгетическое действие пептидов блокируется неселективным антагонистом опиоидных рецепторов налоксоном. Прекращение приема [D-Pro ]-дерморфина не сопровождается резко выраженным синдромом отмены, характерным для морфина. Способность угнетать дыхательный центр у Х -Ргоб]-дерморфина и [А-Рго6]-дерморфина проявляется в дозах в сотни раз превышающие терапевтические дозы, что свидетельствует о большой терапевтической широте. [D-Pro ]-дерморфин, в отличие от [А-Ргоб]-дерморфина не снижает температуру тела при комфортной температуре окружающей среды. Таким образом, [D-Pro6] -дерморфин и [А-Ргоб]-дерморфин по уровню эффективности приближаются к наркотическим анальгетикам, в то время как эндогенная природа соединения позволяет снизить риск возникновения негативных побочных эффектов. Апробация работы
Материалы диссертации представлены на II Международной конференции "Химия, структура и функция биомолекул" (Минск, 2006), International Conference "Basic science for biotechnology and medicine" (Новосибирск, 2006), XIV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2007), III Съезде фармакологов (Москва, 2007), III Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Пущино, 2007),
Публикации. По основным результатам диссертации опубликовано 8 научных работ.
Изучение анальгетической активности дерморфина, [DPro6]-дерморфина и [АРгоб]-дерморфина в тесте фазической соматической боли, вызванной механическим стимулом
Тест зажима основания хвоста основан на раздражении механорецепторов рецептивного поля врожденного рефлекса скручивания к основанию хвоста. В контрольной группе животных реакция на болевое воздействие составила 1.8 ± 0.2 балла. Внутрибрю шинное введение деморфина и [Z)-Pro6]-дерморфина в дозах 1 и 10 мг/кг вызывало достоверное уменьшение выраженности болевой реакции. [ДРго6]-дерморфин проявлял анальгетическую активность только в дозе 10 мг/кг (рис.4). Таким образом, дерморфин обладает анальгетическим действием в тесте механического раздражения основания хвоста. Стереохимическая модификация Pro в молекуле дерморфина не изменяет величину анальгетической реакции. Дегидрирование Pro в молекуле дерморфина приводит к снижению активности и увеличению уровня эффективных доз в тесте соматической боли при действии механического стимула. Рисунок 4. Влияние дерморфина, [Х -Рго6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина на болевую чувствительность в тесте механического раздражения основания хвоста (по Гаффнеру). В контрольной группе животных внутрибрюиганное введение уксусной кислоты вызывало развитие 35.8±3.8 корчей за 30 минут наблюдения. Внутрибрюшинное введение дерморфина приводило к дозо-зависимому снижению числа корчей, вызванных уксусной кислотой (таб.3). Анальгетический эффект наблюдался в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг. Замена Pro6 на Z?-Pro не влияла на анальгетическое действие. Дегидрирование Pro6 в молекуле дерморфина приводило к смещению диапазона действующих доз в сторону увеличения (табл. 3). Таким образом, дерморфин обладает анальгетичсским действием в тесте химического раздражения ноцицепторов. Замена Ргоб на D-стереоизомер не влияет на уровень активности в тесте тонической висцеральной боли.
Дегидрирование Ргоб в молекуле дерморфина уменьшает анальгетическую активность, увеличивая величину активных доз. 4. Изучение анальгетической активности дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина в тесте тонической боли, вызванной интрадсрмалъным введением химического вещества. В контрольной группе формалин вызывал 3.8 ± 1.2 болевых реакций в I фазе, характеризующей действие на первичные афференты боли, и 6.7 + 1.3 болевых реакций во II фазе, вызванных воспалительной реакцией. Внутрибрюшинное введение дерморфина в дозе 0.1 и 1.0 мг/кг уменьшало число болевых реакций в первой и во второй фазе (рис.5). При замещении Pro6 на D-стереоизомер или дегидрование Pro6 не изменяло величины анальгетического действия и уровня эффективных доз. Таким образом, дерморфин и его пролиновые аналоги уменьшают чувствительность первичных афферентов к формалину, и снижают болевую чувствительность при воспалении. Замещение Pro6 на -стереоизомер или дегидрирование Pro не влияет на проявление анальгетического действия в тесте формалиновых болей. 5. Изучение активности дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [APro6]-дерморфина в тесте воспалительной реакции, вызванной конканавалином А. Субплантарное введение пектина растительного происхождения конканавалина А вызывает высвобождение медиаторов воспаления и развитие воспалительной реакции. Внутрибрюшинное введение дерморфина в дозах 0.1, 1.0 и 10.0 мг/кг приводило к статистически достоверному подавлению реакции воспаления на 36.4, 35 и 44.8% соответственно.
Внутрибрюшинное введение [)-Рго6]-дерморфина в дозе 1.0 мг/кг вызывало достоверное уменьшение реакции воспаления на 34.5%, а в дозах 0.1 и 10.0 мг/кг пептид не оказывал значимого противовоспалительного действия (рис.6). Внутрибрюшинное введение [ДРго6]-дерморфина в дозе 10.0 мг/кг вызывало достоверное уменьшение воспалительной реакции на 47.7%, а в дозах 0.1, и 1 мг/кг не оказывало значимого противовоспалительного действия. Таким образом, среди изученных пептидов наибольшим противовоспалительным действием обладает дерморфин. Замещение Pro на )-стереоизомер или дегидрирование Pro6 в молекуле дерморфина вызывает уменьшение противовоспалительного действия пептида. 1. Терморегуляторная активность дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина, [АРго6]-дерморфина при температуре окружающей среды 4-6 С. Исходная температура тела (Тт) и кожи хвоста крыс (Тхв), помещенных в окружающую среду с температурой 4-6 С, составляла: Тт = 36.9 ± 0.06 С. Пребывание в холодной среде вызывало у контрольной группы крыс медленное снижение Тт, в среднем на -0.4 ± 0.1 С за 120 минут. Введение дерморфина в дозе 1 мг/кг приводило к достоверному снижению Тт, которое достигало минимума (АТт = -1.7 ± 0.2 С) через 40 мин после введения пептида и сохранялось в течение всего эксперимента, (рис.7). Введение [ -Рго6]-дерморфина и [ДРго6]-дерморфина в дозе 1 мг/кг приводило к достоверному снижению Тт, которое достигало минимума (ДТт = -0.9 ± 0.1 С и АТт = -1.3 ± 0.2 С соответственно) через 20 мин после введения пептидов и сохранялось до конца эксперимента. Гипотермический эффект [Z)-Pro6]-дерморфина составил 70%, а [АРго6]-дерморфина - 97% от активности дерморфина. (рис.7). дерморфин —Ф— [ОРго6]дерморфин —— [ДРго6]дерморфин - достоверные отличия относительно контрольной группы (р 0.05) Таким образом, в условиях холодной среды дерморфин, [D-Pro ]-дерморфин и [ДРго6]-дерморфин вызывают гипотермию.
Замена Pro6 на D-стереоизомер или его дегидрирование в молекуле дерморфина не влияет на терморегуляторную активность дерморфина в холодной среде. Открытие TRP каналов, чувствительных к температурным стимулам и способным активировать ноцицепторы указывает на наличие общих механизмов в системе терморегуляции и ноцицепции (Clapham, 2003). Дерморфин, как было показано выше, обладает гипотермическим действием. Другим эндогенным пептидом, вызывающим выраженную гипотермию, является бомбезин (Tache et. al., 1980). В холодной среде введение бомбезина вызывало снижение температуры тела (ДТт = -1.0 ± 0.07 С) (рис. 8). Аналогии бомбезина: литорин, бомбезин-(І-З), [Тгр3]-бомбезин-(1-3) не оказывали влияния на температуру тела. [Glu ]-бомбезин-(1-3) снижал температуру тела через 90 и 120 минут после введения. Гипотермической активностью, сравнимой с действием бомбезина, обладал фрагмент бомбезин-(1-2) (ДТт = -1.0 ± 0.07С). Также как и у бомбезина гипотермическое действие сохранялось на протяжении 120 минут. В условиях термонейтральной и жаркой среды бомбезин и бомбезин-(1-2) не влияли на температуру тела. Рисунок 8. Влияние бомбезина и его аналогов, вводимых интраназально в дозе 0.1 мг/кг, на динамику Тт крыс, находящихся в холодной среде (Тк = 4-6С).
Терморегуляторная активность дерморфина, Р>Рго6]-дерморфина, [АРгоб]-дерморфина при температуре окружающей среды 27-28 С (термонейтральная среда).
Введение дерморфина и [ДРго ]-дерморфина в дозе 1 мг/кг приводило к достоверному снижению Тт. Максимальное снижение Тт (ДТт = -0.7 ± 0.1 С) после введения дерморфина наблюдалось через 20 мин после введения пептида и сохранялось в течение 80 мин. После введения [ДРго6]-дерморфина минимальная температура тела (ДТт = -0.9 ± 0.2 С) наблюдалась через 30 мин после его введения и сохранялась до конца эксперимента. Гипотермический эффект [АРго6]-дерморфина составил 68% от активности дерморфина. Введение [ -Ргоб]-дерморфина в дозе 0.5 мг/кг не вызывало достоверных изменений динамики Тт (рис.9). Таким образом, в условиях термонейтральной среды дерморфин вызывает гипотермию. Дегидрирование пролина не влияет на гипотремическое действие, а замена L-Pro6 на D-Pro6 вызывает потерю гипотермического действия. 3. Терморегуляторная активность дерморфина, [D-Pro ]-дерморфина, [АРго6]-дерморфина при температуре окружающей среды 31-32 С. Исходная температура тела и кожи хвоста крыс, помещенных в камеру с температурой 31-32 С, составляла: Тт = 39.1±0.1С. Пребывание в жаркой среде не влияло на Тт у контрольной группы крыс (0.15 ± 0.05 С за 120 мин). Введение дерморфина в дозе 1 мг/кг приводило к достоверному повышению Тт, которое достигало максимума (ДТт = 0.5 ± 0.1 С) через 120 мин после введения пептида (рис. 10). Рисунок 10.
Влияние дерморфина, [)-Рго6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина на динамик} температуры тела крыс, находящихся в жаркой среде (Тк = 31-32 С). Введение [D-Pro ]-дерморфина в дозе 1 мг/кг не оказывало влияния на Тт крыс. Введение [АРго6]-дерморфина в дозе 1 мг/кг вызывало достоверное снижение температуры тела (ДТт = - 0.3 ± 0.1 С) на протяжении 60 мин. Таким образом, в жаркой среде дерморфин повышает температуру тела. Замена L-Рго6 на -стереоизомер в молекуле дерморфина вызывает уменьшение гипертермического действия. Дегидрирование Pro6 в молекуле дерморфина приводит к инверсии температурной реакции на гипотермическую. На основании полученных результатов можно заключить, что, в условиях холодной среды стереохимическая модификация Pro6 не влияет на гипотермический эффект дерморфина. В условиях термонейтральной среды дерморфин вызывает гипотермию. Дегидрирование пролина не влияет на гипотермическое действие, а замена Z-Pro на D-Pro приводит к потере гипотермической активности. В условиях жаркой среды дерморфин повышает температуру тела. Замена L-Pro на -стереоизомер в молекуле дерморфина вызывает уменьшение гипертермического действия. Дегидрирование Pro6 в молекуле дерморфина приводит к инверсии температурной реакции на гипотермическую. /. Влияние дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [ЛPro6]-дерморфина на частоту дыхания мышей.
Агонисты опиатных рецепторов оказывают негативное влияние на ЦНС, подавляя дыхательный центр продолговатого мозга. Целью настоящего исследования явилось изучить влияние дерморфина, его пролиновых аналогов на частоту дыхания беспородных мышей. Рисунок 11. Влияние дерморфина, [Z)-Pro6]-дерморфина и [ДРго6]-дерморфина на частоту дыхания через 30 минут после введения. В контрольной группе животных частота дыхания соответствовала 314±4 движений в минуту. Введение дерморфина в дозах 1 10, 50 и 100 мг/кг достоверно не изменяло частоту дыхания мышей. В дозе 500 мг/кг пептид незначительно снижал частоту дыхания на 18%. В более высоких дозах 600, 700 и 800 мг/кг дерморфин угнетал дыхание на 62, 64.6 и 73.8% соответственно (рис.11). Дегидрирование Pro6 не изменяло уровень активности пептида. Введение [ДРго6]-дерморфина в дозах 1 10, 50 и 100 мг/кг достоверно не изменяло частоту дыхания мышей. В дозе 500 мг/кг пептид незначительно снижал частоту дыхания на 15%. В более высоких дозах 600, 700 и 800 мг/кг [АРго6]-дерморфин угнетал дыхание на 56.1, 60.5 и 70.1% соответственно. Замена Pro6 на стереоизомер D-Pro6 приводила проявлению угнетающего действия в меньших дозах. Введение [2)-Рго ]-дерморфина в дозах 1 10, 50 и 100 мг/кг достоверно не изменяло частоту дыхания мышей. В
Влияние [О-Рго0]-дерморфина на развитие толерантности
Изучение развития острой толерантности к анальгетическому эффекту [Х -Рго61-дерморфина при повторном введении через 5 часов. В контрольной группе животным дважды вводили растворитель с интервалом 5 часов. Внутрибрюшинное введение уксусной кислоты контрольной группе животных через 20 минут после растворителя вызывало появление 47.3±14.3 корчей, что было принято за 100% (таб. 5). Внутрибрюшинное введение [І)-Рго6]-дерморфина в дозе 1 мг/кг за 20 минут до кислоты уменьшало число корчей на 51.2%, а в дозе 10 мг/кг - на 79.3%. Внутрибрюшинное введение пептида за 5 часов до введения уксусной кислоты также уменьшало число корчей. [ -Рго6]-дерморфин в дозе 1 мг/кг за 5 часов до уксусной кислоты уменьшал число корчей на 22.4%, а в дозе 10 мг/кг - на 56.3%. Следовательно, анальгетическое действие [ -Ргоб]-дерморфина сохраняется до 5 часов. Повторное введение пептида [ -Ргоб]-дерморфина через 5 часов после первой инъекции в дозах 1 или 10 мг/кг приводило к усилению анальгетического эффекта в тесте уксусных корчей. При повторном введении пептида в дозе 1 мг/кг число корчей уменьшалось на 66%, а при введении в дозе 10 мг/кг - на 98.1%. Таким образом, при повторном введении [D-Pro ]-дерморфина через 5 часов анальгетическая активность пептида усиливается и толерантность не развивается. Животным контрольной группы 7 дней внутрибрюшинно вводили растворитель. После введения уксусной кислоты контрольным животным наблюдалось 33.2±5.8 корчей. Однократное введение на 7 день [)-Ргоб]-дерморфина в дозе 1 мг/кг уменьшало число корчей на 69.1%, а в дозе 10 мг/кг - на 86.4%. При 6 дневном введении [D-Pro6]-дерморфина в дозах 1 и 10 мг/кг и тестировании на 7 день после введения растворителя число корчей соответствовало уровню контрольной группы.
Следовательно через 24 часа после введения анальгетическое действие пептида не сохраняется (таб.6). 7-дневное введение [D-Pro 6]-дерморфина в дозе 1 мг/кг вызывало уменьшение числа корчей на 75%, а в дозе 10 мг/кг - на 35.3%. Следовательно, при введении пептида в дозе 10 мг/кг 7 дней наблюдается развитие толерантности к анальгетическому действию. При 7-дневном введении пептида в дозе 1 мг/кг толерантность к анальгетическому действию не развивается. Субхроническое 6-дневное введение [.D-Pro ]-дерморфина в дозе 1 мг/кг вызывало усиление анальгетического действия при введении пептида на 7 день в дозе 10 мг/кг, а субхроническое 6-дневное введение [.D-Pro ]-дерморфина в дозе 10 мг/кг устраняло анальгетическое действие при введении пептида на 7 день в дозе 1 мг/кг. Таким образом, субхроническое 7-дневное введение [D-Pro ]-дерморфина приводило к развитию толерантности к анальгетическому действию. Предварительное 6-дневное введение [D-Pro6]-дерморфина не изменяло анальгетическую активность морфина. Предварительное 6-дневное введение морфина устраняло анальгетический эффект [D-Pro6] -дерморфина. 3. Изучение развития острой толерантности к седативному эффекту ГР-Рго6"!-дерморфнна при субхроническом введении 7 дней. Животным контрольной группы 7 дней вводили растворитель. Горизонтальная двигательная активность в тесте открытое поле в контрольной группе составила 50.1±6.4 пересеченных квадрата. Вертикальная двигательная активность, характеризующая ориентировочно-исследовательскую реакцию, составила 8.7±2.1. Число обследованных норок, характеризующих уровень ориентировочно-исследовательской реакции, основанной на норковом рефлексе, - 8.0±2.0 (таб. 7). Однократное введение [D-Pro6]-дерморфина в дозе 1 мг/кг после 6 дней введения растворителя или субхроническое 7 дневное введение пептида не изменяло показатели активности в открытом поле. Субхроническое 6-дневное введение [D-Pro6]-дерморфина в дозах 1 и 10 мг/кг не изменяло поведение в открытом поле на 7 день после введения растворителя. Субхроническое 7-дневное введение [ -Ргоб]-дерморфина в дозе 10 мг/кг также не изменяло уровни двигательной активности. Однократное введение пептида в дозе 10 мг/кг после субхронического 6-дневного введения растворителя или [ -Рго6]-дерморфина в дозе 1 мг/кг вызывало достоверное снижение горизонтальной и вертикальной двигательной активности (таб. 8). Однократное введение [D-Pro6]-дерморфина в дозе 1 мг/кг после субхронического 6-дневного введения пептида в дозе 10 мг/кг приводило к увеличению горизонтальной двигательной активности. Однократное введение [Х -Рго6]-дерморфина в дозе 1 мг/кг после субхронического 6-дневного введения пептида в дозе 10 мг/кг также увеличивало горизонтальную двигательную активность. Сходным образом введение морфина в дозе 5 мг/кг после субхронического 6-дневного введения [ -Рго6]-дерморфина в дозе 10 мг/кг оказывало стимулирующее действие на горизонтальную и вертикальную двигательную активность. Таким образом, субхроническое 7-дневное введение [ -Ргоб]-дерморфина приводит к развитию толерантности к анальгетическому эффекту в тесте уксусных корчей и к седативному эффекту в тесте открытое поле. VI.
Изучение влияние дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина на развитие синдрома отмены, 1. Провоцируемый налоксоном синдром отмены после однократного введения \Р-Ргоб1-дерморфина. Введение налоксона в дозе 10 мг/кг через 1, 3, 5 и 7 часов после однократного введения [ -Рго ]-дерморфина в дозе 100 мг/кг вызывало изменение поведения животных. Прыжки провоцируемые налоксоном наблюдались только через 3 часа после введения пептида. Через 7 часов симптомы синдрома отмены значительно ослабевали (таб. 8). Наиболее оптимально провоцировать синдром отмены через 3 часа после введения пептида. Введение налоксона в дозах 1,5, 10 и 20 мг/кг через 3 часа после введения [D-Pro6]-дерморфина в дозе 100 мг/кг вызывало изменение поведенческих реакций, соответствующих синдрому отмены. По мере увеличения дозы налоксона наблюдалось нарастание интенсивности реакции по следующим показателям: прыжки, стук зубами, тремор (таб. 9). При введении налоксона в дозе 10 мг/кг отмечались наиболее выраженные и разнообразные поведенческие реакции.
Влияние дерморфина, |Т)-Рго6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина на устойчивость к депрессии
В контрольной группе время иммобилизации мышей в тесте неизбегаемого плавания составило 150.8±43.5 сек. Внутрибрюшинное введение дерморфина в дозе 0.1 мг/кг не изменяло время иммобилизации. В дозе 1 и 10 мг/кг дерморфин увеличивал время иммобилизации на 24.7 и 63.2% соответственно (таб. 13). Замена Ргоб на D-стереоизомер или его дегидрирование в молекуле дерморфина приводило к увеличению действующих доз. [Т)-Рго6]-дерморфин увеличивал время иммобилизации на 41%, а [АРгоб]-дерморфин - на 45%. Таким образом, дерморфин, его пролиновые аналоги [АРгоб]-дерморфин и [DPro6]-дерморфин не обладают антидепрессантной активностью. 5. Влияние дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [A Pro6] -дерморфина на продолжительность сна, вызванного гексеналом. В контрольной группе животных гексенал вызывает сон продолжительностью 150±23 сек. Внутрибрюшинное введение дерморфина в дозе 1 мг/кг вызывало увеличение продолжительности сна. Замена Pro6 на D-стереоизомер или его дегидрирование в молекуле дерморфина не влияло на действие дерморфина (таб. 14) 1. Влияние неселективного антагониста опиатных рецепторов налоксона на анальгетический эффект дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина в тесте соліатической боли. В тесте отдергивания хвоста неселективный антагонист опиатных рецепторов налоксон (1 мг/кг, в/б) уменьшает выраженность анальгетического эффекта дерморфина на 53.6% (таб. 15).
Замена Pro6 на D-стереоизомер или его дегидрирование в молекуле дерморфина не изменяло чувствительности анальгетического действия к налоксону. Налоксон снижал анальгетическое действие [АРго ]-дерморфина и [D-Pro ]-дерморфина на 56.9 и 66.4 % соответственно. Таким образом, налоксон в дозе 1 мг/кг при одновременном введении полностью не устраняет анальгетическое действие дерморфина, [Г)-Рго6]-дерморфина и [АРго ]-дерморфина. 2. Влияние неселективного антагониста опиатных рецепторов налоксона на анальгетический эффект дерморфина, [D-Pro ]-дерморфина и [АРго6]-дерморфина в тесте висцеральной боли. В тесте уксусных корчей неселективный антагонист опиатных рецепторов налоксон в дозе 1 мг/кг снижает анальгетическое действие дерморфина в дозе 10 мг/кг на 95% (таб. 16). Замена Pro6 на D-стереоизомер или его дегидрирование в молекуле дерморфина не изменяло чувствительности анальгетического действия к налоксону. Налоксон снижал анальгетический эффект [АРго ]-дерморфина и [D-Pro ]-дерморфина на 103 и 98 % соответственно. Таким образом, налоксон в дозе 1 мг/кг при одновременном введении полностью устраняет анальгетическое действие дерморфина, [D-Pro6] -дерморфина и [АРго6]-дерморфина. Таким образом, налоксон полностью блокирует анальгетический эффект дерморфипа и его пролиновых аналогов [АРго ]-дерморфина и [ -Рго ]-дерморфина в тесте висцеральной боли и снижает в 2 раза действие дерморфина и его аналогов в тесте соматической боли. 3. Влияние дерморфина, [D-Pro6]-дерморфина и [АРго ]-дерморфина па эффекты серотонин омш іет ика. Предшественник серотонина 5-гидрокситриптофан вызывает у мышей характерный гиперкинез в виде встряхиваний головой. В основе развития гиперкинеза лежит активация серотонинергической системы ЦНС (Come et. al., 1963). Введение 5-гидроксотриптофана в дозе 200 мг/кг (в/б) приводило к появлению 57.3±6.8 встряхиваний головой за 30 наблюдаемых минут. Дерморфин достоверно ослаблял интенсивность гиперкинеза на 90% (рис. 16).
Замена Pro на D-стереоизомер или его дегидрирование в молекуле дерморфина не изменяло действия дерморфина. [ОРго6]дерморфин и [ДРго6]дерморфин в дозе 1 мг/кг достоверно уменьшали число встряхиваний на 91.1 и 98.8%. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить наличие у дерморфина, его пролиновых аналогов серотонинергического компонента, по крайней мере, в отношении системы 5-НТ2А Тест ареколинового тремора используется для выявления центрального М-холиноблокирующего компонента действия веществ (Rathbun, Slater, 1963). Ареколин в дозе 25 мг/кг вызывал тремор средней продолжительности 628.3+21.9 секунд. Дерморфин в дозе 1 мг/кг не изменял продолжительность тремора (104% относительно контрольной группы) (рис. 17). Замена Pro6 на /З-стереоизомер или его дегидрирование в молекуле дерморфина не влияло на эффект дерморфина. [ -Рго6]-дерморфин и [АРго6]-дерморфин в дозе 1 мг/кг достоверно также не изменяли продолжительности тремора (103 и 112% соответственно). Оксотреморин - активный метаболит треморина, специфический холинергический мускариновый антагонист. Оксотреморин в дозе 0.5 мг/кг вызывал тремор средней продолжительности 470±218 сек. Дерморфин в дозе 1 мг/кг не изменял продолжительность тремора (101% относительно контрольной группы) (рис. 18).
Замена Pro6 на / стереоизомер или его дегидрирование в молекуле дерморфина также не влияло на эффект дерморфина. [D-Pro6]-дерморфин и [АРго6]-дерморфин в дозе 1 мг/кг не изменяли продолжительности тремора (104 и 108% соответственно). Таким образом, полученные результаты позволяют предположить у дерморфина, его пролиновых аналогов [)-Рго6]-дерморфин и [ДРго6]-дерморфин отсутствие М-холиноблокирующего действия. Рисунок 17. Влияние дерморфина, [)-Рго6]-дерморфина, [ДРго6]-дерморфина на ареколиновый тремор. Тест вертикализации, вызванной апоморфином, основан на повышении дофаминергической нейротрансмиссии в мезолимбической системе (Kelly, Iversen, 1976). Апоморфин - агонист Д2 дофаминовых рецепторов в дозе 5 мг/кг вызывал вертикализацию у мышей средней интенсивности 81.8+13.5 балл. Дерморфин в дозе 1 мг/кг не изменял интенсивность вертикализации (115% относительно контрольной группы) (рис. 15). Замена Pro6 на )-стереоизомер или его дегидрирование в молекуле дерморфина также не влияло на действие дерморфина. [ -Рго6]-дерморфин и [АРго6]-дерморфин в дозе 1 мг/кг не изменяли интенсивность вертикализации (128 и 94.8% соответственно) (рис.19).
Похожие диссертации на Изучение фармакологической активности пролин-модифицированных аналогов дерморфина
![Изучение нейротропной активности производных пиразоло[C]пиридина и родственных соединений](/i/i/4375/171088.png "Изучение нейротропной активности производных пиразоло[C]пиридина и родственных соединений Мелетова Ольга Константиновна")