Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Основные направления противоопухолевых воздействий. 14
1.1.1. Современные представления о механизмах действия противоопухолевых веществ . 17
1.1.2. Способы повышения противоопухолевой активности химиопрепаратов. 31
1.1.2.1. Механизмы действия физических факторов в повышении эффективности противоопухолевой активности химиотерапевтических веществ. 32
1.1.2.2. Озонные технологии как способ повышения оксигенации злокачественных образований . 41
Глава 2. Материалы и методы исследования 51
2.1. Схема эксперимента. Ход исследования. 53
2.2. Методы исследования. 55
2.2.1. Оценка противоопухолевого эффекта. 55
2.2.2. Методы оценки свободнорадикального состояния организма экспериментальных животных . 56
2.2.2.1. Определение свободнорадикальной активности методом индуцированной хемилюминесценции. 57
2.2.2.2. Метод определения концентрации диеновых коньюгатов. 57
2.2.2.3. Метод определения концентрации малонового диальдегида. 58
2.2.2.4. Метод определения окислительной модификации белков по уровню карбонильных производных. 58
2.2.2.5. Метод определения активности супероксиддисмутазы. 59
2.2.2.6. Метод определения активности каталазы. 59
2.2.3. Метод регистрации веществ низкой и средней молекулярной массы 60
2.2.4. Метод ядерно-магнитной спектроскопии плазмы крови. 60
2.2.5. Метод измерения уровня глюкозы в крови. 61
2.2.6. Метод определения активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы. 61
2.2.7. Метод клиновидной дегидратации плазмы крови. 61
2.2.8. Метод оценки поведения в тесте «открытое поле». 62
2.2.9. Результаты статистической обработки. 63
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Оценка противоопухолевой активности комбинированного использования озонированного физиологического раствора и химиопрепарата в условиях роста гепатомы 27 и гепатомы Зайделя. 64
3.1.1. Рост гепатомы 27 и гепатомы Зайделя и продолжительность жизни животных-опухоленосителей на фоне введения озонированного физиологического раствора и 5-фторурацила . 64
3.1.2. Рост гепатомы Зайделя на фоне введения озонированного физиологического раствора и доксорубицина. 71
Заключение к главе 3.1. 73
3.2. Особенности свободнорадикального окисления на фоне комбинированного использования озонированного физиологического раствора и химиопрепарата. 75
3.2.1. Влияние озонированного физиологического раствора и 5-фторурацила на свободнорадикальные процессы организма животных в условиях роста гепатомы Зайделя и гепатомы 27. 76
3.2.2. Влияние озонированного физиологического раствора и
доксорубицина на уровень свободнорадикального окисления плазмы крови животных на фоне роста гепатомы Зайделя. 83
Заключение к главе 3.2. 86
3.3. Уровень веществ низкой и средней молекулярной массы в плазме крови экспериментальных животных на фоне введения озонированного физиологического раствора и химиопрепарата. 87
3.3.1. Влияние озонированного физиологического раствора и 5- фторурацила на уровень веществ низкой и средней молекулярной массы в плазме крови и гомогенатах печени животных-опухоленосителей. 88
3.3.2. Оценка уровня веществ низкой и средней молекулярной массы в плазме крови и гомогенатах печени животных-опухоленосителей на фоне введения озонированного физиологического раствора и доксорубицина. 92
Заключение к главе 3.3. 93
3.4. Влияние совместного введения озонированного физиологического раствора и химиопрепарата на показатели углеводного, белкового и энергообмена организма животных в условиях роста опухоли. 94
3.4.1. Изменение показателей белкового, углеводного и энергообмена в организме крыс с гепатомой 27 на фоне введения озонированного физиологического раствора и химиопрепарата. 94
3.4.2. Изменение показателей белкового и углеводного обменов в организме крыс с гепатомой Зайделя на фоне комбинированного применения озонированного физиологического раствора и химиопрепарата. 97
3.4.3. Уровень аминотрансфераз в плазме крови животных-опухоленосителей на фоне комбинированного применения озонированного физиологического раствора и химиопрепарата. 99
Заключение к главе 3.4. 102
3.5. Влияние комбинированного введения озонированного физиологического раствора и исследуемых химиопрепаратов на морфологические показатели организма животных на фоне роста гепатомы 27 и гепатомы Зайделя. 103
Заключение к главе 3.5. 107
З.б.Особенности динамики поведения животных на фоне роста гепатомы 27 и оценка эффективности терапевтических воздействий. 113
Заключение к главе 3.6. 116
Заключение 117
Выводы 124
Список литературы
- Современные представления о механизмах действия противоопухолевых веществ
- Озонные технологии как способ повышения оксигенации злокачественных образований
- Методы оценки свободнорадикального состояния организма экспериментальных животных
- Рост гепатомы 27 и гепатомы Зайделя и продолжительность жизни животных-опухоленосителей на фоне введения озонированного физиологического раствора и 5-фторурацила
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Авторами кислородно-перекисной концепции онкогенеза Лю Б.И. и Шайхутдиновым Е.М. (1991) высказано предположение, что результаты любых воздействий, интенсифицирующих свободнорадикальные процессы, должны появиться, прежде всего, в клетках неоплазмы, поскольку именно они наиболее подготовлены к переходу в указанное состояние и, следовательно, объективно чувствительнее к подобным воздействиям [93].
Анализ современной литературы показал, что физико-химические воздействия на организм со злокачественным новообразованием, будь то ионизирующее излучение [15, 30, 71], низкоинтенсивное лазерное излучение [18, 27], фотодинамическая терапия [55, 84], гипербарическая оксигенация [110] приводят к значительному увеличению в нем активных кислородных метаболитов, что в свою очередь обуславливает усиление окислительной модификации макромолекул [182,183].
Установлено, что одним из механизмов реализации токсических эффектов противоопухолевых препаратов также является активация процессов свободнорадикального окисления (СРО) как в бластотрансформированных, так и нормальных тканях организма [32, 99, 126, 127].
В настоящее время противоопухолевая химиотерапия, наряду с хирургическим вмешательством и лучевой терапией, является одним из важнейших и наиболее динамично развивающихся разделов современной онкологии [112]. Тем не менее, поиск способов повышения ее эффективности с минимальным отрицательным воздействием на нормальные клетки остается актуальным [132].
Экспериментальные работы, выполненные на нелинейных крысах с перевивными штаммами саркома-45 и лимфосаркома Плисса, выявили, что озон в высоких концентрациях порядка 5 мг/л при локальном введении обладает
9 антиканцерогенным действием [144], а в комбинированном использовании с ионизирующим излучением повышает эффективность противоопухолевой терапии [146].
В клинической практике показана эффективность озонированного физиологического раствора (ОФР) после курса полихимиотерапии в качестве средства, позволяющего снизить токсические эффекты цитостатиков [5, 35, 36].
Учитывая, что одним из механизмов противоопухолевого действия озона является повышение оксигенации опухолевой ткани, логично предположить, что комбинированное использование озона и химиотерапевтических воздействий приведет к повышению избирательности действия последнего, основанного на кислородном эффекте. В связи с этим целесообразно изучить биологические эффекты этих физико-химических воздействий в условиях экспериментальной неоплазии.
Цель исследования;
Изучить влияние комбинированного действия озонированного физиологического раствора и химиопрепаратов на рост гепатомы 27 и гепатомы Зайделя, на биохимические, морфологические, физиологические показатели организма животных-опухоленосителей.
Задачи исследования;
Исследовать действие комбинированного введения ОФР и химиопрепаратов (5-фторурацила (5-ФУ) и доксорубицина (ДР)) на степень ингибирования роста опухоли и продолжительность жизни экспериментальных животных в условиях роста гепатомы 27 и гепатомы Зайделя.
Изучить влияние ОФР и химиопрепаратов на состояние свободнорадикальных процессов экспериментальных животных.
3. Оценить влияние ОФР и 5-ФУ на некоторые показатели
биоэнергетических процессов организма животных в условиях роста
гепатомы 27 и гепатомы Зайделя.
4. Выявить взаимосвязь между параметрами свободнорадикального
баланса с характеристиками структуропостроения фаций плазмы крови
экспериментальных животных.
5. Изучить влияние ОФР и 5-ФУ на основные показатели
поведенческих реакций экспериментальных животных в тесте «открытое
поле».
Научная новизна.
Впервые изучен противоопухолевый эффект комбинированного влияния ОФР и химиопрепаратов. Показано, что совместное введение ОФР с концентрацией 0,2 мг/л в/б и 5-ФУ крысам с перевитой гепатомой 27 и гепатомой Зайделя общим курсом 10 дней тормозит рост опухоли (Заявка на патент №2007119177/14).
Введение ОФР с концентрацией 0,2 мг/л в/б и ДР в/в крысам с перевитой гепатомой Зайделя общим курсом 7 дней тормозит рост гепатомы.
Впервые показано, что благодаря потенцирующим связям озона и ДР, доза последнего может быть снижена, в связи с чем уменьшается вероятность побочных эффектов химиотерапевтического воздействия.
Показано, что совместное применение ОФР с концентрацией 0,2 мг/л и 5-ФУ; ОФР с концентрацией 0,2 мг/л и ДР приводит к нормализации интенсивности хемилюминесцентного свечения, показателей перекисного окисления липидов, уровня окислительной модификации белков, общей антиоксидантной активности и активности каталазы плазмы крови животных-опухоленосителей.
Установлено, что совместное применение ОФР и 5-ФУ; ОФР с концентрацией и ДР приводит к нормализации показателей углеводного и белкового обменов организма животных-опухоленосителей.
Впервые изучены особенности структурной организации фации плазмы крови крыс с гепатомой 27 и гепатомой Зайделя на фоне введения ОФР и химиопрепаратов. Выявлена корреляционная взаимосвязь между показателями свободнорадикальной активности и кристаллооптическими характеристиками плазмы крови: максимальная интенсивность хемилюминесценции / количество и ширина трещин; общая антиоксидантная активность / количество и ширина трещин; ширина периферической зоны / содержание альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов; количество морщин / уровень общей АОА.
Показано, что применение ОФР и 5-ФУ приводит к нормализации основных показателей поведенческих реакций.
Практическая значимость.
Результаты работы являются обоснованием для экспериментальных и клинических исследований возможностей комбинированного применения ОФР и цитотоксических препаратов как способа повышения противоопухолевого эффекта химиотерапевтических воздействий и способа снижения цитотоксической дозы препарата.
Показан корригирующий эффект комплексного применения ОФР и химиотерапевтических воздействий на состояние про-, антиоксидантной систем и биоэнергетических процессов организма-опухоленосителя. Это может способствовать повышению эффективности процессов адаптации организма с опухолью к химиотерапевтическим воздействиям, снижению токсического влияния продуктов обмена опухолевой ткани на организм.
Показано, что методом клиновидной дегидратации плазмы крови можно экспрессно оценить изменения в организме, вызываемые действием экзогенных и эндогенных факторов.
Применение ОФР восстанавливает основные показатели поведенческих реакций, нарушенные на фоне роста опухоли и усугубленные цитостатическим лечением.
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 60-й научной конференции ННГУ «Биосистемы: организация, поведение и управление» (Нижний Новгород, 2007), на XII Нижегородской сессии молодых ученых (естественные науки) (Нижний Новгород, 2007), на VI всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2007).
По теме диссертационного исследования опубликовано 12 работ, из них 2 статьи в Нижегородском медицинском журнале, 4 статьи в сборниках научных трудов (Нижний Новгород, Смоленск; Ростов-на-Дону, Самара), 5 работ в тезисах научных конференций и 1 заявка на патент.
Положения, выносимые на защиту;
Комбинированное применение ОФР концентрацией 0,2 мг/л и 5-ФУ в дозе 10 мг/кг ингибирует рост гепатомы 27 и гепатомы Зайделя и увеличивает продолжительность жизни животных-опухоленосителей.
Введение ОФР с концентрацией 0,2 мг/л в/б и ДР в дозе 1,2 мг/кг веса в/в крысам с перевитой гепатомой Зайделя общим курсом 7 дней тормозит рост гепатомы.
Введение ОФР позволяет снизить дозу ДР, не ослабляя противоопухолевое действие и снижая окислительную нагрузку на организм.
Введение ОФР и 5-ФУ общим курсом 10 дней; ОФР и ДР общим курсом 7 дней способствует восстановлению свободнорадикального баланса в организме экспериментальных животных.
Комбинированное введение ОФР и 5-ФУ общим курсом 10 дней; ОФР и ДР общим курсом 7 дней приводит к нормализации некоторых показателей биоэнергетических процессов организма экспериментальных животных.
Эффективность совместного применения ОФР и цитотоксического средства отражается в нормализации структуропостроения плазмы крови животных-опухоленосителей; коррелирует с параметрами свободнорадикального окисления.
Применение ОФР и 5-ФУ общим курсом 10 дней приводит к нормализации основных показателей поведенческих реакций.
Современные представления о механизмах действия противоопухолевых веществ
Впервые механизм действия цитостатических веществ на опухоль при их внутриартериальном введении был обоснован Bierman et al. в 1950 году. Они обнаружили высокую концентрацию противоопухолевых химиопрепаратов в опухоли при низкой их концентрации в общем кровотоке. Эти данные были подтверждены позднее другими исследователями [77].
Противоопухолевый эффект химиотерапевтических веществ можно получить различными путями: - прямым повреждающим действием на опухолевую клетку; - увеличением времени генерации опухолевых клеток настолько, что они практически перестают делиться; - повреждением клеток и вследствие этого потерей ими основных свойств метастазирования и инвазивности; стимуляцией иммунологических реакций, направленных на опухолевые клетки; - коррекцией апоптоза опухолевых клеток. Однако цитотоксические вещества не обладают избирательным действием только на опухолевые клетки, они влияют и на пролиферирующие клетки любых тканей и органов. Данное влияние противоопухолевые соединения осуществляют различными путями, но чаще всего путем нарушения синтеза нуклеиновых кислот, что приводит к прекращению деления и разрушению опухоли. В зависимости от механизма действия химиотерапевтические средства влияют на клетки находящиеся в разных фазах клеточного цикла, который состоит из четырех фаз. Три фазы из четырех приходятся на интерфазу: I. В период интерфазы в клетке осуществляется ряд подготовительных процессов стимулирующих переход ее в состояние деления. В соответствие с этими процессами интерфаза подразделяется на три периода: 1) накопление предшественников синтеза ДНК и белкового компонента хромосом, а также веществ ахроматического аппарата и митотических центров - период G (период пресинтеза); 2) синтез ДНК и гистонного компонента хромосомы, удвоение хромосом и митотических центров - период S (период синтеза); 3) накопление энергетических ресурсов, обеспечивающих кинетику митоза - период G-2 (период премитоза). II. Четвертая фаза - митоз. Действие большинства химиопрепаратов не ограничивается одной фазой, разное по степени выраженности влияние оказывается на клетки, находящиеся в различных фазах митотического цикла: чаще действие - в фазе пресинтеза, реже - в другие. Некоторые исследователи полагают, что образование свободных радикалов при использовании цитостатических соединений может быть основой противоопухолевой активности [32]. При этом алкилирующие вещества, - путем алкилирования, соединяются с молекулами органических соединений; влияя на воспроизведение нуклеиновых кислот при транскрипции, нарушая синтез ДНК и РНК и вызывая гибель клеток.
В основе механизма действия алкилирующих веществ лежит образование в нейтральных или щелочных растворах высокоактивных четвертичных аммониевых (или им подобных) катионов, образующих ковалентные связи с нуклеофильными соединениями, в т.ч. с такими биологически важными группами, как фосфатные, аминные, сульфгидрильные, имидазольные и др.
Цитотоксическое действие алкилирующих соединений обусловлено в первую очередь, алкилированием структурных элементов ДНК (пуринов, пиримидинов) и РНК в меньшей степени, в результате чего нарушается стабильность, вязкость, целостность нитей ДНК и РНК, жизнедеятельность клеток, блокируется участие различных групп в метаболических реакциях, нарушается митотическое деление и репликация клеток. Клетки при воздействии алкилирующих соединений останавливаются в G1 фазе. Высокой чувствительностью к этим веществам обладают ядра клеток гиперплазированных (опухолевых) тканей и лимфоидной ткани.
Одними из первых в качестве противоопухолевых средств стали применять производные бис-(бета-хлорэтил)амина. Экспериментальные исследования показали, что азотистый иприт оказывает специфическое цитотоксическое влияние на лимфоидные ткани и обладает противоопухолевой активностью при лимфосаркоме у мышей. Клинические испытания трихлорэтиламина были начаты в 1942г., что явилось началом эры современной химиотерапии опухолей. Вслед за бис-(бета-хлорэтил)аминами были получены цитостатические алкилирующие соединения других химических групп: этиленимины и этилендиамины, алкилированные сульфонаты, производные метансульфоновой кислоты, триазены, препараты платины, нитрозомочевины и др. В настоящее время наиболее широко применяются из хлорэтиламинов циклофосфамид и ифосфамид при раке яичника, молочной железы, саркомах мягких тканей, мелкоклеточном раке легкого.
Этиленимины (тиотепа, дипин, бензотэф, имифос и др.) по механизму действия близки к производным бис-(бета-хлорэтил)амина. Они блокируют митотическое деление клеток, образуя поперечные связи между цепями молекулы ДНК, что препятствует ее репликации (рак яичников, молочной железы, опухолевые серозиты) [77].
Механизм противоопухолевого действия производных платины (карбоплатин, цисплатин) связан со способностью к бифункциональному алкилированию нитей ДНК, ведущему к длительному подавлению биосинтеза нуклеиновых кислот и гибели клеток. Производные платины не обладают специфичностью в отношении клеточного цикла, действуют в фазе GO, на первом этапе тормозят синтез ДНК, РНК и белка, а на втором образуются метаболические продукты, действующие только на синтез ДНК.
Противоопухолевый эффект производных нитрозомочевины (цикло- и фазонеспецифичный) обусловлен переносом алкильных групп на нуклеофильные центры ДНК, РНК, белков и алкилированием их молекул, что приводит к гибели опухолевой клетки. Отличительной особенностью препаратов данной группы является их способность проходить через гематоэнцефалический барьер и отсутствие перекрестной резистентности с производными хлорэтиламинов и этилениминов. Они эффективны при первичных и метастатических опухолях головного и спинного мозга [77, 133].
Антиметаболитами называют вещества, близкие по химической структуре к эндогенным продуктам метаболизма и ингибирующие, в результате конкурентных отношений, определенные биохимические процессы, что сопровождается нарушением функции клеток и торможением клеточного роста. Антиметаболиты включаются в состав нуклеиновых кислот вместо сходных с ними по структуре клеточных метаболитов или ингибируют активность ферментов, участвующих в синтезе нуклеиновых кислот, что ведет к блокированию важнейших биохимических реакций в клетке [77].
Противоопухолевую активность антиметаболитов обнаружили в начале 1960-х гг. Первыми противоопухолевыми антиметаболитами, примененными в клинике, были антагонисты фолатов. Исходной посылкой для исследования этих веществ в качестве противоопухолевых агентов послужили данные о важной роли фолатов (фолиевая кислота (ФК) - птероилглутаминовая кислота) в размножении клеток в качестве эссенциальных витаминов, а также экспериментальные данные о том, что искусственное создание дефицита фолатов способно затормозить развитие лейкозного процесса [77, 133]. Следует отметить, что первоначально антиметаболитный эффект ФК был показан на некоторых микробах, для которых фолиевая кислота играет роль витаминов [77].
Озонные технологии как способ повышения оксигенации злокачественных образований
Таким образом, известные противоопухолевые физико-химические воздействия направлены на изменение кислородного, свободнорадикального гомеостаза. Сопоставление особенностей злокачественной трансформации, общепринятых методов лечения неоплазм и основных свойств и механизмов действия озона привело к идее применения озонотерапии в онкологии. На наш взгляд, озонотерапия - один из методов окислительной терапии, при котором в качестве источника АФК применяется озон (трехатомная аллотропная модификация кислорода, окислительная способность которого, обусловленная полярным строением его химической молекулы, обеспечивает высокую реакционную способность) - наиболее физиологический, эффективный и доступный метод, позволяющий воздействовать на свободнорадикальные процессы [145].
Несмотря на определенные успехи озонотерапии, проблема озона в биологии, ветеринарии и медицине вызывает крайне противоречивые суждения, поскольку зачастую он используется без рациональной основы, стандартизированных концентраций и адекватных методов контроля. В настоящее время существуют две научные школы: одна утверждает, что озон токсичен, повышенная концентрация озона в тропосфере способствует появлению легочной токсичности [3, 57, 164, 176], а другая считает, что озон может использоваться как терапевтическое средство [73, 113, 199]. Однако исследователи в медико-биологической среде признают, что локально или парентерально используемые озоно-кислородные газовые смеси представляют собой активное вещество с различными биофизическими и биохимическими свойствами.
Использование озона в медицине обосновано работами M.M.Wolff (1988), O.Rokitansky (1982), R.Viebahn (1985), S.Rilling (1987), V.Bocci (1990), а также основоположниками отечественной озонотерапии Г.А.Бояринова (1989), С.П.Перетягина (1991) и К.Н. Конторщиковой (1992) [23, 75, 113, 158, 191,194,206,210]. Применение озона в биологии, ветеринарии, медицине основывается на двух принципиальных подходах, обусловленных его свойствами. Во-первых, прямым действием озона, обнаруживаемом при локальном применении в виде дезинфекционной активности (бактерицидное, фунгицидное, вирицидное свойства используются для очищения ран, усиления антимикробной защиты организма и активации местного иммунитета). Токсическое действие озона, проявляемое им в высоких концентрациях и в отдельных случаях при локальном воздействии, объясняют непосредственным окислением белков: гистидиновых и тирозиновых остатков и молекул ДНК [130, 161]. Поэтому высокие концентрации озона применяются в гнойной хирургии, дерматологии, стоматологии, косметологии, гинекологии [106, 107, 153, 167,179, 190,196, 197]. Во-вторых, системным эффектом озона вследствие индуцируемых озоном низких концентрации перекисей (активация эритроцитарного обмена, улучшение реологических свойств крови, активации энергетического обмена, модуляции окислительно-востановительного гомеостаза) [156, 161, 194, 206]. Поэтому низкие концентрации озона, стимулирующие метаболизм, используются в кардиологии, геронтологии, иммунологии, неврологии [106, 107].
Предположение о нарушении озоном метаболизма бластотрансформированных клеток [186, 203, 204, 205] было высказано на основании двух открытий: -в 1966г. Warburg О. (Германия) показал, что ключевой посылкой для развития опухоли является недостаток кислорода на клеточном уровне [67, 203]; - в 1974г. Varro J. (Германия) сообщил о непереносимости опухолевыми клетками пероксидов. Однако работы Varro J. и результаты ранних экспериментальных исследований отечественных ученых А.И.Журавлева, Б.Н.Тарусова (1962), показавших низкое содержание перекисей в опухоли по сравнению с нормальной тканью, не нашли применения в клинической онкологии. В 1980 году Н.Sweet с коллегами представил доказательство ингибирующего действия озона по отношению к опухолевым клеткам в условиях in vitro. При этом была подчеркнута слабая способность опухолевых клеток легких, молочной железы и матки компенсировать окислительный взрыв, вызванный озоном, по сравнению с нормальными клетками [201].
Методы оценки свободнорадикального состояния организма экспериментальных животных
Учитывая, что свободнорадикальное окисление является многоступенчатым процессом окислительной деструкции липидов и белков, в ходе которого образуются различные интермедиа, для объективной оценки состояние процессов пероксидации, были применены методы, признанные многими авторами ключевыми и наиболее информативны: в плазме крови, гомогенатах печени оценивали методом индуцированной биохемилюминесценции интегральные показатели свободнорадикальной активности, кроме того, содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), степень окислительной модификации белков по уровню карбонильных производных, а также уровень активности супероксиддисмутазы и каталазы. Метод индуцированной перекисью водорода и сульфатом железа хемилюминесценции (ХЛ) основан на том, что в представленной системе происходит каталитическое разложение перекиси водорода, ионами металла с переменной валентностью - двухвалентным железом: ROOH + Fe -» О її RO + ОН" + Fe (реакция Фентона). Образующиеся СР RO и ОН" вступают в реакцию активации СРО в биологическом субстрате, что приводит к образованию неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением кванта света ROOOOR - (RO) + ROH + (02) .
Информативными показателями считаются Imax - максимальная интенсивность свечения исследуемой пробы, измеряемая в mV. Imax отражает свободнорадикальную активность образца. Показатель S -светосумма ХЛ за определенное время, обратно пропорционален антиоксидантной активности (АОА) пробы. АОА - суммарная физико-химическая величина, характеризующая способность данного субстрата тормозить реакции окисления. Она зависит от относительного количества и физико-химических параметров каждого из биоантиоксидантов, имеющихся в анализируемой смеси, их взаимного влияния друг на друга, от присутствия веществ, способных усиливать или ослаблять действие биоантиоксидантов [82].
Метод основан на том, что в ходе ПОЛ на стадии образования гидроперекисей в молекулах полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) возникают сопряженные двойные связи. Это сопровождается повышением оптической плотности раствора липидов в метанол-гексане в ультрафиолетовой области спектра. При этом на длине волны 233 нм выявляются сопряжения двух двойных связей - диеновые коньюгаты (ДК). Измерения оптической плотности проводились на спектрофотометре HELIOS ESCORT-300C, Thermo Spectronic, USA. Расчеты проводились по формуле: СДк=Е/А Сдк - концентрация ДК; Е - оптическая плотность опытной пробы; А -концентрация общих липидов. Концентрацию ДК выражали в единицах оптической плотности относительно количества общих липидов. Общие липиды определялись с помощью стандартного набора реактивов «Lachema» (Чехия). Концентрацию ОЛ выражали в г/л. Принцип метода состоит в том, что в кислой среде при высокой температуре малоновый диальдегид (МДА) реагирует с 2 молекулами тиобарбитуровой кислоты с образованием окрашенного триметилового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532 нм. Расчеты проводились по формуле: СмДА=Е/А СМДА - концентрация МДА; Е - оптическая плотность опытной пробы; А - концентрация общих липидов. Концентрацию альдегида выражали в единицах оптической плотности относительно количества общих липидов. Общие липиды определялись с помощью стандартного набора реактивов «Lachema» (Чехия). Метод предложен Levine (1990), в данной работе используется модификация метода Е.Е. Дубининой (1995). В результате окислительной модификации белков образуются альдегидные и кетонные группировки аминокислотных остатков. Данный метод основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов. Оптическую плотность образовавшихся альдегид- (270) и кетон-динитрофенилгидразонов (363) регистрировали на спектрофотометре (HELIOS ESCORT-300C, Thermo Spectronic, USA). Уровень окислительной модификации белков выражали в единицах оптической плотности, отнесенных к 1 г белка. Общий белок определяли с помощью стандартного набора реагентов фирмы «Vital diagnostic» (г. Санкт-Петербург). Метод основан на способности фермента супероксиддисмутазы (СОД) конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидные анион-радикалы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия НАДН и феназинметасульфата. В результате этой реакции НСТ восстанавливается с образованием гидразинтетразолия фиолетового цвета. Интенсивность окраски, которую регистрируют при длине волны 540 нм, обратно пропорциональна активности СОД. В присутствии СОД процент восстановления НСТ уменьшается.
Активность фермента выражается в единицах активности на мг гемоглобина в минуту (ед.акт./мг НЬ мин). Принцип определения разработан Aebi (1970), адаптирован Королкж и др. (1988), Чевари и др. (1991). Принцип метода состоит в способности каталазы разрушать в нейтральной среде перекись водорода до молекулярного кислорода и воды и заключается в спетрофотометрическом измерении убыли перекиси водорода при 240 нм. Активность выражают в ед. активности и относят к 1 г гемоглобина. Гемоглобин крови оценивали по реакции гемоглобина с железосинеродистым калием и ацетонциангидрином. К разряду веществ низкой и средней молекулярной массы относятся нетоксические соединения: мочевина, креатин, глюкоза, аминокислоты, жирные кислоты, ренин, цАМФ, глюкагон, инсулин, паратгормон, серотонин, гистамин, адреналин и др., которые в высоких концентрациях совместно могут проявлять токсическую активность.
Суть метода состоит в осаждении крупномолекулярных частиц плазмы крови и эритроцитов 15%-ым раствором трихлоруксусной кислоты с последующей спектрофотометрией водного раствора супернатанта при длине волны 238-298 нм (шаг длины волны 10 нм). Регистрация спектра исследуемого раствора в ультрафиолетовой зоне позволяет произвести комплексную оценку токсических повреждающих факторов и более 200 наименований веществ нормального и патологического метаболизма [105]. Расчет количества веществ низкой и средней молекулярной массы производится по формуле: ВНСММ пл = (Е238 + Е248 + Е258 +... + Е 298) 10, усл.ед. Результаты представляются в условных единицах. Явление ядерного магнитного резонанса (ЯМР) открыто в 1946 г. независимо группами исследователей пол руководством Ф.Блоха и Э.Парселла. ЯМР - резонансное поглощение электромагнитных волн, обусловленное квантовыми переходами атомных ядер между энергетическими состояниями с разными ориентациями спина ядра. Для большинства ядер в магнитных полях 103-104 Э ЯМР наблюдается в диапазоне частот 1-Ю Гц.
Рост гепатомы 27 и гепатомы Зайделя и продолжительность жизни животных-опухоленосителей на фоне введения озонированного физиологического раствора и 5-фторурацила
Воздействия начинали с момента достижения размеров гепатомы 27 и гепатомы Зайделя 0,5 см в диаметре (с 8 суток роста Г-27, на 7 день роста ГЗ). Контролем служили показатели животных-опухоленосителей, получавшие внутрибрюшинные инъекции стерильного физиологического раствора (ФР). Результаты исследований показали, что дополнительное применение ОФР усиливает противоопухолевый эффект 5-ФУ, что выражается в ингибировании роста опухоли и увеличении продолжительности жизни животных с Г-27 и ГЗ. Степень ингибирования роста опухоли определяли по показателю торможение роста опухоли (ТРО), вычисляемого по формуле [132]: ТРО =(Уконтроля-Уопыта)/Уконтроля 100%, Где: V - средний объем опухоли (мм ) в подопытной и контрольной группах, соответственно, на конкретный срок. Результаты представлены в таблице 3.1. Так, комбинированное введение ОФР по 0,3 мл в/б и 5-ФУ в дозе 10 мг/кг веса в/м крысам с перевитой Г-27 и ГЗ общим курсом 10 дней тормозит рост экспериментальных опухолей на 54% и 66% (табл.3.1), соответственно (Р 0,5). В соответствии с литературными данными, достоверным считается 40%-ное торможение роста опухоли при условии, что введение препаратов было начато на ранних этапах опухоленосительства. Необходимо отметить, что в данном исследовании результат был получен на 19-м дне роста Г-27 и 18 дне роста ГЗ, что соответствует позднему сроку развития опухоли в организме, а вес опухоли в пересчете на вес тела человека (70 кг) составляет 550 г. В связи с чем, полученные данные демонстрируют высокую опухолетоксическую эффективность озона.
Из-за выраженной дефектности кровоснабжения (вследствие неконтролируемого роста и диспропорции между паренхимой и стромой, несущей питающие в опухоль сосуды) до 99% клеток всей опухолевой популяции оказывается в состоянии гипоксии. Эта позволило авторам кислородно-перекисной концепции предположить, что результаты любых воздействий, интенсифицирующих свободнорадикальные процессы ПОЛ, должны проявляться, прежде всего, в клетках неоплазмы, поскольку именно они наиболее подготовлены к переходу в указанное состояние и, следовательно, объективно чувствительнее к подобным воздействиям.
Показанный в нашем исследовании выраженный противоопухолевый эффект комбинированного применения ОФР и 5-ФУ подтверждает положение о возможности торможения роста опухоли посредством усиления поражения клеток в присутствие продуктов озонолиза [50, 145] - увеличения образования перекисей, о непереносимости которых неоднократно сообщалось [26, 54,102]. Усиление снабжения кислородом гипоксических зон опухоли, и как следствие запуск каскада свободнорадикальных реакций, реализуется через улучшение кислородного транспорта в результате активации работы пентозо-фосфатного шунта (ПФШ). Известно, что озон улучшает реологические свойства крови, повышая эластичность эритроцитов и парциальное давление кислорода в артериальной крови [113, 156, 157]. В результате ускорения гликолиза в эритроцитах образуется 2,3-дифосфоглицерат, сдвигающий кривую диссоциации в сторону высвобождения кислорода, облегчая его поглощение для тканей. При введении озона образуются активные кислородные метаболиты, которые, по мнению Altaian N., могут вступать в реакцию с субстратом водорода и приводить в действие нарушенное конечное окисление опухолевой клетки: гликолиз, Р-окисление жирных кислот, цикл Кребса [153]. Улучшение кислородного режима опухоли, повышение в ее гипоксических клетках парциального давления кислорода, вероятно, приводит, согласно кислородному эффекту, к повышению чувствительности опухолевых клеток, к усилению повреждающего действия химиотерапевтических веществ.
По всей видимости, введение ОФР способствует тому, что опухоль не в состоянии сдерживать усиленное свободнорадикальное окисление, продукты которого, повреждая митотическое веретено деления [25], останавливают клеточную пролиферацию.
Заслуживает особого внимания тот факт, что важной мишенью при повреждении оснований ДНК под действием АФК является цитозин: при окислительном дезаминировании цитозин превращается в урацил [37], а одним из механизмов действия 5-ФУ является нарушение структуры и функции РНК за счет включения 5-ФУ вместо урацила. Следовательно, запуск продуктами озонолиза каскада окислительных реакций в бластотрансформированных клетках приводит к модификации нуклеотидных оснований и усилению повреждения опухолевых клеток 5-ФУ.
Однако в клетке всегда существуют механизмы репарации, и радикалы мишеней (молекул ДНК, например) могут восстановиться химическим путем, тогда повреждение генетической информации клетки не будет реализовано. Однако окисление этого радикала, акцептирование электрона электронно-акцепторным соединением (ЭАС) приведет к реализации повреждения. Поэтому можно предположить, что пероксиды и озониды как раз и выступают в роли ЭАС и приводят к усилению цитотоксического действия 5-ФУ.
Метаболические сдвиги, происходящие в организме-опухоленосителе по мере развития ЗНО, затрагивают к иммунологический статус организма. Принято считать, что опухолевые клетки в организме распознаются как чужеродные и элиминируются клетками иммунной системы: лимфоцитами, макрофагами, моноцитами, гранулоцитами. Реакции, в которых участвуют иммунокомпетентные клетки, обуславливают противоопухолевую резистентность организма. В частности, гранулоциты способны повреждать бластотрансформированные клетки путем активированного фагоцитоза [1? 31, 34, 63, 103]. Цитотоксичность фагоцитов определяется их способностью нарабатывать АФК, которые в процессе фагоцитоза могут покидать мембрану фагоцита и выходить из клетки [129]. При истощенной иммунной системе естественные реакции защиты теряют свою мощность. Перекись водорода не выделяется или выделяется в недостаточном количестве для поражения чужеродного объекта [96, 190], что свидетельствует об угнетении кислород-зависимых реакций фагоцитов.
Современные исследования зарубежных ученых доказывают выдвинутую Воссі гипотезу о том, что озон в организме, возможно, стимулирует производство цитокинов, которые в свою очередь активируют иммунные клетки [157]. Об иммуномодулирующем эффекте озона впервые было заявлено еще в 1989 г. Процесс активации фагоцитоза при воздействии озоном происходит за счет образования пероксидов, происходит коррекция всех стадий фагоцитоза [74]. Одним из возможных вариантов активации фагоцитоза является повышение синтеза фагоцитстимулирующего фактора.
Работы Bocci V. (1990г.) [158], Viebahn R. (1991г.) [206] Коноплянникова А.Г. (1992г.) [72] подтверждают активацию иммунологического механизма защиты озоном. АФК, возникающие в процессе озонолиза, действуют как мессенджеры при активации ядерного фактора NF-kB, что позволяет заключить, что после действия озона на кровь, внезапное и краткое повышение Н2О2 в цитоплазме может быть решающим активатором фактора транскрипции цитокинов, протеинов в острой фазе, эритропоэтинов, адгезионных молекул клеток. Одним из путей противоопухолевого эффекта химиотерапевтических веществ является стимуляция иммунологических реакций, направленных на опухолевые клетки и коррекцией их апоптоза. Таким образом, мы предполагаем, что усиление иммунологических реакций и с помощью озона и с помощью химиотерапевтического средства является одним из механизмов, приводящих к значительно более высокому проценту торможения роста опухоли, чем при моно-воздействиях. При действии цитотоксических средств на опухоль повреждаются и клетки нормальных тканей организма. На основании разработанного исследователями Канзасского университета (г. Лоренс) под руководством Jeffrey P. Krise (2007) подхода к повышению избирательности существующих химиотерапевтических веществ, можно предположить, что повышение противоопухолевого эффекта может быть обусловлено способностью озона защелачивать среду.
![Влияние экстрактов ольхи клейкой на развитие перевиваемых опухолей в условиях цитостатической терапии [Электронный ресурс]](/i/i/4449/188653.png "Влияние экстрактов ольхи клейкой на развитие перевиваемых опухолей в условиях цитостатической терапии [Электронный ресурс] Шилова Наталья Владимировна")
