Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 9
1. Фармакологические эффекты производных гамма-аминомасляной кислоты 9
2. Иммуномодулирующие эффекты производных гамма-аминомасляной кислоты 19
2 Собственные исследования 22
3. Материалы и методы исследования 22
4. Иммунотропные эффекты фенибута, пантогама и пикамилона 27
5. Регенерационная активность производных гамма-аминомасляной кислоты. Роль цитокинов селезенки в реализации данных эффектов 43
6. Гепатопротекторное и антиоксидантное действие производных гамма-аминомасляной кислоты. Роль цитокинов селезенки в реализации иммуномодулирующего и гепатопротекторного действия фенибута 57
Заключение 80
Выводы 88
- Иммуномодулирующие эффекты производных гамма-аминомасляной кислоты
- Иммунотропные эффекты фенибута, пантогама и пикамилона
- Регенерационная активность производных гамма-аминомасляной кислоты. Роль цитокинов селезенки в реализации данных эффектов
- Гепатопротекторное и антиоксидантное действие производных гамма-аминомасляной кислоты. Роль цитокинов селезенки в реализации иммуномодулирующего и гепатопротекторного действия фенибута
Введение к работе
Актуальность темы. Ноотропные препараты - это вещества, активизирующие высшую интегральную деятельность мозга, восстанавливающие нарушенные мнестические и мыслительные функции, снижающие неврологические дефициты и повышающие резистентность организма к экстремальным воздействиям (45, 151, 152, 221). Группа ноотропов разнообразна как по химической структуре, так и по механизму действия, но все эти вещества объединяет способность улучшать процессы обучения и памяти, повышать устойчивость мозга к внешним неблагоприятным воздействиям, особенно при исходной недостаточности этих функций (45; 152). По фармакологическим свойствам ноотропы отличаются от остальных психотропных средств. Они не оказывают выраженного психостимулирующего или седативного эффекта, не вызывают специфических изменений в биоэлектрической активности мозга. Характерными проявлениями их действия являются: стимуляция. передачи возбуждения в центральных нейронах; облегчение передачи информации между полушариями головного мозга; улучшение энергетических процессов и кровоснабжения мозга; повышение устойчивости головного мозга к гипоксии.
Антигипоксическое действие является характерной чертой всех ноотропов, что осуществляется за счет уменьшения потребности тканей в кислороде и повышения устойчивости к развившейся гипоксии (99, 81). К настоящему времени накопилось большое число публикаций, свидетельствующих о сложном мультикомпонентном действии ноотропов. Одним из основных механизмов действия ноотропов является изменение метаболических и биоэнергетических процессов в нервной клетке: усиление синтеза и оборота АТФ в мозговой ткани, активация синтеза протеинов и РНК, улучшение утилизации глюкозы, активизация аденилаткиназы и фосфолипаз. Эти структурные изменения приводят к стабилизации биомембран. Как известно, с акти-
вацией свободнорадикальных процессов, перекисного окисления липидов, связан целый ряд патологических состояний, в том числе гипоксия (144, 132) и старение, на которые и ориентировано действие ноотропов (94). В связи с этим, можно предположить наличие у препаратов группы ноотропов антиоксидантных и репарационных эффектов.
В литературе есть сведения, что отдельные препараты из различных групп ноотропов обладают выраженными иммуностимулирующими или им-муносупрессорными эффектами, которые следует учитывать и использовать при выборе средств лечения, особенно когда иммунотропное действие желательно (6, 61). Известным иммуномодулирующим действием обладают некоторые представители ноотропов из группы производных гамма-аминомасляной кислоты (фенибут, натрия оксибутират) (63). Однако обобщенных, целенаправленных данных по влиянию на иммунную реактивность остальных представителей данной группы ноотропов в доступной литературы нет, но, учитывая известные механизмы фармакологических эффектов производных гамма-аминомасляной кислоты (внутриклеточная стимуляция энергетического и пластического обмена), можно предположить, что данная группа ноотропов может обладать выраженными иммуномодулирующими эффектами, особенно в условиях патологии.
Цель работы: исследование иммуномодулирующих, антиоксидантных и репаративных свойств некоторых производных гамма-аминомасляной кислоты.
Задачи исследования.
Изучить антиоксидантные и гепатотропные эффекты производных гамма-аминомасляной кислоты (фенибута, пантогама и пикамилона) у здоровых экспериментальных животных и в условиях острого токсического поражения печени.
Установить возможное влияние фенибута, пантогама и пикамилона на процессы физиологической и репаративной регенерации гепатоцитов.
Выявить закономерности влияния производных гамма-аминомасляной кислоты (фенибута, пантогама и пикамилона) на развитие гуморального иммунного ответа.
Выяснить влияние производных гамма-аминомасляной кислоты на формирование иммунной реактивности в условиях экспериментального иммунодефицита и повышенной иммунной реактивности.
Выявить роль спленоцитарных гуморальных факторов в реализации иммуномодулирующих, антиоксидантных и репарационных эффектов фенибута, пантогама и пикамилона.
Основные положения, выносимые на защиту.
Фенибут (75; 750 мг/кг), пантогам (4,5; 45 мг/кг) и пикамилон (10; 100; 1000 мг/кг) стимулируют развитие гуморального иммунного ответа, гиперчувствительности замедленного типа, повышают фагоцитарную и функциональную активность полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови.
Фенибут (750 мг/кг), пантогам (45 мг/кг) и пикамилон (100 мг/кг) оказывают стимулирующее влияние на показатели репаративной регенерации гепатоцитов в условиях острого токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода или парацетамола.
Введение фенибута (750 мг/кг), пантогама (45 мг/кг) или пикамилона (100 мг/кг) существенно снижает выраженность биохимических синдромов поражения печени и интенсивность процессов перекисного окисления липидов в условиях острой токсической гепатопатии.
У клеток селезенки, прилипающих к стеклу, фенибут индуцирует выделение гуморальных факторов белковой природы, стимулирующих процессы физиологической и репаративной регенерации, а также корригирующих направленность иммунотропного и гепатотропного действия токсикантов.
Научная новизна. Установлены выраженные эффекты фенибута,
пантогама и пикамилона на формирование гуморального и клеточного звена иммунного ответа, процессы перекисного окисления липидов и репаратив-ную регенерацию гепатоцитов. Выявлена роль спленоцитов в реализации ре-паративных эффектов фенибута, пантогама и пикамилона. Обнаружены им-муномодулирующие гуморальные факторы, продуцируемые фракцией спленоцитов, обогащенных макрофагами, крыс, получавших фенибут; охарактеризована их функциональная активность и молекулярная масса. Получены новые данные о закономерностях участия гуморальных факторов селезенки в формировании иммунного ответа в условиях фармакологической коррекции производными гамма-аминомасляной кислоты при токсическом поражении печени. Установленные факты фармакологической коррекции взаимодействия гепатоцитов и иммунокомпетентных клеток углубляют существующие представления о механизмах сохранения гомеостаза в условиях патологии печени.
Практическая значимость. Экспериментально обоснована возможность стимуляции иммунной реактивности, процессов физиологической и репаративной регенерации гепатоцитов с помощью производных гамма-аминомасляной кислоты: фенибута, пантогама и пикамилона. Экспериментально доказана возможность применения данных препаратов в качестве средств, влияющих на восстановительные процессы в печени в условиях острого токсического поражения. Расшифрованы некоторые механизмы гепато-протекторного, антиоксидантного и регенерационного эффектов фенибута.
Опытным путем обоснована возможность взаимосвязанной нормализации иммунного, антиоксидантного статусов и функционального состояния гепатоцитов при токсических формах поражения печени путем применения препаратов-производных гамма-аминомасляной кислоты: фенибута, пантогама и пикамилона. Доказана перспективность дальнейшей работы по изучению продуктов катаболизма фенибута, пантогама и пикамилона на иммунный и структурный гомеостаз.
Апробация результатов работы. Основные положения диссертации обсуждены на научных конференциях Курского государственного медицинского университета (2002, 2004), Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2001, 2002), V Конгрессе аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) (Москва, 2002), IX Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002), совместном заседании кафедр фармакологии, биологической химии, микробиологии, пропедевтики внутренних болезней Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» (2003).
Публикации. Результаты проведенных исследований полностью отражены в 6 научных работах в центральной и местной печати, в которых содержится полный объем информации, касающейся темы диссертации.
Структура и объем работы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 17 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 3-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 212 источников на русском и 65 - на иностранном языках.
Иммуномодулирующие эффекты производных гамма-аминомасляной кислоты
В последние годы получены данные о влиянии ноотропов на систему иммунитета, что объясняется наличием тесной онтогенетической и нейрот-расмиттерной общности между нервной и иммунной системами (164, 168, 136, 155, 197). Учитывая тот факт, что многие нейротропные препараты обладают выраженными иммуностимулирующими или иммуносупрессорными эффектами (6, 7, 65, 64, 92, 63, 93, 61), которые следует учитывать и использовать при выборе средств лечения, особенно когда иммунотропное действие желательно, естественно, интересен был вопрос о таковых эффектах производных гамма-аминомасляной кислоты. Способность организма к формированию специфического иммунного ответа в условиях чрезвычайных антигенных и адъювантных нагрузок во многом зависит от степени его устойчивости к стрессу. Изучали возможность повышения стрессустойчивости у животных-продуцентов иммунных сывороток с целью оптимизации специфического антигенообразования посредством применения ноотропов. Определив в индивидуальном порядке уровень специфических сывороточных антител установили статистически достоверное преимущество их у особей опытной группы относительно контрольной. Таким образом, предлагается использование ноотропных средств для оптимизации развития иммунного ответа. Введение 20-30 мг/кг пирацетама детям с инфекционными заболеваниями показало, что препарат восстанавливает когнитивные процессы и повышает сопротивляемость организма, судя по показателям Т-системы лимфоцитов (27). Для коррекции нарушений стрессорной природы перспективно использование ноотропных средств, которые при повышении порога психофизиологической устойчивости организма переводят пассивную форму адапта- ции в активную (27). В эксперименте доказано, что ноотропы уменьшают тяжесть стрес-сорных изменений общесоматических показателей, проявляет антиоксидант-ные свойства и протекторный эффект в отношении остеогенеза в условиях хронического стресса. Из группы веществ с ноотропным действием известно, что производное пирролидона - пирацетам в дозе 20 мг/кг парантерально при терапевтическом введении собакам с экспериментальным инфарктом миокарда оказывает наряду с антиаритимическим, антигипоксическим и антиоксидантным действием иммуностимулирующий эффект.
Так, на третьи сутки после воспроизведения инфаркта у собак, повышались титры антикардиальных антител, уменьшалось количество бластов в культуре стимулированных фитоге-магглютинином лимфоцитов. Под влиянием пирацетама титры антикардиальных антител были достоверно ниже и быстрее восстанавливалась функциональная активность Т-лимфоцитов, причем более эффективным препарат был при курсовом лечении инфаркта нежели при профилактическом применении (113). Из группы веществ с компонентом ноотропного действия выявлено, что один из представителей, а именно производное антифена - этимизол, являющийся стимулятором функции нервной системы и повышающим уровень энергетических процессов в ней, кроме этого повышает титры антиэритроци-тарных (ЭБ) и противогриппозных антител у мышей, причем стимулирует как первичный иммунный ответ, так и иммунологическую память (153). Предполагается как непосредственное влияние препарата на иммунокомпе-тентные клетки, так и опосредованное через нервную систему, контролирующую в том числе интенсивность иммуногенеза. Иммуностимулирующим эффектом из препаратов этой группы обладают также оротат калия, женьшень, китайский лимонник (120, 7, 6, 65, 161, 66, 78, 77). Известным иммуномодулирующим действием обладают некоторые представители ноотропов из других групп: производные у-аминомасляной кислоты (фенибут, натрия оксибутират) (93, 63, 92), нейропептиды и их аналоги (АКТГ и его фрагменты, эндогенные опиоиды) (2, 4, 187, 181, 182, 213, 254) и антиоксиданти (мексидол) (102,126,127,128). Из доступной литературы не выявлены описанные эффекты у производных диметиламиноэтанола, однако, учитывая антиоксидантный эффект соединений этой группы (138), можно было предположить, что производные диметиламиноэтанола могут обладать выраженными иммуномодулирующи-ми эффектами, особенно в условиях патологии. Объект исследования. Исследования проведены на 1430 крысах Вистар массой 180-220 г., полученных из питомника «Столбовая» (г. Москва). В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 8-10 животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно. Разброс в группах по исходной массе не превышал ±10%. Так как действие фармакологических препаратов может изменяться под влиянием ряда физиологических факторов, все исследования проводили в одно и то же время суток. Для исследования от животных получали сыворотку, клетки селезенки, ткань печени, подколенные лимфатические узлы.
Исследуемые соединения и экспериментальные модели. В экспериментальных исследованиях были использованы препараты-производные гамма-аминомасляной кислоты: 1. Фенибут (АО «Олайнский химико-фармацевтический завод» -«Олайнфарм», Латвия), содержащий в одной таблетке 250 мг у-амино-р-фенилмасляной кислоты гидрохлорида. Вводили в виде суспензии внутриже-лудочно пятнадцатикратно с интервалом 24 часа в дозах 75, 750 и 2500 мг/кг массы тела на одно введение. 2. Пантогам (ОАО «Щелковский витаминный завод»), содержащий в одной таблетке 250 мг кальциевой соли 0-(+)-а,у-диокси-3,3-диметилбутирил-у-аминомасляной кислоты. Вводили в виде суспензии внут-рижелудочно пятнадцатикратно с интервалом 24 часа в дозах 4,5, 45 и мг/кг массы тела на одно введение. 3. Пикамилон (ОАО «Уфавита»), содержащий в одной таблетке 50 мг натриевой соли N-никотиноил-у-аминомасляной кислоты. Вводили в виде суспензии внутрижелудочно пятнадцатикратно с интервалом 24 часа в дозах 10,100 и 1000 мг/кг массы тела на одно введение. Токсическую гепатопатию у лабораторных животных моделировали путем введения парацетамола или четыреххлористого углерода. Парацетамол вводили десятикратно, с интервалом 24 ч, по 5 мг/кг (33, 140, 185, 264, 271). Для получения острого поражения печени ЧХУ вводили в мышцу бедра (через день меняя лапки) по 3 мл на кг массы тела в течение 5 дней подряд (202,101,159). Выбранные дозы и схемы введения препаратов обусловливали развитие цитолитического, холестатического, мезенхимально-воспалительного и гепатодепрессивного синдромов поражения печени в той или иной степени (42). Приготовление антигена. Схемы иммунизации. Оценка интенсивности развития иммунного ответа. В качестве антигена в опытах использовались эритроциты барана. Кровь консервировали в растворе Ольсвера, хранили ее при температуре +4С и использовали для приготовления взвеси эритроцитов. Перед приготовлением 5% взвеси их несколько раз отмывали изотоническим раствором хлористого натрия путем центрифугирования при 400 g в течение 10 минут. Развитие ГИО индуцировали эритроцитами барана, которые вводили внутрибрюшинно, однократно из расчета 2x109 клеток на 1 кг массы тела. Выраженность ГИО на ЭБ оценивали на 5-е сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа антителообразующих клеток (134, 135), клеток, формирующих розетки с ЭБ - РОК (62).
Иммунотропные эффекты фенибута, пантогама и пикамилона
В патогенезе острых и хронических инфекционных и неинфекционных заболеваний, и в первую очередь, гнойно-септических, аллергических, обширных термических поражений большую роль играют механизмы дестабилизации иммунного статуса с развитием иммунодефицита (148, 98, 75, 79, 121,122,16,86,9,96). Иммунная недостаточность приводит к снижению эффективности проводимой традиционной терапии, способствует активизации условно-патогенной микрофлоры, смене возбудителя и суперинфекции. Это, в свою очередь, приводит к затяжному течению болезни, осложнениям, а в ряде случаев - и к летальному исходу (95, 90, 52, 130, 131, 238, 240, 236). Поэтому в комплексное лечение при таких формах патологии необходимо введение им-мунокорригирующих средств (29, 30, 267, 224, 218, 261, 272, 237, 273). Многие лекарственные средства, применяющиеся или испытывающиеся в настоящее время в этом аспекте как в эксперименте, так и в клинике, обладают широким спектром побочных свойств: токсичность, пирогенность, аллерген-ность, недостаточная эффективность в условиях патологии (7, 6, 160, 89). Все вышеизложенное делает проблему поиска новых иммуномодуляторов, обладающих высокой иммунотропной активностью и минимумом побочных эффектов особенно актуальной. Из данных литературы (глава 1) известно, что производные гамма-аминомасляной кислоты активно участвуют в процессах обеспечения энергией нейроцитов, активируют процессы углеводного, белкового и жирового внутриклеточного обменов. Исходя из этого, не исключены прямые и опосредованные иммунотропные эффекты данной группы препаратов. Первоначально нами было изучено влияние препаратов-производных гамма-аминомасляной кислоты - фенибута, пантогама и пикамилона - на развитие различных форм иммунного ответа у здоровых животных при ис- пользовании различных доз изучаемых препаратов. Установлено, что внутрижелудочное пятнадцатикратное введение фенибута (10 дней до иммунизации и 5 дней - после) в дозе 75 мг/кг массы тела приводит к выраженной стимуляции гуморального иммунного ответа на ЭБ (количество иммунных АОК и РОК в селезенке данной группы животных было, соответственно, в 6,5 и 2,4 раза выше, чем в контрольной группе).
Применение препарата в дозе 750 мг/кг массы тела вызывало аналогичный эффект (таблица 1). Введение фенибута в дозе 2500 мг/кг массы тела в наших исследованиях вызывало гибель 60% животных на 4-6 сутки введения препарата. Этот факт можно объяснить токсическим влиянием фенибута в указанной дозе. Другое производное гамма-аминомасляной кислоты - пантогам -также оказывало стимулирующее воздействие на развитие ГИО, индуцированного ЭБ. Нами отмечено, что пятнадцатикратное (10 дней до иммунизации и 5 дней - после) внутрижелудочное введение здоровым животным пан-тогама в дозе 4,5 мг/кг массы тела вызывало у них усиление формирования ГИО к ЭБ по сравнению с контрольной группой животных (количество им- мунных АОК и РОК в данной группе животных превышало аналогичные показатели группы контроля, соответственно, в 3,8 и 1,7 раза). Доза препарата, равная 45 мг/кг массы тела, введенная в том же режиме и кратности, что и первая, оказывала еще более выраженное влияние на формирование гуморального иммунного ответа, так как количество иммунных АОК и РОК в селезенке животных, получавших пантогам в дозе 45 мг/кг массы тела, соответственно, в 5,4 и 2,2 раза превышало показатели контрольной группы крыс (таблица 2). Использование пантогама в дозе 450 мг/кг массы тела в наших экспериментах вызывало гибель 50% экспериментальных животных на 4-5 сутки введения препарата, что можно объяснить токсическим действием пантогама в указанной дозе. Эти результаты дают основание говорить о том, что стимулирующее влияние пантогама на гуморальный иммунный ответ наиболее выражено в дозе 45 мг/кг массы тела. Третий из исследованных нами препаратов - пикамилон - при внут-рижелудочном пятнадцатикратном введении (10 дней - до иммунизации эритроцитами барана и 5дней - после) в дозе 10 мг/кг массы тела также стимулировал формирование ГИО к ЭБ, о чем свидетельствует повышение количества иммунных АОК и РОК в селезенке этой группы животных, по сравнению с контролем, соответственно, в 2,5 и 1,7 раза. Внутрижелудочное вве- дение пикамилона в дозах 100 и 1000 мг/кг также индуцировало формирование гуморального звена иммунитета. При этом, достоверных различий между вышеуказанными дозами препарата в наших экспериментах выявлено не было (таблица 3). На основании вышеизложенного можно сделать вывод о наличии до-зозависимых эффектов фенибута, пантогама и пикамилона в отношении формирования гуморального иммунного ответа на ЭБ. Гуморальный иммунный ответ тесно связан с развитием реакции гиперчувствительности замедленного типа, однако, эти процессы отличаются по свойствам основных видов обусловливающих их клеток и цитокинов, которые эти клетки выделяют (139, 141, 91, 174). Гиперчувствительность замедленного типа - это зависимая от Т-клеток иммунологическая реакция, проявляющаяся в виде воспаления в месте попадания в организм антигена. Клетки, ответственные за развитие реакции ГЗТ, могут активироваться в ответ на самые разнообразные антигены. Эта форма гиперчувствительности наблюдается при аллергических реакциях на бактерии, вирусы и грибы, при контактном дерматите, возникающем в результате сенсибилизации определенными химическими группами, связанными с белками кожи, при отторжении трансплантированных тканей. Реакции ГЗТ являются защитной формой реагирования организма.
Из литературы известно, что многие фармакологические средства влияют на реакцию ГЗТ, угнетая ее. Однако, способы активации Т-клеточной ГЗТ еще недостаточно изучены (91). Поскольку ГЗТ играет важную роль в развитии различных заболеваний, интересно было выяснить, как влияют выбранные нами препараты-производные гамма-аминомасляной кислоты на развитие реакции ГЗТ, индуцированной ЭБ. Установлено, что фенибут, введенный в дозе 75 мг/кг, оказывал выраженное воздействие на развитие ГЗТ. Об этом свидетельствует повышение РМ и РК регионарного и контралатерального лимфатических узлов, в сравнении с контрольной группой крыс, соответственно, в 2,1 и 4,4 раза. Статистически достоверных различий во влиянии на развитие ГЗТ доз фенибута 75 мг/кг и 750 мг/кг нами не выявлено (рисунок 1). Пантогам, примененный в дозе 4,5 мг/кг массы тела оказывал стимулирующее влияние на развитие реакции ГЗТ, о чем свидетельствует статистически достоверное повышение РМ и РК в этой группе животных в сравнении с контролем. Доза препарата 45 мг/кг оказывала более выраженное воздействие (рисунок 2). Пикамилон в дозах 10 мг/кг и 100 мг/кг массы тела индуцировал развитие реакции ГЗТ, о чем говорит статистически достоверное увеличение РМ и РК в группах животных, получавших указанные дозы препарата, по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы крыс. Статистических различий между двумя этими дозами пикамилона выявлено не было (рисунок 3). Таким образом, можно сделать вывод о том, что пантогам обладает выраженным дозозависимым, а фенибут и пикамилон - не дозозависимым стимулирующим эффектом в отношении развития реакции гиперчувствительности замедленного типа. Неотъемлемым компонентом процесса формирования иммунного ответа и осуществления эффекторных функций иммунной системы являются факторы неспецифической резистентности организма (91). Факторы неспецифической защиты организма являются филогенетически наиболее древними, передающимися по наследству анатомическими и физиологическими признаками. К ним относятся кожные и слизистые покровы, лимфатические узлы, лизоцим, фагоцитирующие клетки, система комплемента, интерфероны и др. (255, 245). От целостности и эффективности факторов неспецифической защиты зависит постоянство внутренней среды организма и невосприимчивость его к инфекциям. Очевидная роль нейтрофильных гранулоцитов в поддержании иммунного гомеостаза в норме и при различных заболеваниях является основанием для поиска средств, корригирующих дефекты их функционирования. Ней-трофил, как наиболее реактивная клетка крови, высокочувствителен к изменениям внутренней среды, которые сопутствуют нарушениям гомеостаза во многих системах организма, и принимает участие в патогенезе заболеваний, характеризующихся развитием вторичного иммунодефицита (139).
Регенерационная активность производных гамма-аминомасляной кислоты. Роль цитокинов селезенки в реализации данных эффектов
Учитывая биохимические основы фармакологических эффектов препаратов группы ноотропов, в частности, производных гамма-аминомасляной кислоты (глава 1), нами было изучено их влияние на процессы регенерации. В качестве модельных клеток были выбраны гепатоциты, обладающие высокими регенераторными свойствами (123, 173, 51, 43,117, 177, 234, 266, 243). Влияние фенибута,. пантогама и пикамилона на восстановительные процессы в гепатоцитах здоровых крыс и животных с токсическим поражением печени изучали с помощью некоторых морфологических показателей, характеризующих пролиферативную активность гепатоцитов: количество митозов - МИ (%о); диаметр ядер гепатоцитов - ДЯГ (мкм) и индекс дву-ядерных клеток - ИДК (%о). Изначально нами было изучено влияние пантогама, фенибута и пикамилона на процессы физиологической регенерации гепатоцитов у здоровых животных. Установлено, что все исследованные препараты в выявленных (глава 4) эффективных иммунотропных дозах не оказывают влияния на показатели физиологической регенерации клеток печени (таблица 7). В дальнейших исследованиях нами было изучено влияние выбранных нами препаратов на процессы репаративной регенерации гепатоцитов в условиях токсического поражения печени, вызванного парацетамолом или ЧХУ. Выявлено, что введение ЧХУ существенно и статистически достоверно повышает показатели репаративной регенерации клеток печени (МИ, ИДГ, ДЯГ) по сравнению с контрольной группой животных (таблица 8). Этот факт объясняется развитием репаративных процессов в печени под воздействием гепатотоксического агента. Применение фенибута еще в большей степени повышало эти показатели по сравнению с крысами, получавшими только ЧХУ (таблица 8). Введение парацетамола в наших исследованиях статистически достоверно повышало только один показатель репарации - МИ. Фенибут же повышал все исследованные показатели регенерации, а именно МИ, ДЯГ и ИДГ по сравнению с животным, получавшими только парацетамол (таблица 8). Все эти данные дают возможность говорить о наличии у фенибута репаративных свойств. Пантогам также обладал репаративными свойствами в условиях экспериментальной токсической гепатопатии, вызванной введением ЧХУ и парацетамола.
Так, в условиях отравления ЧХУ, пантогам статистически достоверно повышал все исследованные нами показатели репаративной активности в гепатоцитах (МИ, ИДГ, ДЯГ) (таблица 9). Такой же по направленности эффект отмечался и в случае поражения печени, индуцированного парацетамолом. В этих условиях в группе животных, отравленных парацетамолом и получавших пантогам, наблюдалось повышение МИ, ИДГ и ДЯГ, соответственно, в 3,4, 1,2 и 0,9 раз по сравнению с контрольной группой животных (таблица 9). Подобные по направленности репаративные эффекты были выявлены нами и у пикамилона. В условиях экспериментальной токсической гепатопа-тии, вызванной введением четыреххлористого углерода, пикамилон повышал показатели регенерации клеток печени (МИ, ДЯГ и ИДГ), причем наиболее существенный стимулирующий эффект проявился в отношении митотиче-ского индекса (таблица 10). Аналогичная динамика была выявлена и в условиях введения парацетамола - достоверно повышались все исследованные показатели, а в отношении МИ проявлялся наиболее выраженный стимулирующий эффект (таблица 10). Большой интерес представлял вопрос сравнительного изучения активности фенибута, пантогама и пикамилона в условиях токсического поражения печени, вызванного введением парацетамола. Установлено, что наибольшей репаративной активностью обладал фенибут. Пантогам и пиками-лон уступали по своей репаративной активности фенибуту, при этом пантогам обладал наименее выраженной репаративной активностью (рисунок 5). Таким образом, исследованные нами препараты-производные гамма-аминомасляной кислоты обладают репаративной активностью в условиях токсического поражения печени, вызванного введением парацетамола, причем репаративная активность препаратов возрастала в ряду: «пантогам - пи-камилон - фенибут». В настоящее время твердо установлен факт участия иммунокомпе-тентных клеток в физиологических процессах структурного поддержания го-меостаза (107, 260, 277, 230), которые включают в себя хроническое воспаление, заживление ран, регенерацию тканей, их васкуляризацию, компенсаторную гиперплазию, регуляцию метаболизма и роста различных тканей (13, 103, 12). При этом отмечена особая роль в этих процессах мононуклеарных фагоцитов (88), регуляторних субпопуляций Т-лимфоцитов (14, 108), медиаторов иммунокомпетентных клеток (108). Изменения регенерации могут наступать вследствие воздействия на гепатоциты стимулирующих и супресси-рующих гуморальных факторов плазмы и сыворотки крови, культуральной жидкости моноцитов и лимфоцитов периферической крови (106, 40). Учитывая многочисленность данных об участии гуморальных факторов иммунокомпетентных клеток в регенерации печени с диффузным патологическим процессом (14, 88), интересно было изучить роль спленоцитов крыс, получавших фенибут, пантогам и пикамилон, в реализации репаратив-ных и гепатопротекторных эффектов. Изучено репаративное действие КЖС крыс с острым токсическим поражением печени, вызванным введением парацетамола. Как известно из литературных данных, парацетамол вызывает острое токсическое поражение печени, проявляющееся развитием цитолитического, холестатического и мезенхимально-воспалительного биохимических синдромов поражения печени (69). Введение парацетамола повышает митотический индекс гепатоцитов, то есть оказывает стимулирующее влияние на репарацию специализированных клеток печени, что объясняется реакцией гепатоцитов на воздействие гепатотоксического агента.
Культуральная жидкость спленоцитов (КЖС) аллогенных здоровых доноров не изменяла МИ по сравнению с интактными крысами, а КЖС животных, получавших парацетамол, повышала данный показатель (рисунки 6-8). Этот факт говорит о том, что спленоциты являются одним из звеньев реализации репаративных эффектов в организме в норме и в условиях экспериментальной патологии. В связи с этим, и в свете установленного нами влияния препаратов-производных ГАМК на свойства иммунокомпетентных клеток (глава 4), естественно, возник вопрос о возможности модуляции этого эффекта данными препаратами. Установлено, что введение КЖС животных, отравленных парацетамолом и получавших фенибут, существенно и статистически достоверно повышает МИ у интактных аллогенных реципиентов (рисунок 6). Такой же эффект был обнаружен и при введении КЖС животных, получавших парацетамол и пикамилон (рисунок 7). Введение же КЖС крыс, отравленных парацетамолом и получавших пантогам, подобного эффекта не вызывало. В этой группе животных не наблюдалось статистически значимого увеличения МИ по сравнению с контрольной группой (рисунок 8). Данные факты свидетельствуют о том, что под влиянием препаратов-производных ГАМК спленоциты способны вырабатывать фактор (или факторы) оказывающие стимулирующее влияние на процессы репаративной регенерации. При этом наиболее выраженный эффект достигается при введении фенибута и пикамилона. В случае использования пантогама подобного эффекта не отмечается. Далее интересно было выяснить, какая именно фракция спленоцитов способна продуцировать стимулирующий фактор. Для этого клетки селезенки делились по способности прилипать к стеклу. Установлено, что введение культуральнои жидкости спленоцитов, не прилипающих к стеклу (КЖСН) животных, отравленных парацетамолом и получавших фениубут, не приводило к статистически достоверному увеличению МИ у интактных аллогён-ных реципиентов (рисунок 6). Такой же результат был получен нами и при введении КЖСН крыс, отравленных парацетамолом и получавших пиками-лон (рисунок 7). Отсутствие стимуляции репаративной регенерации гепато-цитов обнаружено и в случае введение КЖСН от животных, которым вводили парацетамол и пантогам (рисунок 8). Введение же интактным аллогенным реципиентам культуральнои жидкости спленоцитов, прилипающих к стеклу (КЖСП) от крыс, отравленных парацетамолом и получавших фенибут, вызывало у них статистически значимую стимуляцию МИ по сравнению как с контрольной группой, так и с животными, получавшими КЖСН (рисунок 6). КЖСП животных, получавших парацетамол и пикамилон, оказывала такое же влияние на МИ интактных аллогенных реципиентов (рисунок 7).
Гепатопротекторное и антиоксидантное действие производных гамма-аминомасляной кислоты. Роль цитокинов селезенки в реализации иммуномодулирующего и гепатопротекторного действия фенибута
Действие на организм многих химических соединений приводит к возникновению поражений печени, характеризующихся рядом общих биохимических признаков (193, 180, 195, 212). К таким признакам относятся усиление свободно-радикальных процессов и перекисного окисления липи-дов (118, 208, 175, 198, 241), снижение активности глюкозо-6-фосфатазы, ферментов НАДН-зависимой монооксигеназной системы (особенно ее основного компонента - цитохрома Р450) (32, 31, 196), повышение проницаемости клеточных мембран (59, 58, 55, 84, 171, 147, 192, 85, 214), жировая инфильтрация печени, некроз гепатоцитов. Указанные сдвиги лежат в основе развития цитолитического (повышение активности АЛТ и ACT в крови), хо-лестатического (повышение активности ЩФ, концентрации билирубина и его фракций) и гепатодепрессивного (снижение концентрации альбумина, про-тромбинового индекса, активности холинэстеразы) синдромов поражения печени (163). Одновременно, при повреждении гепатоцитов, как правило, повышается концентрация первичных продуктов перекисного окисления липидов. Процессы перекисного окисления липидов достаточно четко отражают функциональное состояние клеточных и субклеточных мембранных структур, имеющих существенное значение для жизнеобеспечения целостного организма (146, 97, 100, 162, 137, 235, 236). Развитию того или иного патологического процесса предшествует повреждение именно клеточных мембран, что выражается, чаще всего, в нарушении функционального состояния ли-пидного бислоя, изменений рецепторов, каналов, ионной проницаемости, образовании сшивок между белками и фосфолипидами мембраны, необратимой инактивацией белков и потерей функциональных свойств биомембран (179, 114,109,270,265). В связи с этим важным представляется вопрос о влиянии производных гамма-аминомасляной кислоты в исследованных дозах и способах их введения на функциональную активность гепатоцитов. Установлено, что введение фенибута (750 мг/кг), пантогама (45 мг/кг) и пикамилона (100 мг/кг) здоровым животным не оказывает действия на функциональную активность гепатоцитов, о чем свидетельствует отсутствие изменений биохимических показателей сыворотки крови в опытных группах животных в сравнении с контролем (таблица 11). Таким образом, нами сделан вывод о том, что исследованные препараты не оказывают существенных влияний на клетки печени, не повышают проницаемость как цитоплазматической мембраны, так и мембран органелл, не изменяют функциональных свойств специализированных клеток печени.
В качестве экспериментальных моделей патологии для исследования активности пантогама, фенибута и пикамилона нами были использованы модели токсического поражения печени, вызванного введением парацетамола и четыреххлористого углерода. Введение парацетамола сопровождается возникновением токсического поражения печени, проявляющегося развитием цитолитического (повышение активности АЛТ и ACT в сыворотке крови), холестатического (повышение активности ЩФ, концентрации билирубина, (3-липопротеидов) и ме-зенхимально-воспалительного (повышение тимоловой пробы) биохимических синдромов поражения печени. Повышение концентрации первичных (ДК) и вторичных (МДА) продуктов перекисного окисления липидов, а также снижение активности каталазы свидетельствует об усилении процессов ПОЛ у животных в условиях острой токсической гепатопатии, вызванной введением парацетамола (таблица 12). Фенибут в условиях экспериментальной токсической гепатопатии, вызванной введением парацетамола, оказывал влияние на измененные показатели функционального состояния гепатоцитов. Применение фенибута статистически достоверно снижает (но не до уровня контрольной группы) активность АЛТ, ACT, ЩФ, уменьшает концентрацию билирубина и J3- липопротеидов сыворотки крови, понижает тимоловую пробу (таблица 12). Также отмечается снижение показателей, характеризующих процессы ПОЛ, под влиянием фенибута. В группе отравленных парацетамолом животных, получавших фенибут, отмечается снижение (но не до уровня нормы) концентрации первичных (ДК) и вторичных (МДА) продуктов ПОЛ, а также повышение активности каталазы. При применении пантогама в условиях наших экспериментов также отмечалось снижение выраженности цитолитического (понижение активности АЛТ и ACT), холестатического (снижение содержания билирубина, [3-липопротеидов и активности ЩФ в сыворотке крови) и мезенхимально-воспалительного (снижение тимоловой пробы) биохимических синдромов поражения печени (таблица 13). Закономерно возник вопрос о сравнительном изучении действия фе- нибута, пантогама и пикамилона на функциональное состояние гепатоцитов и выраженность процессов перекисного окисления липидов в условиях пара-цетамолового поражения печени. Установлено, что, в целом, сколько-нибудь значительная разница в эффективности действия препаратов отсутствует (рисунок 10). В дальнейших экспериментах было изучено гепатопротекторное и ан-тиоксидантное действие фенибута, пантогама и пикамилона в условиях токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода, так как ЧХУ обладает иным механизмом повреждающего действия на клетки печени. Механизм действия четыреххлористого углерода заключается в образовании активного радикала СС1з , который способен оказывать прямое повреждающее действие как на цитоплазматическую мембрану, так и на мембраны клеточных органелл, в первую очередь, эндоплазматического ретикулума, митохондрий и лизосом. Из литературы известно, что ЧХУ первично воздействует на цитохром-Р450-зависимую монооксидазу, расположенную в гладкой эндоплазматической сети перивенулярных гепатоцитов. Вторично в патологический процесс включаются мембранные структуры и ферментные системы митохондрий и лизосом (202).
Дестабилизация митохондриальных мембран приводит к нарушению тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования в клетках, а лабилизация лизосомальных мембран - к повышенному выходу в цитоплазму протеолитических и гидролитических ферментов, дезорганизации метаболизма. Введение ЧХУ, также как и введение парацетамола, сопровождается развитием цитолитического (повышение активности АЛТ и ACT в сыворотке крови), холестатического (повышение активности ЩФ, содержания билирубина и (3-липопротеидов) и мезенхимально-воспалительного (повышение тимоловой пробы) биохимических синдромов поражения печени, причем выраженность данных нарушений существенно выше, чем в случае введения индометацина. Фенибут в условиях токсического поражения печени, вызванного введением ЧХУ, также как в случае введения парацетамола, оказывал корригирующее воздействие на измененные токсикантом показатели функционального состояния гепатоцитов. Отмечалось снижение (но не до уровня контрольной группы животных) в сыворотке крови активности АЛТ, ACT, ЩФ, концентрации билирубина, [З-липопротеидов, тимоловой пробы. Помимо этого, наблюдалось заметное снижение интенсивности процессов перекисного окисления липидов, о чем говорит понижение концентрации первичных (ДК) и вторичных (МДА) продуктов ПОЛ в сыворотке крови, а также повышение активности каталазы (таблица 15). Сходные по направленности эффекты отмечались и при применении пантогама и пикамилона (таблицы 16,17). Таким образом, можно сделать вывод о корригирующем влиянии выбранных нами препаратов-производных гамма-аминомасляной кислоты на функциональное состояние гепатоцитов в условиях экспериментальной токсической гепатопатии, вызванной введением парацетамола и четыреххлори-стого углерода. С учетом: 1) биохимического механизма влияния ноотропных препаратов-производных гамма-аминомасляной кислоты на внутриклеточный метаболизм (усиление биоэнергетических процессов, пластического, углеводного обменов и т.д.); 2) полученных нами данных о наличии иммуномодули-рующих, антиоксидантных, гепатопротекторных и репаративных свойств; 3) литературных данных об участии, тесном взаимодействии иммунокомпе-тентных и паренхиматозных клеток, в первую очередь гепатоцитов (13), решено было вьыснить роль лимфоцитов и макрофагов селезенки в реализации установленных фармакологических свойств одного из изученных, и проявляющих наибольшую активность представителей гамма-аминомасляной кислоты - фенибута.
