Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ I. Обзор литературы 14
Иммунометаболические эффекты взаимодействия токсических ксенобиотиков и лекарственных соединений 14
1. Метаболические эффекты, вызываемые токсическими соединениями 14
2. Роль эритроцитов в реализации иммунометаболических эффектов токсических соединений 27
3. Средства метаболической иммуномодуляции 45
РАЗДЕЛ II. Собственные исследования 62
4. Материалы и методы исследования 62
5. Иммунометаболические эффекты, вызываемые тиамином и рибоксином, при токсической фенилгидразиновой анемии 76
6. Иммунометаболическое действие элькара и биотина при токсической фенилгидразиновой анемии 89
7. Протективное действие эссенциале и регуляторов энергетического обмена при токсической фенилгидразиновой анемии 100
8. Эссенциале и рибоксин как индукторы активности стромы эритроцитов в норме и при токсической анемии 111
9. Инверсионная иммуномодуляция эффектов, вызываемых эссенциале и рибоксином, при токсической анемии 121
10. Протекторное действие регуляторов энергетического обмена и эссенциале при нитритной интоксикации 128
11. Протективное действие эссенциале и активаторов биологического окисления при нитритной интоксикации 135
12. Иммунометаболические эффекты регуляторов энергетического обмена при токсическом поражениипечени и почек 143
13. Иммунометаболические эффекты взаимодействия эссенциале с регуляторами энергетического обмена при токсическом поражении печени и почек 151
14. Корригирующее влияние эссенциале и рибоксина на иммунорегули-рующую функцию лимфоцитов крови при токсическом поражении печени 158
15. Иммунометаболические эффекты эссенциале и милдроната при токсическом поражении почек 164
16. Оценка эффективности влияния регуляторов энергетического обмена на функциональную активность клеток крови 172
Заключение 177
Выводы 200
Практические рекомендации 203
Список литературы 204
- Роль эритроцитов в реализации иммунометаболических эффектов токсических соединений
- Иммунометаболическое действие элькара и биотина при токсической фенилгидразиновой анемии
- Инверсионная иммуномодуляция эффектов, вызываемых эссенциале и рибоксином, при токсической анемии
- Иммунометаболические эффекты взаимодействия эссенциале с регуляторами энергетического обмена при токсическом поражении печени и почек
Введение к работе
Актуальность темы. Различные формы соматической патологии характеризуются накоплением в сосудистом русле токсических продуктов, избирательно повреждающих клетки органов и тканей. В организм постоянно извне поступают токсические продукты, обладающие избирательной токсичностью (АлбертА., 1989).
Токсические поражения органов и тканей характеризуются однотипными структурно-функциональными нарушениями, важнейшими следствиями которых являются усиление генерации активных метаболитов кислорода, снижение энергетического и окислительного потенциала клеток, повышение интенсивности перекисного окисления липидов и белков в различных тканях. Эти метаболические нарушения служат причиной возникновения иммунологической недостаточности (Конопля Н.А.,1995, Конопля Е.Н., 1997, Прокопенко Л.Г. и др., 2000, 2003).
Важную роль в регуляции иммунологических процессов при различных формах патологии и стресса играют гепатоциты, эритроциты и макрофаги. Ге-патоциты выделяют в сосудистое русло соединения, индуцирующие появление у легких эритроцитов свойства усиливать выделение макрофагами селезенки иммуносупрессирующих цитокинов (Конопля А.И., 1989, Прокопенко Л.Г. и др., 1995). Многие лекарственные соединения обладают свойством ослаблять иммуносупрессирующие свойства легких эритроцитов и индуцировать появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов. Появление имму-носупрессорных свойств у легких эритроцитов обусловлено нарушением их энергетического и антиоксидантного потенциалов, условием индукции иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов является сохранение их энергетического и антиоксидантного потенциалов (Лазарев А.И., 1998; Конопля Н.А., 2002; Лазарева Г.А., Конопля А.А., 2003).
Вызываемое токсическими соединениями глубокое разбалансирование метаболических процессов в печени приводит к нарушению функции мышечной ткани. Функциональная активность гепатоцитов, иммуноцитов и миоцитов
8 взаимосвязана. Эта взаимосвязь опосредована метаболитами, выделяющимися в сосудистое русло клетками печени, и цитокинами, синтезирующимися имму-ноцитами. В реализации взаимосвязи функций гепатоцитов и миоцитов участвуют эритроциты (Ласкова И.Л., Сипливая Л.Е.,1993; Ласкова И.Л., 1995). Последние можно рассматривать как одно из звеньев сопряжения метаболических процессов в печени, защитной функции иммунной системы и сократительной активности мышечной ткани (Котельникова Л.В., 2000).
Протсктивный эффект при токсических поражениях достигается применением лекарственных препаратов, обладающих антиоксидантной активностью. Не ясно, может ли быть достигнут такой эффект введением препаратов, объединенных в группу регуляторов энергетического обмена, к которым относятся витамины (тиамин рибофлавин, никотинамид, биотин), витаминоподоб-ные соединения (L-карнитин, инозин, а-липоевая кислота, KoQ), а также препараты глутаминовой, янтарной и яблочной кислот и синтетические соединения - милдронат и гипоксен (Прокопенко Л.Г. и др., 2000; Оковитый СВ., Смирнов А.В.,2001).
В соответствии с преимущественным участием в системе энергетического обеспечения клеток можно выделить препараты, активирующие гликолиз (рибоксин, милдронат) и окисление жирных кислот (элькар, милдронат), стимулирующие пусковой этап лимоннокислого цикла (тиамин, а-липоат, биотин) и его промежуточные реакции (глутамат, мексидол, муфасол), повышающие эффективность окислительной цепи митохондрий (рибофлавин, никотинамид, KoQ, гипоксен) (Смирнов А.В. и др., 1999; Хазанов В.А., 2003; Сухоруков B.C. и др., 2003; Николаева Е.А., 2003).
Принципиально важной задачей современной иммунофармакологии является выявление эффектов взаимодействия лекарственных препаратов на уровне клеточных мембран. Монотерапия редко оказывается эффективной при лечении различных заболеваний. Полипрагмазия нежелательна вследствие невозможности прогнозирования последствий взаимодействия многих соединений в условиях нарушения гомеостаза.
Лекарственные соединения, вводимые в организм в виде сложных композиций, взаимодействуют между собой, с химическими компонентами плазмы и межклеточных жидкостей, с фосфолипидной и гликопептидными структурами клеточных мембран. Предугадать последствия такого взаимодействия крайне трудно. Установлено, например, что сочетанное применение двух препаратов витаминов, как правило, дает более выраженный ожидаемый иммунометаболи-ческий эффект, чем каждый из них в отдельности, а добавление третьего витамина часто не усиливает действие двух других, а иногда ослабляет его (Лазарева Г.А., 2003; Конопля А.А., 2004). Принимая во внимание изложенное, основное внимание в работе уделено изучению эффективности действия парных сочетаний регуляторов энергетического обмена при учете тех изменений химического состава крови и клеток, которые были вызваны поступлением в организм токсических соединений.
Подбор препаратов и их сочетаний проводился с учетом преимущественного влияния на углеводный и липидный пути энергообеспечения и на различные звенья биоэнергетической системы, нарушенные при токсическом поражении различных тканей.
Целью работы было изучение выраженности иммунометаболических эффектов регуляторов энергетического обмена при токсических поражениях различных тканей, для оценки перспективности их применения в клинической практике.
Задачи:
Изучение иммунометаболических эффектов, вызываемых тиамином и рибоксином (инозином), при токсической анемии.
Изучение иммунометаболических эффектов, вызываемых элькаром (L-карнитином) и биотином, при токсической анемии.
Оценка влияния милдроната на иммунометаболические эффекты, вызываемые регуляторами энергетического обмена, при токсической анемии.
4. Оценка влияния эссенциале (полиненасыщенных фосфолипидов) на иммунометаболические эффекты, вызываемые регуляторами энергетического обмена, при токсической анемии.
Выявление иммунометаболических эффектов, вызываемых регуляторами энергетического обмена, при нитритной интоксикации.
Оценка влияния эссенциале на иммунометаболические эффекты, вызываемые регуляторами энергетического обмена, при нитритной интоксикации.
Выявление иммунометаболических эффектов, вызываемых регуляторами энергетического обмена, при токсическом поражении печени и почек.
Изучение влияния регуляторов энергетического обмена на метаболические процессы в печени и физическую работоспособность.
Научная новизна. Установлено, что иммуномодулирующее действие тиамина и рибоксина в большей степени выражено при одномоментном поступлении больших доз гемотропного яда, а аналогичный эффект элькара и биотина имеет место преимущественно после длительного поступления малых доз токсиканта. Тиамин и рибоксин повышает резистентность легких эритроцитов к соединениям сыворотки, индуцирующим у них появление иммуносупрессор-ных свойств. Элькар и биотин предотвращают накопление в крови соединений, индуцирующих появление у легких эритроцитов иммуносупрессорной активности.
Доказано, что милдронат повышает фагоцитарно-метаболическую активность лейкоцитов, усиливает развитие гуморальной форм иммунного ответа, повышает эффективность иммуномодулирующего действия тиамина и рибоксина при токсических поражениях. Полиненасыщенные фосфолипиды эссенциале селективно усиливают влияние тиамина, рибоксина и элькара, антиокислительный и энергетический потенциал эритроцитов, их иммуномодулирую-щую активность, метаболические процессы в печени и физическую работоспособность. Установлено, что эффект сочетанного применения эссенциале и рибоксина реализуется при участии модифицированных эритроцитов. Иммуномо-дулирующие свойства приобретает строма эритроцитов крыс, получавших рибоксин, после интра- или экстракорпорального взаимодействия с фосфолипи-дами эссенциале.
Показано, что эритроциты отравленных крыс, получавших рибоксин и эссенциале, индуцируют образование у кроликов антител, которые при экстра- корпоральной обработке эритроцитов или стромы крыс, получивших эти препараты, значительно увеличивают их иммуногенность для здоровых и отравленных гемотропным ядом крыс. Эссенциале в сочетании с мексидолом, куде-саном или гипоксеном при токсических поражениях селективно повышают антиокислительный и энергетический потенциал эритроцитов, снижает их имму-носупрессорную активность, усиливает функциональную активность гепатоци-тов и миоцитов. Комплексное применение эссенциале с милдронатом при токсических поражениях эффективно корригируют все изученные функции. Установлено, что регуляторы обмена углеводов (тиамин и инозин) при токсических поражениях печени усиливают, а регуляторы липидного обмена (L-карнитин и биотин) могут как усиливать, так и ослаблять иммунологические функции. Доказано, что появление иммуносупрессирующеи активности у эритроцитов при токсических поражениях почек обусловлено их взаимодействием с тромбоцитами. Липопротеиды низкой и очень низкой плотности обладают свойством усиливать этот эффект тромбоцитов.
Практическое значение. Экспериментально обоснована перспективность для достижения иммуномодулирующего, гепатопротекторного и акто-протекторного эффектов сочетанного применения эссенциале с рибоксином, милдронатом и мексидолом при клинических формах токсического поражения печени, почек и кроветворной ткани. Показана возможность усиления эффектов, вызываемых рибоксином и эссенциале, с помощью антител к эритроцитам, модифицированным этими препаратами.
Обоснована перспективность изучения тромбоэритроцитарного механизма иммуносупрессии и влияние взаимодействия лекарственных препаратов на этот механизм регуляции иммунологических функций. Выявлено преимущественное влияние эссенциале в сочетании с рибоксином, милдронатом и мексидолом на метаболические маркеры функциональной активности клеток крови и обоснована перспективность клинического изучения определения параметров этих маркеров для прогнозирования иммуномодулирующего действия указанных сочетаний при поступлении в организм ксенобиотиков, обладающих избирательной цитотоксичностью. Показана целесообразность изучения в клинике
12 взаимосвязи между иммуномодулирующим, гепато- и актопротекторными эффектами препаратов, регулирующих процессы энергообеспечения клеток.
Материалы диссертации включены в рабочие программы по фармакологии, патофизиологии, биохимии, хирургии, акушерства и гинекологии, спортивной и экстремальной медицины, на кафедрах Курского государственного медицинского университета, Московского государственного медико-стоматологического университета, Самарского государственного медицинского университета, Ивановской государственной медицинской академии и Нижегородской государственной медицинской академии.
Положения, выносимые на защиту:
Регуляторы обмена углеводов и липидов уменьшают выраженность иммунометаболических изменений, вызываемых поступлением в организм токсических соединений.
Эссенциале усиливает иммунометаболические эффекты регуляторов обмена углеводов и липидов при токсических поражениях.
Выраженный иммуномодулирующий эффект при токсических поражениях вызывает совместное применение эссенциале и антигипоксантов.
Парные сочетания препаратов избирательно повышают эффективность иммунологических функций, метаболических процессов и физической работоспособности при токсических поражениях.
В реализации иммуносупрессирующего действия токсических ксенобиотиков и иммуносупрессирующих эффектов фармакологических препаратов важную роль играют тромбоэритроцитарные и эритролейкоцитарные взаимодействия.
Иммуномодулирующее действие эссенциале и регуляторов энергетического обмена при токсических поражениях усиливается антителами, образующимися к тяжелым эритроцитам.
7.Иммунодулирующее действие фармакологических препаратов коррелирует с показателями метаболической активности полинуклеаров и мононуклеа-ров крови, эритроцитов и тромбоцитов.
13 Публикации.
Опубликовано 36 научных работ в том числе 9 в реферируемых изданиях и 3 монографиях. Получено положительное решение на выдачу патента на изобретение.
Материалы диссертации включены в рабочие программы по фармакологии, патофизиологии, биохимии, хирургии, акушерства и гинекологии, спортивной и экстремальной медицины на кафедрах Курского государственного медицинского университета, Московского государственного медико-стоматологического университета, Самарского государственного медицинского университета, Ивановской государственной медицинской академии и Нижегородской государственной медицинской академии.
Роль эритроцитов в реализации иммунометаболических эффектов токсических соединений
Многоклеточные организмы имеют развитые системы транспорта питательных веществ, регуляторных молекул кислорода. Перенос различных молекул в организме позвоночных обеспечиваются специализированными клетками — эритроцитами, которые осуществляют транспорт 02 и СОг, а также биологически активных соединений (аминокислот, пептидоы, нейромедиаторов, гормонов, цитокинов). Это позволяет считать эритроцит универсальной транспортной системой позвоночных (Б. Альберте и др., 1987; R. Avery, К. Gardner, V. Bermet, 1989; W. Bettger, 1990; G. Celedon et al., 1992).
Транспортные функции эритроцитов определяются их способностью к относительно длительному сохранению структурной и функциональной целостности мембраны, к сохранению концентрации и функциональной полноценности гемоглобина, поддержанию функционально обоснованного взаимодействия между различными формами гемоглобина и структурами клеточной мембраны, сохранению формы клетки, к обратимой деформируемости, сохранению структуры эпитопов и их архитектоники, являющихся необходимым условием эффективного взаимодействия с различными клетками организма (В.П. Иванов и др., 2004). Наряду с сохранением стабильности указанных параметров эритроцит должен быть способен к обратимому изменению их в определенных пределах в постоянно флуктуирующих условиях внешней, для этой клетки, среды (СИ. Вишняков, 1988; З.П. Кометиани, М.Г. Векуа, 1988; В.П. Скулачев, 1989; Б.А. Ташмухамедов, П.Б. Усманов, 1991).
Реализация всех указанных особенностей эритроцитов обеспечивается составом и структурой их мембраны и своеобразием протекающих в них биохимических процессов, обеспечивающих целостность клеток и выполнение ими транспортных и регуляторных функций.
Эритроциты не имеют внутренней структуры. Относительно гомогенное содержимое этих клеток ограничено высокоструктурированной мембраной, которая служит поверхностью раздела между плазмой и цитозолем. Внутренность эритроцита представляет собой сильно концентрированный водный раствор гемоглобина, содержащий, в основном, ферменты гликолиза и пентозофосфатно-го пути окисления глюкозы, 2,3-бисфосфоглицерат и другие фосформированные интермедиа метаболизма, нуклеотиды, глутатион и электролиты. Эритроциты, в отличие от цитоплазмы, имеют высокую концентрацию калия и низкую концентрацию натрия (Н.В. Рязанцев, В.В. Новицкий, 2004).
Основой мембраны эритроцитов является двойной фосфолипидный слой. Внутренний и внешние слои содержат полярные фосфатные группы, связанные с аминоспиртами или другими соединениями, неполярные цепи жирнокислот-ных остатков обращены внутрь мембраны, образуя гидрофобную «сухую» зону. Наружный слой мембраны обогащен фосфатидилхолином, внутренний — фос-фатидилсерином. Во всей толще мембраны, но преимущественно во внешнем слое, распределены молекулы холестерина. Мембрана содержит большое количество различных белков (Р. Мари и др., 1993; Р. Геннис, 1997).
Согласно современным представлениям, одним из факторов, определяющих слаженное функционирование эритроцитарной мембраны, является строгая упорядоченность расположения белковых макромолекул. В соответствии со способом встраивания в мембрану белки подразделяются на интегральные и периферические (А. Ленинджер, 1985; Л. Страйер, 1984; М. Saxton, 1990).
Интегральные белки в зависимости от степени гидрофобности погружены или пронизывают бислой липидов. Функции интегральных белков достаточно многообразны: они выступают в роли гидролитических ферментов, носителей рецепторов клеточной поверхности, окислительно-восстановительных компонентов транспортной системы электронов, специфических переносчиков ионов, аминокислот и различных Сахаров (Г.А. Черницкий, А.В. Воробьев, 1981; R. Anderson, R. Lovrien, 1984; P. Agre, J. Parker, 1989; J. Delaunay, 1993; C.A. сторожок, А.Г. Санников, 1996).
Степень погружения белков в гидрофобную толщу мембраны неодинакова. Жидкостно-кристаллические свойства липидного матрикса позволяют интегральным белкам диффундировать в плоскости мембраны. Они могут объеди 29 няться в агрегаты и, пронизывая толщу мембраны, формировать поры и каналы (А.А. Болдырев, 1986; A.M. Казенков, М.Н. Маслова, 1987; М. Saxton, 1990).
Периферические белки удерживаются в мембране относительно слабыми нековалентными связями, не вступая с липидами в гидрофобные взаимодействия. Основная часть (до 80%) периферических белков мембраны эритроцитов входит в состав его цитоскелета, который представляет собой эластичную двумерную сеть, соединенную непосредственно с мембраной через взаимодействие с полярными группами интегральных белков и полярными головками липидов (А.А. Болдырев, 1987). Кроме того, к периферическим белкам относится ряд эритроцитарных ферментов (Е.А. Черницкий, А.В. Воробьев, 1981).
С мембраной эритроцита связана глицеральдегид-3-фосфатдегидро-геназа (ММ = 35 кД), которая является одним из важнейших ферментов гликолитиче-ского расщепления глюкозы. В эритроцитах этот фермент формирует 2,3-бисфосфоглицератный шунт, регулирующий диссоциацию оксигемоглобина (S. Harris, D. Winzor, 1990). Понижение содержания фермента наблюдается с 60 дня циркуляции эритроцита, когда он становится более чувствительным к внешним воздействиям, что является одним из факторов старения эритроцитов (А.Д. Павлов, Е.Ф. Моршакова, 1987).
В мембране эритроцитов обнаружен также фермент глутатион-S-трансфераза (ММ - 23 кД) (P. White, G. Plishker, 1983; Н. Mizukami et al., 1984). Он относится к семейству мультифункщюнальных ферментов, нейтрализующих токсическое влияние различных гидрофобных соединений путем их конъюгации с восстановленным глутатионом. Фермент защищает SH-группы белков от повреждающих действий активных метаболитов кислорода.
Иммунометаболическое действие элькара и биотина при токсической фенилгидразиновой анемии
Введение животным Р-каротина увеличивает пролиферативный ответ Т- и В-лимфоцитов на ФГА, КоА, ЛПС и PWM, повышает интенсивность гуморального иммунного ответа, стимулирует выделение ИЛ-1 макрофагами и ИЛ-2 Т-лимфоцитами (О.В. Боюклинская и др., 1993; А.В. Сергеев и др., 1995; И.О. Абронина и др., 1993; A. Hong, Ch. Bailei, 1994; Н. Lyonouchi et al., 1995). Водорастворимый р-каротин (веротон) повышает функциональную активность фагоцитов, стимулирует развитие клеточного и гуморального иммунного ответа у здоровых людей (А.В. Сергеев и др., 1995). р-каротин корригирует противоопухолевый иммунитет при злокачественных новообразованиях (D. Dillehay et al., 1989; Ю.В. Букин, 1993; И.О. Абронина и др., 1994).
Р-каротин депонируется и частично гидролизуется с образованием витамина А в печени. Иммуномодулирующие эффекты Р-каротина в определенной степени обусловлены образующимися из него ретинолом и ретиноевой кислотой (Н.Н. Гесслер и др., 2001). Действие витамина А направленно в основном на эпителиальные и мезенхимные клетки. Он является фактором регуляции процессов пролиферации и дифференцировки клеток, затрагивая эти процессы как на геномном так и на эпигеномном уровнях (I. Clark et al,1987: Ю.И. Афанасьев и др., 1990; R. Semba, 1995). Витамин А стимулирует развитие гуморального и клеточного иммунного ответа на различные антигены (М.Ю. Лидак, К.Д. Плецитый, 1984; К.Д. Плеци-тый и др., 1989). Он является эссенциальным фактором активации лимфоцитов (Н. lyonouchi et al., 1995; W. Kjolhede, W. Beisel, 1995; R Griffith, 2002), усиливает пролиферативный ответ лимфоцитов на КоА и митоген локоноса (D. Dillehay, 1989, Н. Griffith, 2002). (З-каротины и витамины А ослабляют иммуносупрессирующее действие антибиотиков (А.И Лазарев и др., 1996), усиливают иммуностимулирующий эффект тепловых процедур магнитного облучения (Л.Г. Прокопенко, Н.А. Бы-строва, 2000; Н.А. Быстрова, А.И. Лазарев, 2003; Н. А. Быстрова, А.И Князев. 2003) и кратковременного локального охлаждения (А.Р. Авакян и др., 2003).
Длительное время считали, что основная функция каротиноидов в животном организме обусловлена их способностью превращаться в витамин А, участвующий в процессах фоторецепции, регуляции пролиферации и дифференци-ровки клеток (J. Dorea, М. Araujol988; A. Pasatlempo et al. 1992). В настоящее время установлено, что каротиноиды обладают независимыми от витамина А биологически значимыми свойствами (А.В. Сергеев и др., 1992; U. Hammerling et al., 1994). В организме животных и человека они действуют как фотопротекторы и антиоксиданты, на молекулярном и клеточном уровнях предотвращают генетические трансформации, индуцированные окислителями, гепатотоксиче-скими веществами, ионизирующим и ультрафиолетовым излучением, поддерживают резистентность организма к действию мутагенных и канцерогенных агентов, способствуют экономному расходованию антиоксидантных витаминов и ферментов, проявляют антистрессорные свойства (А.В. Сергеев и др., 1997).
В последние годы особое внимание уделяют иммуномодулирующим и противоопухолевым свойствам ретиноевой кислоты, являющейся физиологическим лигандом ретиноидных рецепторов, относящихся к суперсемейству ядерных рецепторов. Ретиноевая кислота рассматривается как системная регуляторная молекула, участвующая в обеспечении гомеостаза Т-клеточного звена иммунной системы (Д.Б. Утешев, 1998, 1999).
Токоферолы (витамин Е) представляют собой жирорастворимые соединения, синтезирующиеся в растительных клетках, но не образующиеся в организме животных и человека. Различают несколько видов токоферолов (а, Р, у и др.), наиболее биологически активным из них является а-токоферол. Он взаимодействует с липидными радикалами и таким путем снижает скорость образования липидных гидроперекисей и продуктов глубокой окислительной деградации жирных кислот (D. Anderson, Е. Means, 1985; Д.С. Рангилова и др., 1990). Под влиянием свободных радикалов а-токоферол превращается в радикальную форму, которая включается в последующие обменные реакции (Ю. И. Афанасьев, Т.В. Боронихина, 1987; Р. Джонсон, 1991). Радикал витамина Е восстанавливается аскорбатом, что свидетельствует о синергизме антиоксидантов липид-ной и водной фаз клетки (Е. Bell, 1987; В. Santini et al., 1988; Б.В. Спиричев, 1989). а-токоферол и аскорбат повышают устойчивость (3-каротина к окислению (А.И. Казаченко и др., 2000). Установлено протекторное действие витамина в отношении интенсивно функционирующих органов, этот эффект обусловлен повышением и снижением процессов ПОЛ (Ю.И. Афанасьев, Т.В. Брони-хина, 1987; D. Phelps, 1987; С.А. Артамонов и др., 1988; P. Caraceni, 1994).
Витамин Е обладает выраженными иммуностимулирующими свойствами. Он усиливает развитие различных форм иммунного ответа (К.Д. Плецитый и др., 1984, 1989). Эффект, вызываемый витамином Е, обусловлен влиянием на пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, стимуляцией продукции ИЛ-2, угнетением клеток супрессоров (К.Д. Плецитый, 1985, 1997). Витамин Е высоко эффективен как иммуномодулятор в сочетании с селеном (М. Roy, 1987; З.В. Трущина, 1995). Токоферол увеличивает продукцию супероксидного радикал-иона ней-трофилами крови человека. Витамин Е регулирует реакции дыхательного взрыва, связанные с изменением концентрации ионов Са +, причем этот эффект может осуществляться независимо от влияния на процессы ПОЛ (I. Jonson et al., 1988; I. Bienz, S. Prival, 1995; А.А. Капралов и др., 1997).
В сочетании с убихинонами, токоферолы участвуют в процессе стабилизации мембранных липидов. При усилении свободнорадикальных процессов, в первую очередь, расходуются токоферолы и только это начинает снижать содержание убихинонов (Е. Komach et al., 1992; Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков, 1993; Y. Weing, 1994; S. Wiseman, 1995).
Установлено, что витамины А и Е эффективны как иммуномодуляторы при физических нагрузках (И.Л. Ласкова, 1990), вибрационном поражении (Е.А. Яковлева, 1990), алкогольной интоксикации (К.Д. Плецитый, Т..В. Давыдова, 1994), токсическом поражении печени и кроветворной ткани (P. Caralni, 1994, Е.Н. Конопля, 1997; А.А. Конопля, Н.А. Бровкина, 2000; А.А. Конопля, 2004), холодовом и тепловом стрессе (L. Tesoriere, 1996; Б.С. Утешев, 2001; О.А. Суняйкина, 2004).
Широкий спектр иммунометаболического действия характерен для наф-тохинонов (витаминов К). Общеизвестно участие витаминов К в биосинтезе ге-патоцитами белков свертывающей системы крови. Опубликованы работы, в которых показано, что природные витамины К и их аналоги обладают антиокси-дантными свойствами и энергезирующей активностью (В.М. Авакумов и др., 1992; Л.В. Назаров, В.А. Лидер, 1996; Guffith, 2002).
Аналог витамина К - менадион - встраивается в дыхательную цепь с помощью фермента менадионредуктазы, имеющейся в больших количествах во всех тканях. Витамины К3 шунтируют поток электронов на участке НАДН— KoQ и способствуют восстановлению прерванного при гипоксии потока электронов от НАДН к терминальному участку дыхательной цепи.
Инверсионная иммуномодуляция эффектов, вызываемых эссенциале и рибоксином, при токсической анемии
Плазму, дефицитную и обогащенную тромбоцитами, получа ли путем центрифугирования гепаринизированной крови (25 ЕД гепарина на 1 мл крови) в течение 5 минут при 180 g (рис. 2). После расслоения крови на плазму, лейкоцитарный слой и эритроциты отбирали первый слой и центрифу гировали в течение 10 минут при 600 g. Супернатант представлял собой плазму, обогащенную тромбоцитами. Для получения плазмы, дефицитной по тромбоци там, последние осаждали центрифугированием ПОТ в течение 15 мин в гради енте плотности человеческого альбумина при 1000 g (А.Х. Коган и др., 1992). После выделения ПДТ и тромбоцитов, взвесь последних пропускали через ко лонку с сефарозой 2В, получая концентрированную и очищенную взвесь тром боцитов (Т.А. Ермолаева и др., 1991). Метаболическим маркером активности тромбоцитов служила концентрация в них МДА (Е.В. Негреску и др., 1992). ПОТ и ПДТ использовали для обработки легких эритроцитов (1x10 клеток инкубировали в 1 мл плазмы в течение 1 часа при 37 С). Тромбоциты и легкие эритроциты инкубировали в плазме крови (1x10 тромбоцитов плюс 1x10 эритроцитов в 1 мл плазмы, 30 минут при 37 С). Иммуномодулирующая активность инкубата определялась путем трехкратного (с шестичасовым интервалом) внутривенного введения здоровым аллогенным реципиентам, которых иммунизировали ЭБ при последнем поступлении инкубата.
Выделение и изучение функциональной активности клеток селезенки и лимфоцитов периферической крови. Клетки селезенки фракциони ровали по их способности прилипать к стеклянной поверхности (П. Дерфлинг, 3. Вихнер, 1987). Прилипающие к стеклу клетки дополнительно фракционировали при температурном градиенте (СВ. Родионов и др., 1985). Определение количества клеток и их жизнеспособности проводили с помощью теста поглощения трипанового синего. Приготовленная таким образом суспензия клеток селезенки содержала 85-90% жизнеспособных клеток, что соответствует литературным данным.
Прилипающие и неприлипающие клетки селезенки культивировали в ере-де 199 (5x10 клеток на 3 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин и стрептомицин) в течение 4 ч в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды 95% кислорода и 5% углекислого газа). До истечения срока инкубации клетки осаждали центрифугированием (15 мин при 400 g) и готовили пул супернатантов прилипающих и неприлипающих к стеклу клеток селезенки, содержащих равные объемы супернатантов 5-6 животных. Пул жидкости диализовали 12-15 ч против 50-кратного объёма 0,05 М трис-HCl-буфера (рН 8,0), приготовленного на 0,15 М растворе натрия хлорида. После диализа надосадочнуто жидкость концентрировали полиэтиленгликолем (молекулярная масса 40 кД) и повторно диализовали против трис-НС1-буфера. Очищенную от низкомолекулярных веществ и сконцентрированную надосадочную жидкость освобождали от образовавшегося при концентрировании осадка центрифугированием (20 мин при 800 g). Концентрацию белка в супернатантах определяли с использованием красителя Ку-маси G-250 по Брефорду (С.С. Шишков, 1989).
Иммуномодулирущую активность СПКС и СНКС оценивали путём однократного внутрибрюшинного введения интактным аллогенным реципиентам из расчета I мг /кг белка супернатанта одновременно с иммунизацией ЭБ. Лимфоциты периферической крови выделяли по Т.В. Федосеевой с со-авт. (1993) и определяли в них содержание фруктозо-2-6-дифосфата (Б.Ф. Ко-ровкин и др., 1999). Клетки культивировали с аллогенными эритроцитами в со-отношении клеток 1:2 (5x10 лимфоцитов и 1x10 эритроцитов в 3 мл среды 199). Активность надосадочной жидкости определяли путем добавления ее к взвеси ПЯЛ (1x10 клеток на 100 мкг белка надосадочной жидкости) и после 72 дующего определения показателей ФМА. 4.9. Определение иммуносупрессорных соединений крови. Иммуносу прессорный потенциал крови оценивали по концентрации в сыворотке липо протеидов низкой плотности (В.В. Меньшиков. 1987) и глюкозаминогликанов (Б.Ф. Мурашов и др., 1986), al-антипротеаз и а2-макроглобулинов (В.Ф. Кар тикова, Т.С. Пасхина. 1976). 4.10. Определение биохимических параметров. В крови определяли ко личество эритроцитов и гемоглобина. В сыворотке крови экспериментальных животных устанавливали концентрацию билирубина, активность аспартат- и аланинаминотрансфераз, щелочной фосфатазы. Величины всех перечисленных показателей определяли унифицированными методами с использованием стан дартных наборов реактивов. Индикатором синдрома цитолиза являлись актив ность ACT и АЛТ; синдрома холестаза - активность ЩФ и концентрация ОБ. О состоянии выделительной функции почек судили по концентрации мочевины и креатининав крови (В.В. Меньшиков, 1987). Маркером матаболического состояния гепатоцитов служила скорость биотрансформации тиопентала натрия, оцениваемая по времени индуцируемого этим соединением наркотического сна. Содержание фруктозо-2,6-дифосфата (ФДФ2) в гепатоцитах и лимфоцитах определяли по способности этого соединения активировать пирофосфатза-висимую фосфофруктокиназу (Б.Ф. Коровкин и др., 1999). 4.11. Определение энергетического, антиоксидантного потенциала эритроцитов, состояния перекисного окисления в эритроцитах. Энергети ческий потенциал эритроцитов оценивали по содержанию в них АТФ и 2,3 бисфосфоглицерата (И.Л. Виноградова и др., 1980), а их антиоксидантный по тенциал - по активности супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы (Е.В. Ма каренко, 1988), каталазы (М.А. Подильчак, 1967) и глутатионпероксидазы (А.П. Гаврилюк, Н.Ф. Хмара, 1986). Выраженность перекисного окисления липидов в эритроцитах оценивали по содержанию ацилгидроперекисей и малонового ди альдегида (В .И. Бенисевич, Л.И. Идельсон, 1973). В строме эритроцитов, полу ченных методом осмотического шока, определяли суммарную активность Na+,
Иммунометаболические эффекты взаимодействия эссенциале с регуляторами энергетического обмена при токсическом поражении печени и почек
Возникновение анемии закономерно сопровождается усилением генерации активных метаболитов кислорода, снижением потенциала антиоксидантной системы, повышением интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в различных тканях. Существенно поврежденными оказываются структура и функции иммуноцитов, гепатоцитов и миоцитов. Это служит причиной глубокого разба-лансирования метаболических процессов, снижения двигательной активности, угнетения неспецифической резистентности и иммунологической реактивности. Функциональная активность иммуноцитов, гепатоцитов и миоцитов взаимосвязана (Л.Г. Прокопенко, И.Л. Ласкова, 2003). Эта взаимосвязь опосредована цитоки-нами, синтезирующимися иммуноцитами, и метаболитами, выделяющимися в сосудистое русло клетками печени. Роль звена сопряжения в реализации активности этих соединений играют эритроциты (Л.Г. Прокопенко, Л.Е. Сипливая, 1992). Гуморальные влияния интенсивно работающих миоцитов на функциональную активность иммуноцитов и гепатоцитов остаются малоизученными.
Учитывая изложенное, представляется перспективным поиск фармакологических средств коррекции нарушений функции иммуноцитов, гепатоцитов и миоцитов при различных формах гипоксии.
Имеющиеся в литературе данные позволяют из большого числа метаболических регуляторов выделить для изучения эссенциале, полиненасыщенные фос-фолипиды которого включаются в наружный слой цитоплазматических мембран, солюбилизируют избыток содержащегося в нем холестерина, оказывают влияние на конформацию гликопротеидной структуры эпитопов. Полиненасыщенные фосфолипиды обладают выраженными антиоксидантиыми свойствами, они стабилизируют структуру мембраны клеток за счет снижения в ней процессов ПОЛ (А.Д Гордиенко, 1990).
Полиненасыщенные фосфолипиды (ПНФЛ), применяемые в форме эссен-циале или липостабила, являются эффективными иммуномодуляторами при интенсивных физических нагрузках (Б.С. Утешев, И.Л. Ласкова, 1995), алиментарной гиперлипидемии (Ф.Я. Байбурин и др., 2000), массивных кровопотерях (Г.А. Лазарева, 2000), токсическом поражении печени (Е.Н. Конопля, Л.Г. Прокопенко, 1992). Иммуномодулирующая активность ПНФЛ обусловлена их мембранопро-текторным действием, в основе которого лежат заместительный и антиоксидант-ный эффекты (Б.С. Утешев, И.Л. Ласкова, 1996). ПНФЛ корригируют повышение функционально-метаболической активности (ФМА) лейкоцитов и иммунологической реактивности организма, вызываемое антиоксидантами липидной природы -Р-каротина и а-токоферола ацетата (Л.Г. Прокопенко и др., 2000). При многих формах стресса и патологии угнетение иммунологических функций обусловлено нарушением энергообеспечения гепатоцитов, эритроцитов, полиморфно-ядерных лейкоцитов и лимфоцитов (Л.Г. Прокопенко, 2000). В этих ситуациях иммуномо-дулирующий эффект может быть вызван введением регуляторов энергетического обмена - тиамином, биотином, рибоксином, элькаром. Принимая во внимание изложенное, можно предположить, что сочетанное применение эссенциале с перечисленными соединениями окажется эффективным средством коррекции физиологических функций при различных формах токсического нарушения гомеостаза.
В первой части экспериментов изучено влияние эссенциале на иммуномета-болические эффекты, вызываемые тиамином и биотином при токсической анемии.
Тиамин вызывал слабо (но статистически существенно) выраженное повышение показателей ФМА лейкоцитов и иммунного ответа у животных, отравленных фенилгидразином, биотин и эссенциале не вызывали иммуномодулирующего эффекта. Тиамин в сочетании с эссенциале повышал показатели ФМА лейкоцитов, усиливал развитие иммунного ответа у крыс, отравленных фенилгидразином. Введение биотина в сочетании с эссенциале не приводило к изменению неспеци Рисунок 4. Влияние тиамина, биотина и эссенциале на ФМА ПЯЛ и развитие ГИО, индуцированного ЭБ при гемолитической анемии.
Примечания: А - количество частиц латекса, поглощенных 100 клетками (ФИ х ФЧ), Б - количество АОК в селезёнке (тыс/орган). По оси абсцисс: 1 - контроль (без введения ФГ и препаратов), 2) введение ФГ, 3) введение ФГ и тиамина, 4) введение ФГ и биотина, 5) введение ФГ и ПНФЛ, 6) введение ФГ, тиамина и ПНФЛ, 7) введение ФГ, биотина и ПНФЛ.
Инъекции гемолитического яда снижали ФМА ПЯЛ, угнетали развитие ГИО и ГЗТ, снижали содержание макроэргических соединений БФГ и АТФ), активность антиоксидантных ферментов продуктов СОД и каталазы, повышали содержание продуктов ПОЛ в легких и тяжелых эритроцитах. В тяжелых клетках указанные сдвиги были выражены сильнее, чем в легких. Введение фенилгидразина индуцировало появление иммуносупрессирующих свойств у лёгких эритроцитов.
Инъекции препаратов по отдельности не влияли на показатели энергетического потенциала и окислительного статуса эритроцитов отравленных крыс. Сочетание эссенциале с биотином также оказалось неэффективным. Вместе с тем эссенциале в сочетании с тиамином нормализовал окислительно-энергетический потенциал легких эритроцитов, уменьшал (но не нормализовал) потенциал тяжелых клеток. Тиамин с эссенциале уменьшал выраженность иммуносупрессирую-щих свойств лёгких эритроцитов отравленных фенилгидразином животных. Эссенциале в сочетании с биотином не влиял на иммуномодулирующие свойства эритроцитов (табл. 30).
Похожие диссертации на Иммунометаболические эффекты применения регуляторов энергетического обмена при токсических нарушениях гомеостаза
![Иммунометаболическая активность регуляторов энергетического обмена при алиментарных нарушениях [Электронный ресурс]](/i/i/4372/207855.png "Иммунометаболическая активность регуляторов энергетического обмена при алиментарных нарушениях [Электронный ресурс] Денисюк Татьяна Алексеевна")
![Влияние гепатопротекторов и регуляторов энергетического обмена на биоэнергетику головного мозга при нарушении [В]-окисления жирных кислот](/i/i/4422/313245.png "Влияние гепатопротекторов и регуляторов энергетического обмена на биоэнергетику головного мозга при нарушении [В]-окисления жирных кислот Слепичев Владимир Анатольевич")
