Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Характеристика глауцина его физико-химические свойства
1.1.Характер и етика алкалоида глауцина гидрохлорида 10
1.1.1.Структура 10
1.1.2.Физико-химические свойства 22
1.1.3 . Фармакологическое действие 30
1.2. Методы анализа алкалоида глауцина гидрохлорида 36
1.2.1.Качественное определение (идентификация) 36
1.2.1.1.Химические методы 36
1.2.1.2.Хроматографические методы 43
1.2.2.Количественное определение 44
1.3.Метод ВЭЖХ для качественного и количественного определения глауцина 48
1.4. Получение алкалоида глауцина гидрохлорида 50
1.4.1.Характеристика лекарственного растительного сырья - травы мачка желтого 50
1.4.2.Способы получения глауцина гидрохлорида из травы мачка желтого 52
Глава 2. Усовершенствование технологии получения глауцина и методов его стандартизации
2.1.Объекты исследования 56
2.2.Вещества и растворители 56
2.Э.Оборудование и материалы 56
2.4. Разработка методов количественного определения глауцина в траве мачка желтого 57
2.4.1. Разработка метода количественного определения глауцина в траве мачка желтого с использованием ВЭЖХ 57
2.4.2. Характеристика ЯМР спектра основания глауцина 65
2.4.3. Разработка метода количественного определения глауцина в траве мачка желтого с использованием ЯМР спектрометрии 68
2.5. Совершенствование технологии получения S(+) - глауцина из травы мачка желтого 76
2.5.1. Разработка технологии получения 8(+)-глауцина 76
2.5.2. Изучение стадии экстракции суммы алкалоидов содержащей глауцин из растительного сырья травы мачка желтого 89
2.5.3. Схема материального потока глауцина гидрохлорида 93
2.6. Получение алкалоида глауцина гидрохлорида 96
2.6.1. Описание способа получения глауцина 96
2.6.2. Усовершенствования способа кристаллизации глауцина гидрохлорида 97
2.6.3. Химическая схема превращений 98
2.6.4. О реакции нейтрализации фосфорной кислоты в процессе получения глауцина гидрохлорида 101
2.6.5. Об утилизации отходов производства 102
2.7. Характеристика готового продукта 103
2.8. О стереохимии реакции протонирования молекулы глауцина 107
Общие выводы 114
Список литературы 115
- Фармакологическое действие
- Получение алкалоида глауцина гидрохлорида
- Разработка методов количественного определения глауцина в траве мачка желтого
- Разработка технологии получения 8(+)-глауцина
Введение к работе
Актуальность темы. Одними из важных задач, стоящих перед современной химико-фармацевтической промышленностью, являются разработка новых препаратов, а также улучшение качества уже известных лекарственных средств.
В начале 60-х годов уже прошлого века Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) разработала требования к современным лекарственным препаратам. Среди таких критериев были безопасность, доступность населению, приемлемость для пациента и эффективность.
Заболевания бронхолегочной системы сопровождаются кашлем, представляющим собой хорошо известный,- но сложный рефлекс. Лечение кашля заключается, главным образом, в устранении его причины., Именно в таких случаях и назначают противокашлевые средства. К препаратам, относящимся к этой группе, предъявляется ряд требований.. Кроме специфического свойства длительно подавлять кашлевой рефлекс, они не должны угнетать дыхание, оказывать сильное седативное или снотворное действие, не должны вызывать привыкания и пристрастия, уменьшать эффект при длительном применении, повышать артериальное давление, а также не вызывать запор, не раздражать желудочно-кишечный тракт и обладать большой терапевтической широтой.
Препарат, идеально отвечающий современным требованиям противокашлевой терапии, подходящий для лечения как детей, так и взрослых, обладающий доказанной в эксперименте и клинике эффективностью и безопасностью, это глауцина гидрохлорид. Подобно кодеину глауцин подавляет кашлевой центр, но в отличие от него не угнетает дыхания. Препарат не вызывает привыкания и лекарственной зависимости, не замедляет моторику кишечника. С первых дней лечения воздействует на выраженность, частоту и характер кашля, облегчает
дыхание, снимает ощущение удушья. Кроме противокашлевого действия глауцин обладает еще рядом полезных свойств: анальгетическим, противовоспалительным, спазмолитическим и гипотензивным действием. Все эти свойства подтверждены экспериментальными и клиническими данными.
Немаловажное внимание сегодня уделяется экологической стороне технологических процессов, лежащих в основе производства лекарственных препаратов. В производстве препаратов на основе растительного сырья часто используют органические растворители. В связи с тем, что эти вещества несут опасность для людей, занятых в производстве, все более актуальной становится проблема замены органических, растворителей, на, неорганические,, либо замены, одного растворителя на другой, обладающей меньшей токсичностью.
Согласно нормативной документации (НД) определение глауцина в растительном сырье и промежуточных продуктах производства проводят титриметрическими и хроматоспектрофотометрическими методами. Им свойственны такие недостатки, как многостадииность, длительность операций очистки и разделения, недостаточная точность. В современном производстве все большее практическое применение находят методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и ЯМР благодаря высокой чувствительности, точности и селективности, а также малой продолжительности анализа.
Цели работы
изучение пространственного строения и свойств субстанции глауцина гидрохлорида в твердом состоянии и в растворах;
разработка метода количественного определения содержания глауцина в траве мачка желтого с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);
разработка метода количественного определения содержания глауцина в траве мачка желтого с использованием ядерно-магнитного резонанса (ЯМР);
разработка новой эффективной технологии получения глауцина гидрохлорида с заменой экстрагента на головной стадии на экологически безопасный, применением неагрессивных реагентов в отношении используемой аппаратуры;
изучение и оптимизация экстракции алкалоидов мачка желтого из лекарственного растительного сырья.
усовершенствование способа получения глауцина гидрохлорида.
Основные задачи работы
Для достижения поставленной цели необходимо:
выбрать достоверные аналитические методы качественного и количественного определения алкалоидов апорфиновой группы;
изучить хроматографическое поведение глауцина при использовании методов ТСХ и ВЭЖХ, подобрать условия разделения и методы детекции глауцина при анализе методом ТСХ;
изучить спектральные характеристики глауцина методами УФ, ЯМР спектроскопии и подобрать условия анализа;
изучить физико-химические свойства глауцина гидрохлорида;
выбрать соответствующие методы экстракции глауцина из травы мачка желтого;
разработать методику разделения общей суммы алкалоидов травы мачка желтого на разных стадиях экстракции;
разработать метод кристаллизации глауцина гидрохлорида.
Научная новизна
Методами ТСХ и 'Н-ЯМР спектрометрии показано, что глауцина гидрохлорид представляет собой диастереомерную смесь солей алкалоида;
Разработаны новые методы определения глауцина в траве мачка желтого с использованием ВЭЖХи!Н-ЯМР спектрометрии;
Разработан способ получения и очистки глауцина гидрохлорида;
Изучены физико-химические свойства глауцина гидрохлорида.
Практическая значимость работы
Пересмотрена технология получения глауцина гидрохлорида из травы мачка желтого с использованием этанол-фосфатного экстрагента на головной стадии в нескольких вариантах с последующей нейтрализацией кислоты карбонатом кальция, либо смеси последнего с хлоридами кальция или алюминия, обогащением смеси алкалоидов глауцином методом селективной экстракции, получения глауцина гидрохлорида и его очистка методом кристаллизации. Предложенный способ получения оформлен в виде заявки на патент.
Разработана НД на глауцина гидрохлорид, внесены изменения в действующий регламент на получение глауцина гидрохлорида.
Апробация работы
Основные результаты работы изложены в трудах ВИЛАР и материалах международной конференции.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 3 работы и оформлена заявка на патент.
На защиту выносятся следующие положения
результаты разработки методик количественного определения содержания глауцина в траве мачка желтого с использованием методов ЯМР и ВЭЖХ;
результаты разработки новой технологии получения глауцина гидрохлорида из травы мачка желтого;
результаты разработки новой методики кристаллизации глауцина гидрохлорида;
результаты исследований по изучению и оптимизации экстракции алкалоидов мачка желтого из лекарственного растительного сырья;
результаты спектральных исследований стереохимии и компьютерное моделирование молекулы глауцина гидрохлорида и его фосфата.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста, содержит 13 схем, 15 рисунков, 13 таблиц и 4 диаграммы. Работа состоит из введения, обзора литературы, глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы. Список цитированной литературы включает 102 источника. Из них 32 на иностранных языках.
Во введении сформулированы актуальность, цели и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы, положения, выносимые на защиту.
В первой главе на основании краткого обзора данных литературы рассмотрены фармакологические и физико-химические свойства глауцина гидрохлорида. Изучены методы его идентификации и количественного определения. Также рассмотрены известные методы получения данного алкалоида.
Во второй главе представлена экспериментальная часть, в которую входят результаты по разработке методик количественного определения глауцина гидрохлорида методом ЯМР и ВЭЖХ, результаты исследования субстанции глауцина гидрохлорида и изучения экстракции глауцина из травы мачка желтого. Также приведены результаты разработки методики способа получения глауцина гидрохлорида из лекарственного сырья травы мачка желтого и разработки нового способа кристаллизации глауцина гидрохлорида. Изучена пространственная структура молекулы глауцина гидрохлорида. Приведены компьютерные расчеты минимальной потенциальной энергии для наиболее вероятных конформаций единичных молекул основания алкалоида.
Фармакологическое действие
В настоящее время на рынке лекарственных препаратов находятся d-глауцина гидрохлорид, d-глауцина гидробромид (глаувент), dl-глауцин и dl-глауцина фосфат [99]. Рацемический глауцин получен синтетически. Официнальными препаратами, которые производят из надземной части мачка желтого, являются: "Глауцина гидрохлорида таблетки покрытые оболочкой 0,05г" в России; "Глаувент" (глауцина гидробромид) в Болгарии [30]; "Глауцин" (глауцина фосфат) в Македонии [53]; а также комбинированные препараты "Бронхолитин" и "Бронхоцин", которые в своем составе содержат глауцина гидрохлорид и глауцина гидробромид соответственно [51].
Показанием к применению солей глауцина является кашель различной этиологии, в том числе при инфекционно-воспалительных заболеваниях верхних отделов дыхательных путей, бронхов и легких, при бронхиальной астме, плеврите, коклюше, туберкулезе и раке легких.
Для взрослых разовая доза составляет 40 мг, частота приема 2-3 раза в сутки. Для подавления ночного кашля в тяжелых случаях - 80 мг на ночь. Максимальная суточная доза составляет 200 мг. Для детей в возрасте до четырех лет разовая доза - 10 мг, частота приема - 2-3 раза в сутки. Рекомендуется принимать после еды [53].
Глауцина гидрохлорид, получаемый из мачка желтого, принадлежит к группе апорфиноидов и является оптически активным соединением с положительным углом удельного вращения- В настоящее время в-литературе упоминается также использование в лекарственных композициях рацемического глауцина, получаемого синтетически. Основное фармакологическое действие глауцина - его противокашлевая активность. Противокашлевую активность глауцина изучали на кошках под барбамиловым наркозом [93]. В результате проведенных экспериментов было установлено, что глауцин уже в дозе 0,5 мг/кг вызывает в ряде опытов угнетение кашлевого рефлекса. В дозе 1 мг/кг он действует значительно сильнее, продолжительность эффекта достигает в среднем до одного часа. При введении препарата в дозах 2-3 мг/кг отмечено полное выключение рефлекса в течение 1-3 ч с последующим восстановлением исходной реакции [20].
Kase Y., с соавт. [96] изучали противокашлевой эффект и токсичность dl-глауцина фосфата в сравнении с кодеином. Было установлено, что побочные эффекты, вызываемые в некоторых случаях dl-глауцином фосфатом, были гораздо менее выражены, чем в случае с кодеином.
Глауцин влияет на центральную нервную систему, а именно, ему присущи седативные свойства, выражающиеся в способности его оказывать тормозящее влияние на условно-рефлекторную деятельность, вызывать явления центральной миорелаксации и удлинять действие барбитуратов и хлоралгидрата, а также обладает анальгезирующими свойствами [20]. Главным преимуществом глауцина является тот факт, что он не угнетает дыхательный центр. В отличие от кодеина он также не оказывает тормозящего влияния на моторику кишечника, не вызывает привыкания и пристрастия [41, 79]. Как показали исследования, глауцин обладает также значительным адренолитическим действием [2]. При внутривенном введении вызывает снижение артериального давления. В связи с этим этот препарат нужно осторожно использовать у лиц с пониженным артериальным давлением. Димант М.И. и соавт. [22] успешно использовали глауцин для лечения гипертонии первой и второй стадии, а также для лечения эндартериита. (Х- Ангелова- и CL Захаркова [4] изучали влияние глауцина на содержание сахара в крови и гликогена в печени животных. В результате: проведенных экспериментов, которые длились от 1 до 6 месяцев, было установлено, что глауцин увеличивает концентрацию сахара в крови и гликогена в печени.
В условиях целого организма глауцин вызывает понижение тонуса и уменьшение перистальтических сокращений кишечника, что обусловлено влиянием на гладкую мускулатуру [20]. В литературе имеются данные по изучению вазорелаксантного действия глауцина [71, 101].
Туманян М.А. с соавт. [61] изучали иммуностимулирующее действие глауцина гидрохлорида на мышах. В результате экспериментов было установлено, что применение глауцина гидрохлорида в дозе 100 мкг/мышь увеличивает число животных, выживших после заражения бактериями брюшного тифа. Глауцин гидрохлорид оказывает влияние на систему мононуклеарных фагоцитов, в частности на ферменты цитоплазматической мембраны макрофагов.
Николов Р. и Пенева М. [92] изучали анальгезирующее и противовоспалительное действие глауцина. В результате было доказано, что он успешно ингибировал стадию воспаления. Однако анальгезирующее действие было слабо выражено и не имело практического значения.
Миронова М.И. с соавторами [57] изучали токсическое действие глауцина гидрохлорида. В результате было установлено, что при регулярном введении крысам данного препарата в дозах 0,75 мг/кг изменений в общем состоянии животных обнаружено не было. Лекарственное средство не вызывало аллергию, не обладало мутагенным, эмбриотоксическим и тератогенными свойствами. Препарат глауцина гидрохлорид прошел успешные клинические испытания в качестве противокашлевого средства [17].
Petrov J.S. с соавт. [95] сравнили биодоступность и фармакокинетические параметры разных лекарственных форм, содержащих глауцин, а именно таблетки и сироп. В результате проведенных экспериментов не было обнаружено статистически значимых. различий.
Получение алкалоида глауцина гидрохлорида
Растения рода мачек (Glaucium) сем. Маковых (Papaveraceae) — одно-, дву-, редко многолетние малоопушенные травы с характерными ветвистыми стеблями, одиночными пазушными и конечными одно-цветковыми цветоносами, желтыми или красными лепестками [60].
К ним относится мачек желтый (Glaucium flavum Crantz.) -многолетнее травянистое растение, распространенное по побережью и на островах Средиземного моря (Испания, Франция, Албания, Югославия, Греция, Турция, Сирия, Ливан), а также по побережью Атлантического океана (Португалия, Ирландия, Великобритания). На территорию бывшего СССР заходит лишь небольшая часть обширного ареала. В Крыму этот вид распространен преимущественно на южном побережье, а на Кавказе вдоль всего побережья Черного моря: от Таманского полуострова на севере до устья реки Чорох на юге. В естественных условиях мачек желтый нигде не образует крупных зарослей. Его запасы в России незначительны и не могут служить основой для промышленных заготовок. Поэтому он введен в культуру, в частности, в Краснодарском крае. Растение используется как источник для получения алкалоида глауцина [40]. Популяции мачка желтого, произрастающие и культивируемые на территории бывшего СССР в различных экологических условиях, по количественному содержанию глауцина можно разделить на три группы: 1) высокоалкалоидные (крымские популяции) 2) среднеалкалоидные (агропопуляции) 3) низкоалкалоидные (кавказские популяции) [21, 44, 66]. Растение имеет стержневой корень, побеги ветвистые, 20-50 см высотой, с сизыми лировидными перисто-рассеченными листьями. Нижние стеблевые листья густо опушены, верхние стеблевые обычно голые, так же как и стебли. Цветки одиночные, крупные. Лепестки 1,5-3 см. длиной, желтые или оранжевые, с красноватым пятном у основания. Рыльце около 4 мм шириной. Плод - стручковидная коробочка, прямая или слегка изогнутая, 15-25 см длиной, вскрывающаяся двумя створками. Семена мелкие, черные. Цветет с мая по сентябрь. Оптимальный срок сбора сырья - период цветения [43]. В фазе цветения трава содержит 3,3 -3,9 % суммы алкалоидов, в том числе 1,8 - 2,0 % глауцина [23, 65, 73]. Некоторые популяции Glaucium flavum содержат более 3,6 % глауцина [94].
Из мачка желтого выделено более 30 алкалоидов апорфинового, оксоапорфинового, протопинового, протоберберинового, бензофенантридинового и морфинандиенонового ряда [5,10,21,25]. Сырьем для производства глауцина гидрохлорида служит надземная часть мачка желтого [24]. Ловкова М.Я. с соавт. [33] изучали алкалоидный состав травы мачка желтого на ранних стадиях развития методами тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии. Было установлено, что в набухших семенах уровень глауцина увеличивается. При дальнейшем росте проростков и происходит изменение качественного состава алкалоидного комплекса. Доказано, что глауцин доминировал среди других алкалоидов в семенах и надземной части растения, тогда как другой алкалоид -протопин был основным алкалоидом подземных частей растения.
Глауцин был изолирован из надземных частей мачка желтого Пробстом в 1839 году. Однако в чистом виде этот алкалоид впервые удалось получить Фишеру только в 1901 году. В химико-фармацевтической промышленности алкалоид глауцин получают из травы мачка желтого экстракцией дихлорэтаном методом противотока [67, 68, 69]. По предлагаемому методу из предварительно обработанного аммиаком растительного сырья алкалоиды экстрагируют дихлорэтаном, затем переводят в 5 % раствор серной кислоты и после подщелачивания основания извлекают хлороформом. После отгонки хлороформа, глауцин выделяют методом хроматографии на окиси алюминия. Элюцию проводят бензолом или эфиром. Выход глауцина составляет 50 — 55 % веса технической суммы алкалоидов. Полученный таким способом глауцин переводят в хлоргидрат, для чего основание растворяют в минимальном количестве метанольного раствора соляной кислоты и осторожно добавляют петролейный эфир. На границе слоев петролейный эфир - метанол начинается кристаллизация хлоргидрата глауцина. Спустя 14 - 16 часов после стояния кристаллы отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат.
С целью повышения выхода указанного алкалоида из травы мачка желтого болгарские ученые [34-35, 55] изучали локализацию и динамику накопления глауцина в растении, влияние сушки на его содержание в сырье.
Л.Б. Иванова и соавт. [24] предложили метод извлечения глауцина из травы мачка желтого водой, подкисленной серной кислотой. Для очистки и выделения глауцина из кислого извлечения применяли активную кислую глину. Элюирование алкалоида из глины проводили хлороформом и дихлорэтаном, содержащим аммиак. Растворитель отгоняли, остаток растворяли в спирте или ацетоне, подкисленной бромистоводородной кислотой.
X. Димов и соавт. [18] предложили технологическую схему получения глауцина из сырья при помощи перхлорэтилена, который позволяет выделять 90 - 94 % глауцина.
С целью повышения степени экстракции глауцина из травы А.. Минчев и М. Остришева [42] использовали в качестве растворителя тройную смесь вода - хлороформ - этанол, установив оптимальное соотношение компонентов комбинированного экстрагирующего агента с технологической и экономической точек зрения (0,554 : 0,036 : 0,41), при котором степень экстракции алкалоида повышается на 10 %.
Б. Божанов с соавт. [49] исследовали степень экстракции глауцина из сырья при использовании различных экстрагентов, изучили влияние температуры на процесс экстракции гидрофильными растворителями. На основе экстракции 30 % спиртом разработан технологический метод получения глауцина, включающий очистку путем ферментной обработки.
С целью оптимизации режимов экстракции глауцина из мачка желтого был использован электрический разряд. Степень экстракции глауцина при этом составила 91,4 % [75,78]. Л.Г. Кинцурашвили с соавт. [26] экстрагировали надземную часть G. flavum хлороформом, органическую фазу затем обрабатывали 5 % раствором серной кислоты и выделяли кристаллическую фракцию алкалоидов в виде сульфатов. Затем выпавшие сульфаты алкалоидов отделяли, растворяли в воде, подщелачивали 25 %-ным раствором аммиака и экстрагировали хлороформом. Хлороформный экстракт упаривали и остаток разделяли на колонке с окисью алюминия (1 : 30, нейт., акт. II ст.). Алкалоиды элюировали бензолом и смесью бензол-метанол. При элюировании бензолом получили сангвинарин, смесью бензол-метанол (99 : 1) - хелеритрин и глауцин.
Согласно польскому патенту [81], глауцин из травы извлекают холодным и горячим метанолом, очистку проводят с помощью реэкстракции и фильтрования через целлит. Остаток растворяют в метаноле, подкисляют соляной кислотой до рН 6 - 6,5 и кристаллизуют глауцина гидрохлорид.
Pintilie Gabriela Viorica с соавт. [97] извлекали глауцин из травы мачка желтого экстракцией 20 % метанолом в присутствии серной кислоты (0,3 %), с последующей колоночной хроматографией (Vionit CS 34, Vionit CS 32 или Dowex WX2. Колонку обрабатывали 2,5 % раствором аммиака и элюировали метанолом.
Ciesielski Maksymilian с соавт. [77] экстрагировали траву мачка желтого смесью воды и метанола (9 : 1), содержащей 0,7 % хлористоводородной кислоты. Затем проводили реэкстракцию смесью хлороформ - трихлорэтилен (1 : 4) и упаривали. Сухой остаток растворяли в метаноле, наслаивали воду. После того, как смесь отстаивалась, жидкость декантировали, а нерастворимую часть растворяли в 4 % соляной кислоте при 50 С. После очистки активированным углем, добавляли 10 % ацетон и охлаждали до -5 С. Образовавшиеся кристаллы промывали смесью вода - ацетон (9 :1).
Те же авторы [76] экстрагировали траву мачка желтого 0,5 - 4 % раствором серной кислоты, затем подщелачивали раствор аммиаком, экстрагировали трихлорэтиленом и упаривали. Сухой остаток растворяли в ацетоне и обрабатывали активированным углем. Кристаллизацию проводили из 80 % метанола.
Разработка методов количественного определения глауцина в траве мачка желтого
Для определения содержания глауцина в субстанции нами была разработана методика ВЭЖХ, адаптированная для применения на ПЭЗ ВИЛАР. Выбор концентрации пробы, скорости потока и соотношения смеси растворителей проводились экспериментально для достижения достаточного для проведения анализа отделения глауцина от сопутствующих алкалоидов.
Учитывая, что экстракты помимо глауцина содержат фенольные соединения и таликмидин, обладающий криптофенольными свойствами, а также то, что фосфаты глауцина хорошо растворимы в воде и спирте, мы предложили проводить экстракцию сырья смесью спирта и 1 % фосфорной кислоты.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито по ТУ-2322068-89 с отверстиями диаметром 1 мм. Навеску сырья около 250 мг (точная навеска) заливают 25 мл раствора 1 % фосфорной кислоты и спирта в соотношении 4 : 6 по объему и перемешивают в конической колбе на 50 мл на магнитной мешалке в течение 2,5 часа при комнатной температуре. Полученный экстракт фильтруют через бумажный складчатый фильтр диаметром 7 см («белая лента», ТУ 6-09-1678-77) в мерную колбу на 25 мл. Остатки шрота после экстракции промывают 5 мл экстрагента и фильтруют в мерную колбу так, чтобы жидкость дошла до метки мерной колбы. Полученный экстракт фильтруют далее через фильтр 0,45 мкм и хроматографируют. Влажность сырья определяют в соответствии с Государственной фармакопеей 11-го издания (ГФ XI).
Хроматографию проводят на колонке 15x0,40 см с сорбентом «Кромасил» (Kromasil (AzkoNobel)) 100 С-18, 6 мкм (производства фирмы «Элсико», Россия). Подвижную фазу для хроматографии готовят из ацетонитрила для хроматографии, который смешивают с 0,03 М раствором дигидрофосфата калия (рН=4,8±0,1) в соотношении 74 : 26 по объему. Раствор фильтруют через капроновый фильтр 0,45 мкм под вакуумом.
Оборудование: хроматограф Gilson (Франция, США) с детекторами Gilson UV 115 при длине волны 280 нм или хроматограф LCD (Чехословакия) с детектором LCD ГМ 2241, аналого-цифровым преобразователем и программным обеспечением «Юнихром» для Windows 95 («Новые аналитические системы» Минск, Белоруссия) при длине волны 290 нм. Для двухволновой детекции используют детектор Gilson UV 116. Приборы оборудованы инжекторами типа «Rheodyne-7125» с петлей 20 мкл.
Раствор стандартного образца готовят, взвешивая около 10 мг (точная навеска) глауцина гидрохлорида ГСО, в мерную колбу на 50 мл, растворяют в том же экстрагенте что и при экстракции травы мачка желтого - смеси фосфорной кислоты и спирта и доводят этим раствором до метки. Полученный раствор хроматографируют. Раствор изокоридина готовят, взвешивая около 1 мг изокоридина гидрохлорида, во флакон и растворяют в 7 мл смеси фосфорной кислоты и спирта. Раствор, содержащий около 140 мкг/мл изокоридина гидрохлорида, смешивают с раствором ГСО глауцина гидрохлорида в соотношении 1 : 1 и хроматографируют.
Представленный метод отличается хорошей воспроизводимостью. Нами установлен открываемый минимум глауцина основания в траве мачка желтого - 5 мкг/мл. Линейность зависимости между концентрацией и площадью под хроматографическим пиком глауцина соблюдается во всем диапазоне предполагаемых к использованию концентраций от 1,2 мг/мл до 0,006 мг/мл.
Из анализа типичной хроматограммы, представленной на рисунке 4, видно, что во взятом на анализ экстракте сырья мачка желтого присутствуют вещества, поглощающие в УФ области при 280 нм, которые хорошо отделимы от основного пика. Соотношение площадей пиков в хроматограммах, снятых при длине волны 280 нм и 304 нм, у стандарта глауцина гидрохлорида и у пика глауцина в экстракте совпадают, что доказывает полноту и правильность разделения. Сравнительные данные анализов сырья мачка желтого, полученных методами ЯМР и ВЭЖХ, показали близкие результаты содержания глауцина в образцах.
Найденные условия, на наш взгляд, являются оптимальными, так как содержат компромисс между четким отделением примесей и небольшой шириной основного пика. Это позволяет анализировать индивидуальное вещество с достаточной точностью. Метрологические характеристики приведены в таблице 4. Индивидуальность пика глауцина в хроматограмме экстракта проверяли при двухволновом режиме детекции на приборе «Gilson UV 116». Соотношение оптических плотностей измеряли в виде соотношения площадей пиков при 280 и 302 нм. Соотношение для пика глауцина в хроматограмме экстракта не превышала таковое в хроматограмме стандарта более чем на 0,3 % в сторону завышения, что можно рассматривать как систематическую ошибку, хотя она гораздо меньше, чем несистематические.
Было найдено, что тест на «пригодность хроматографической системы» удобно проводить, разделяя два нативных алкалоида мачка желтого изокоридина и глауцина. Эти вещества со сходными физико-химическими свойствами содержатся в достаточных количествах в сырье и являются достаточно доступными. Анализ в предлагаемых нами условиях, будет считаться правильным, если коэффициент селективности будет не менее 1,3. На рисунке 4 приводится хроматограмма экстракта, в которой положение изокоридина указано на основании добавки стандартного образца изокоридина, полученного в лаборатории алкалоидов ВИЛАРа. В экстракте может содержаться коридин, который при рН ниже 6,0 плохо разделяется с изокоридином. Но оба алкалоида полностью отделяются от глауцина, что видно на рисунке 4.
Разработка технологии получения 8(+)-глауцина
Нами предложена новая схема получения глауцина, в которой использованы водные растворы спирта, содержащие фосфорную кислоту. Доказано, что присутствие воды в гидрофильных растворителях значительно увеличивает эффективность извлечения гидрофильных органических соединений. Это обусловлено образованием смешанных водно-этанольных коньюгатов фосфатов глауцина.
Ниже приведены конкретные примеры получения глауцина гидрохлорида с целью выбора наиболее оптимального варианта по выходу готового продукта и по содержанию глауцина в нем.
Пример 1. 100 г измельченной травы мачка желтого с содержанием глауцина в сырье 1,3 % (потеря массы при высушивании w =8,5 %) заливают 1,0 л 60 % водным спиртом. Экстракцию проводят 4 часа. Полученный раствор сливают, добавляют еще 800 мл свежего экстрагента. Эту операцию повторяют еще три раза, причем последний экстракт используют для обработки новой порции сырья. Объединенные экстракты концентрируют в вакууме до 1А первоначального объема. Водный остаток подщелачивают 24 % раствором гидрата окиси аммония (40 мл) до рН 9 и исчерпывающе экстрагируют бензолом (1 : 10) глауцинсодержащую фракцию (6 раз при работающей мешалке; каждую экстракцию проводят в течение 10 минут). Объединенные экстракты промывают водой (2 раза в соотношении 1 : 5) до исчезновения щелочной реакции. Экстракт сушат сульфатом натрия и упаривают досуха. Получают 2,48 г глауцинсодержащей фракции, которую растворяют в метаноле, подкисленном концентрированной соляной кислотой в соотношении (50 : 0,8). Затем приливают 1 мл петролейного эфира (т. кип. 70-100 С) и оставляют на холоду для кристаллизации в течение 6-12 часов. Выпавший гидрохлорид глауцина отфильтровывают, промывают трижды ацетоном по 6 мл и сушат. Получают 0,4866 г гидрохлорида глауцина (выход готового продукта 37,43 % с учетом продукта, выделенного из маточных растворов) с содержанием действующего вещества 98 % (методом ВЭЖХ).
Пример 2. 100 г измельченной травы мачка желтого с содержанием глауцина в сырье 1,3 % (потеря массы при высушивании w =8,5 %) заливают 1,0 л смеси 177,5 мл 96 % этилового спирта и 822,5 мл 1 % фосфорной кислоты (20 % кислым спиртом). Экстракцию проводят при периодическом перемешивании при комнатной температуре. Через 4 часа экстракт сливают и добавляют еще 0,730 л свежего экстрагента. Эту операцию повторяют еще три раза, причем последний экстракт используют для обработки новой порции сырья. Объединенные экстракты 2,1 л концентрируют в вакууме до Уг первоначального объема. Водно-кислотный остаток 1,5 л обрабатывают хлороформом (5 раз порциями, равными 1/3 объема кубового остатка). Объединенные хлороформные извлечения фильтруют через бумажный фильтр и упаривают. Вес хлороформной фракции 0,935 г с содержанием в этой фракции глауцина 0,57 % (по данным ЯМР-метода количественного определения). Смолистый остаток растворяют в 300 мл 5 % хлористоводородной кислоты, подщелачивают 24 % раствором гидрата окиси аммония (35 мл) до рН 9 и исчерпывающе экстрагируют бензолом порциями, равными 1/3 объема водной фазы. При первой обработке водной фазы органическим растворителем из раствора выпадает обильный белый осадок фосфата аммония, который выводится из технологического процесса легкой фильтрацией через нетканный материал «лутросил» или слой ваты. Затем водный раствор исчерпывающе экстрагируют бензолом 6 раз (при работающей мешалке в течение 10 минут). Объединенные экстракты промывают водой (2 раза в соотношении 1 : 5) до удаления щелочной реакции, экстракт сушат сульфатом натрия и упаривают досуха. Получают 0,21 г смолистого остатка основания глауцинсодержащей фракции. Затем глауцин превращают в гидрохлорид в растворе метанола действием концентрированной соляной кислоты согласно прототипу. Получают 0,0995 г глауцина гидрохлорида (выход готового продукта 17,75 % от содержания глауцина в сырье (с учетом глауцина гидрохлорида, выделенного из маточных растворов) с содержанием основного вещества 98% (методом ВЭЖХ). Пример 3. 100 г измельченной травы мачка желтого с содержанием глауцина в сырье 1,3 % (по данным количественного определения глауцина методами ЯМР-спектрометрии и ВЭЖХ) заливают 1,0 л смеси 355 мл 96 % этилового спирта и 645 мл 1 % фосфорной кислоты (40 % кислым спиртом). Экстракцию проводят при периодическом перемешивании при комнатной температуре, через 4 часа экстракт сливают, добавляют еще 0,730 мл свежего экстрагента. Эту операцию повторяют еще три раза, причем последний экстракт используют для обработки новой порции сырья. Объединенные экстракты концентрируют в вакууме до Уг первоначального объема. Водно-кислотный кубовый остаток обрабатывают хлороформом (8 раз порциями, равными Уз объема кубового остатка). Объединенные хлороформные извлечения фильтруют через бумажный фильтр и упаривают. Вес хлороформной фракции 1,91 г с содержанием в ней глауцина 0,86 %. Смолистый остаток растворяют в 300 мл 5 % соляной кислоте, подщелачивают 24 % раствором гидрата окиси аммония (35 мл) до рН 9 и проводят шестикратную экстракцию бензолом порциями, равными 1/3 объема водной фазы (при работающей мешалке в течение 10 мин). При первой обработке водной фазы органическим растворителем из раствора выпадает обильный белый осадок фосфата аммония, который выводится из технологического процесса легкой фильтрацией через нетканный материал «лутросил» или слой ваты. Затем после фильтрации продолжают обработку бензолом. Объединенные экстракты промывают водой (2 раза в соотношении 1 : 5) до удаления щелочной реакции, экстракт сушат сульфатом натрия и упаривают досуха. Получают 1,02 г смолистого остатка основания глауцинсодержащей фракции. Затем глауцин превращают в гидрохлорид в растворе метанола действием концентрированной соляной кислоты согласно прототипу. Получают 0,45 г глауцина гидрохлорида или 34,6 % от содержания глауцина в сырье с содержанием действующего вещества 98 % (методом ВЭЖХ).
Пример 4. Процесс проводят как в примере 1 с тем отличием, что вместо бензола для экстракции используют толуол. Выход 37 % с содержанием действующего вещества 97,5 %. Пример 5. Процесс осуществляют как в примере 3, с тем отличием, что вместо гидрата окиси аммония для подщелачивания используют гидрат окиси натрия. Выход 33 % с содержанием основного вещества 97,0 %. Пример 6. К 100 г травы мачка желтого с содержанием в сырье глауцина 1,3 % приливают 1 л смеси 546 мл спирта этилового 96 и 436 мл фосфорной кислоты 1 % (60 % кислого спирта). Экстракцию проводят при периодическом перемешивании при комнатной температуре, через 4 часа экстракт сливают и добавляют еще 0,730 л этого экстрагента. Эту операцию повторяют еще три раза, причем четвертый экстракт используют для экстракции новой порции сырья. Объединенные экстракты 2,03 - 2,10 л концентрируют в вакууме до кислого кубового остатка 1,01-1,05 л (1Л первоначального объема экстракта) и обрабатывают его хлороформом (8 раз порциями, равными 1Л объема кубового остатка). Объединенные хлороформные извлечения фильтруют через бумажный фильтр и упаривают.
![Совершенствование методов стандартизации лекарственных средств на основе корневищ радиолы розовой [Электронный ресурс]](/i/i/4381/176171.png "Совершенствование методов стандартизации лекарственных средств на основе корневищ радиолы розовой [Электронный ресурс] Петрова Елена Сергеевна")