Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Синтез митоксантрона гидрохлорида 13
1.2. Связь между химической структурой и фармакологической активностью митоксантрона 18
1.3. Физико-химические свойства митоксантрона гидрохлорида 24
1.4. Методы анализа препарата 28
1.4.1. Оптические методы анализа 28
1.4.1.1. Спектрофотометрия в УФ- и видимой частях спектра 28
1.4.1.2. Инфракрасная (ИК-) спектроскопия 32
1.4.1.3. Спектроскопия комбинационного рассеяния (рамановская спектроскопия) 33
1.4.2. Анализ митоксантрона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 34
1.4.3. Фармакопейные методы анализа митоксантрона гидрохлорида 40
Экспериментальная часть 43
Исследование растворимости субстанции 43
Глава 2. Исследование абсорбционных характеристик в ик-, уф- и видимой областях спектра 46
2.1. Исследование ИК- спектров митоксантрона гидрохлорида 46
2.2. Спектрофотометрический анализ митоксантрона гидрохлорида 49
2.2.1. Исследование поглощения водных растворов в видимой и УФ- областях спектра в зависимости от рН среды 50
2.2.2. Изучение характера подчинения водных и водно-спиртовых растворов митоксантрона гидрохлорида закону Бугера-Ламберта-Бера 58
2.2.2.1. Исследование водных растворов митоксантрона гидрохлорида 59
2.2.2.2. Исследование растворов митоксантрона гидрохлорида, содержащих поверхностно-активные вещества (ПАВ) 66
2.2.2.3. Оптические свойства водно-спиртовых растворов митоксантрона гидрохлорида 72
2.2.2.4. Количественный анализ лекарственной формы методом спектрофотометрии 79
2.2.3. Определение прозрачности лекарственной формы 83
Выводы 86
Глава 3. Анализ чистоты субстанции митоксантрона гидрохлорида хроматографическими методами 88
3.1. Применение хроматографии в тонких слоях сорбента 88
3.1.1. Разработка методики контроля чистоты препарата 91
3.1.2. Методики аналитического контроля технологического процесса на стадиях синтеза митоксантрона гидрохлорида 99
3.2. Определение хроматографической чистоты методом ВЭЖХ 101
3.2.1. Анализ митоксантрона гидрохлорида методом ВЭЖХ в обращенно-фазовом режиме 108
3.2.2.Анализ митоксантрона гидрохлорида методом ион-парной ВЭЖХ в обращенно-фазовом режиме 110
Выводы 112
Глава 4. Титриметрический анализ субстанции митоксантрона гидрохлорида 114
4.1. Разработка методики титриметрического определения митоксантрона гидрохлорида в среде протогенных растворителей 118
4.2. Количественное определение митоксантрона гидрохлорида методом обратного титрования в неводных средах 125
4.3. Оценка результатов титриметрического анализа с использованием линейной зависимости результата определения от навески препарата 128
4.4.Сравнение прямого и обратного метода определения митоксантрона гидрохлорида в субстанции Выводы
Глава V. Другие методы контроля качества митоксантрона гидрохлорида
5.1. Качественная реакция на митоксантрона гидрохлорид
5.2. Полярографический анализ митоксантрона гидрохлорида
Выводы
Основные выводы список литературы
- Физико-химические свойства митоксантрона гидрохлорида
- Исследование поглощения водных растворов в видимой и УФ- областях спектра в зависимости от рН среды
- Методики аналитического контроля технологического процесса на стадиях синтеза митоксантрона гидрохлорида
- Количественное определение митоксантрона гидрохлорида методом обратного титрования в неводных средах
Введение к работе
Актуальность темы. Митоксантрона гидрохлорид - современный противоопухолевый препарат, широко применяемый в онкологической практике. Митоксантрон является синтетическим аналогом антрациклиновых антибиотиков, наиболее эффективных цитостатических препаратов-интеркалаторов. Препарат обладает сходной с антрациклинами терапевтической активностью, практически не проявляет свойственной им кардиотоксичности [62, 187]. Митоксантрона гидрохлорид включен в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств (2003)*. Качество препарата регламентировано многими зарубежными фармакопеями, в частности, Европейской (Ph.Eur.4), Британской (ВР 2002) фармакопеями и фармакопеей США (USP 27). Аналитический контроль митоксантрона гидрохлорида у нас в стране затруднен в связи с отсутствием оригинальной документации, регламентирующей основные качественные и количественные показатели качества препарата. Однако использование методов анализа, предлагаемых зарубежными фармакопеями, в нашей стране не представляется возможным. Во-первых, отсутствуют государственные стандартные образцы (ГСО) митоксантрона гидрохлорида и его примесей, необходимые для анализа чистоты препарата и содержания основного вещества методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а во-вторых, в фармакопейных статьях из-за интенсивной окраски препарата отсутствуют многие показатели качества препарата (например, «Прозрачность», «Хлориды»). В разделе «Подлинность» нет качественных реакций препарата.
Количественный анализ субстанции митоксантрона гидрохлорида и его лекарственной формы (ЛФ) согласно зарубежным фармакопеям проводят методом ВЭЖХ.
* Распоряжение Правительства РФ от 20 марта 2003 г. N 357-р об утверждении перечня жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств.
Для улучшения воспроизводимости хроматографического определения митоксантрона гидрохлорида применяют стандарт сравнения митоксантрона гидрохлорида с точно известным содержанием основного вещества. Для разработки ГСО митоксантрона гидрохлорида кроме прочих методов исследования необходим поиск наиболее точного химического метода анализа для определения содержания действующего начала [2,4]. Кроме того, в количественном анализе митоксантрона гидрохлорида необходимо соблюдение требования минимального различия в результатах определения по ионному хлору и катиону митоксантрона, поскольку состав образцов препарата не всегда соответствует составу средней соли [28]. Такие данные можно получить в результате титриметрического определения обеих составляющих молекулы двумя методами, основанными на различных принципах химического взаимодействия (например, осадительного, окислительно-восстановительного, кислотно-основного и др.). В литературе, посвященной анализу митоксантрона, к сожалению, не описаны возможные методы его функционального анализа, в связи с чем, в настоящее время достаточно актуальна разработка титриметрических методов количественного определения основного вещества в субстанции.
Недостаточно изучена возможность применения в контроле качества препарата спектрофотометрии (СФМ) в ультрафиолетовой (УФ-) и видимой областях спектра. Этот удобный и, при определенных условиях, достаточно точный инструментальный метод применяется лишь для подтверждения подлинности ЛФ митоксантрона гидрохлорида в USP 27. Исследование абсорбционных свойств растворов с различной концентрацией митоксантрона гидрохлорида может позволить более широко использовать СФМ в контроле качества препарата [9,23], в частности, в количественном анализе его ЛФ. Кроме того, в связи с применением митоксантрона в виде инъекционной ЛФ важным показателем качества препарата является прозрачность его водных
растворов. Вероятно, данный показатель не введен в фармакопейные статьи в связи с интенсивной окрашенностью ЛФ. Для определения прозрачности таких растворов возможно применение метода дифференциальной изоконцентрационной СФМ. Метод основан на измерении при определенной длине волны оптической плотности нефильтрованного раствора препарата относительно раствора той же концентрации, предварительно подвергнутого фильтрации [И].
Кроме того, в литературе отсутствуют сведения об использовании в анализе чистоты препарата хроматографии в тонких слоях сорбента (ТСХ). Метод может быть удобен для полуколичественного определения примесей в субстанции и ЛФ митоксантрона гидрохлорида. Обнаружение на хроматограмме значительно завышенного содержания примесей относительно их регламентируемого количества исключило бы необходимость применения для дальнейшего анализа таких образцов дорогостоящего метода ВЭЖХ.
В связи с перечисленными выше проблемами представляется целесообразным изучение физико-химических свойств митоксантрона гидрохлорида для разработки на их основе методик контроля качества субстанции и ЛФ в виде раствора для инъекций.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлась разработка комплекса методик стандартизации и контроля качества митоксантрона гидрохлорида и его лекарственной формы. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
изучить основные физико-химические свойства митоксантрона гидрохлорида;
подобрать селективные качественные реакции для подтверждения подлинности препарата;
исследовать колебательные ИК-спектры митоксантрона гидрохлорида, полученные в различных условиях, и соотнести характеристические частоты
полос поглощения с отдельными структурными фрагментами в молекуле митоксантрона;
изучить особенности поглощения растворов митоксантрона гидрохлорида в УФ- и видимой части спектра в различных растворителях и разработать на их основе методику количественного определения основного вещества в ЛФ;
предложить способ определения прозрачности водных растворов митоксантрона гидрохлорида;
подобрать оптимальные условия хроматографирования препарата в тонких слоях сорбента, обеспечивающие разделение примесей;
разработать методики определения примесей в субстанции и ЛФ митоксантрона гидрохлорида методом ВЭЖХ;
подобрать оптимальные условия для валидации теста «Пригодность хроматографической системы» для ВЭЖХ и ТСХ методик;
разработать функциональный метод количественного анализа митоксантрона гидрохлорида, дающий правильные и воспроизводимые результаты;
предложить проект нормативной документации для субстанции и ЛФ митоксантрона гидрохлорида.
Научная новизна работы. Проведено систематическое исследование физико-химических свойств митоксантрона гидрохлорида для стандартизации и контроля качества препарата.
Исследованы ИК-спектры, полученные в различных условиях, проведено соотнесение наиболее характерных полос поглощения с колебаниями отдельных частей молекулы митоксантрона. Показана перспективность использования ИК-спектроскопии для испытаний на подлинность.
Для подтверждения подлинности митоксантрона гидрохлорида предложена селективная цветная реакция.
Изучены особенности поглощения митоксантрона гидрохлорида в УФ- и видимой областях спектра в отдельных растворителях, наиболее детально
исследованы абсорбционные характеристики водных и водно-спиртовых
растворов митоксантрона гидрохлорида различной концентрации. Предложена
методика спектрофотометрического определения митоксантрона гидрохлорида
в инъекционной ЛФ. Разработана методика оценки прозрачности раствора
митоксантрона гидрохлорида методом изоконцентрационной
дифференциальной СФМ.
Разработаны методики контроля чистоты субстанции и ЛФ методом ТСХ и ион-парной ВЭЖХ в обращенно-фазовом режиме.
Разработана методика количественного определения субстанции митоксантрона гидрохлорида методом обратного неводного титрования. Практическая значимость. Разработанные методики включены в проект фармакопейных статей предприятия (ФСП) на субстанцию митоксантрона гидрохлорида и на 0,2 % раствор для инъекций производства ФГУП ГНЦ «НИОПИК» (см. приложение 1).
Апробация работы. Результаты проведенных исследований доложены на II Российской конференции молодых ученых России (Москва, 2001), на научном заседании кафедры фармацевтической химии (Москва, 2001), на IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002); на научно-методической конференции фармацевтического факультета ММА им. И. М. Сеченова (Москва, 1.04.2004). Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.
Физико-химические свойства митоксантрона гидрохлорида
По химической структуре митоксантрона гидрохлорид относится к группе дисперсных антрахиноновых красителей, физико-химические свойства которых достаточно хорошо изучены [20,34, 52].
Физико-химические характеристики митоксантрона гидрохлорида, необходимые для анализа качества препарата мало исследованы [206]. Наиболее изучены свойства митоксантрона, касающиеся его взаимодействия с молекулой ДНК [7, 8, 26, 41]. Разрозненная информация о некоторых физико-химических характеристиках встречается, в основном в справочной литературе и фармакопейных статьях [70,195,199]. Описание
По описанию Ph.Eur.4 и ВР 2002 митоксантрона гидрохлорид представляет собой гигроскопичный, электростатический мелкокристаллический порошок темно-синего цвета. Растворимость
Сведения о растворимости митоксантрона довольно скудные, отдельные приводимые в литературе данные не согласуются друг с другом [116, 142, 195]. Согласно обобщенным данным, митоксантрона гидрохлорид мало растворим в воде и метаноле, очень мало растворим в этаноле 95%, практически нерастворим в ацетоне. Температура плавления
Основание митоксантрона плавится при 160С [214], митоксантрона гидрохлорид плавится с разложением при 205С [148, 149]. Гигроскопичность
Субстанция митоксантрона гидрохлорида умеренно гигроскопична [70, 142]. При относительной влажности воздуха 30-40% она содержит приблизительно 6-8% воды, при увеличении влажности до 50-80% процентное содержание влаги увеличивается до 11-15%. (см. Таблицу 1.1.).
Митоксантрон является солью слабого основания и сильной кислоты. рКа,= 5,99 [81,120,204] и рКа2=8,13 [121, 146]. рН водного 1%-ного раствора равняется 4,1. Из химических свойств митоксантрона наиболее хорошо изучена его способность к окислению и образование комплексов с ионами металлов.
Окислительно-восстановительные свойства митоксантрона Большое количество работ посвящено электрохимическому окислению митоксантрона [69, 155, 203, 216]. Окисление митоксантрона гидрохлорида является многоступенчатым процессом, сопровождающимся образованием свободных радикалов и структурными перегруппировками с участием гидрокси- и аминозамещенных частей молекулы. Исследования показали, что митоксантрона гидрохлорид может окисляться с образованием разнообразных продуктов, и выбор пути окислительного процесса во многом зависит от условий среды (рН, температура и др.). К настоящему времени обнаружено более 10 продуктов окисления митоксантрона гидрохлорида, многие из которых еще не идентифицированы.
Митоксантрон окисляется на стеклоуглеродном электроде с образованием двух пиков в области потенциалов 0,4-0,8 В (квадратноволновая вольтамперометрия). Первый пик (рис. 1.6.1) соответствует окислению гидрохиноидной структуры, образованной 1,4-гидроксигруппами, второй пик (рис. 1.6.2) связан с окислением аминоалкильных заместителей после таутомерных перегруппировок внутри молекулы [203]. На первом этапе митоксантрона гидрохлорид окисляется достаточно легко (при наложении небольшого положительного потенциала 0,65 В). Процесс может протекать обратимо при прекращении увеличения напряжения после +0,5 7В. При этом кинетика электронной передачи указывает на многоступенчатость процесса с возможным образованием промежуточных радикалов и продуктов димеризации митоксантрона гидрохлорида [154]. После образования на первом этапе продукта окисления митоксантрона гидрохлорида в виде тетраоксосоединения в равновесном состоянии в растворе присутствуют его таутомерные формы (см. рис. 1.6.1 ). Наличие в растворе таутомерной формы IV объясняет образование на втором этапе окисления митоксантрона гидрохлорида устойчивого циклического производного V (8,11-дигидрокси-4-(2-гидроксиэтил)6-[[2-(2 гидроксиэтил)-аминоэтил]амино]-1,2,3,4-тетрагидронафто[2,3-/хиноксалин 7,12-диона) [155]. Вышеуказанное соединение образуется при ферментативном окислении митоксантрона в организме [67, 71, 152], а также является основной примесью в препарате, образующейся на стадии окисления во время синтеза митоксантрона гидрохлорида [193, 194] или в процессе хранения [68]. Циклическое производное (V) митоксантрона может окисляться с образованием на промежуточной стадии свободного радикала, и переходящего в неустойчивую форму полностью окисленного производного митоксантрона. Полученное при полном окислении митоксантрона гидрохлорида соединение (VI) структурно идентифицировано [146] и проявляет сильные электрофильные свойства [127, 175]. Использование окислительно восстановительных свойств митоксантрона для аналитических целей не представляется возможным из-за сложного механизма окисления вещества.
Исследование поглощения водных растворов в видимой и УФ- областях спектра в зависимости от рН среды
Применение СФМ в контроле качества митоксантрона гидрохлорида описано лишь в USP 27 [199] и ограничено анализом подлинности ЛФ митоксантрона гидрохлорида. Для этого спектр анализируемого раствора сравнивают со спектром стандартного образца. Спектральные характеристики препарата в свою очередь позволяют более широко использовать СФМ для контроля качества препарата без применения стандарта митоксантрона гидрохлорида [9].
Частично спектрофотометрические характеристики митоксантрона представлены в литературном обзоре настоящей работы. Некоторые оптические свойства растворов основания митоксантрона в ряде органических растворителей описаны в работе [128]. Ясно, что вид спектров митоксантрона должен существенно зависеть от степени протонирования и сольватации его нейтральных молекул или катионов, а также от вероятности образования в рабочих растворах межмолекулярных ассоциатов [124, 145]. Затронутые проблемы мало изучены, что затрудняет не только применение СФМ в анализе препарата, но и осложняет спектрофотометрическое детектирование митоксантрона гидрохлорида и его примесей при количественном определении методом ВЭЖХ. Тем не менее, в работе китайских авторов предложена методика спектрофотометрического определения митоксантрона гидрохлорида в инъекционном растворе препарата после соответствующего разбавления (рН рабочего раствора 2,62-6,92, длина волны детектора 681нм) [211].
В настоящей работе представлены результаты изучения поглощения растворов митоксантрона гидрохлорида в УФ- и видимой областях спектра и на основании полученных данных предложены методики идентификации препарата, его количественного определения в ЛФ и методика оценки прозрачности его растворов.
Наиболее часто для съемки спектров митоксантрона гидрохлорида в УФ-и видимой области в качестве растворителя используют воду, подкисленную хлористоводородной кислотой. Анализ чисто водных растворов осложнен непостоянством величины рН, зависимой от концентрации препарата, в связи с гидролизом молекулы митоксантрона гидрохлорида по катиону.
Для спектров поглощения растворов митоксантрона гидрохлорида в УФ-области характерно наличие полос поглощения, связанных с ж,% - переходами в антрахиноновом ядре. В водных растворах — это полосы при длинах волн около 220, 241 и 276 нм. Кроме того, в спектрах имеются две полосы поглощения в видимой области - около 608 и 660 нм. Они обусловлены наличием в молекуле электронодонорных заместителей - сопряженных с антрахиноновым ядром вторичных аминогрупп. Происхождение этих полос предположительно обусловлено п,7с - и 7г,7с -электронными переходами [128]. Следует отметить, что полоса поглощения при 608 нм в кислой водной среде, превышает интенсивность полосы поглощения при 660 нм, по крайней мере, при концентрациях препарата, превышающих 0,001 %. (см. рис 2.2.)
Постепенное снижение рН водного раствора митоксантрона за счет прибавления кислоты хлористоводородной приводит к исчезновению полос при 608 и 660 нм (см. рис 2.3). Это подтверждает предположение о том, электронный переход в этих областях осуществляется с участием аминогруппы, которая подвергается протонированию в сильно кислой среде. Однако в концентрированных кислотных растворах (например, в 5 М растворе кислоты хлористоводородной) слабая полоса в области 560 нм все же присутствует и ее происхождение пока не известно. Не исключено, что карбонильные группы в сильно кислой среде подвергаются протонированию
При снижении рН водных растворов до значений намного менее 1 происходит протонирование ароматических аминогрупп в положениях 1 и 4 антрахинонового фрагмента, сопровождающееся изменением окраски от синей до красно-фиолетовой (рис.2.4.). Проявление галохромии в данном случае обусловлено связыванием неподеленной пары электронов атома азота ароматической аминогруппы, которая в результате протонирования исключается из сопряжения с электроноакцепторным атомом кислорода карбонила, что сопровождается гипсохромным сдвигом в спектре и изменением окраски. Поскольку основность ароматического атома азота очень низка, особенно с учетом его сопряженности с карбонилом антрахинонового фрагмента, солеобразование происходит только в концентрированных кислотах. При снижении концентрации кислоты путем разбавления раствора происходит обратный процесс - депротонирование, сопровождающееся восстановлением синей окраски.
Методики аналитического контроля технологического процесса на стадиях синтеза митоксантрона гидрохлорида
Были разработаны методики контроля процесса синтеза митоксантрона гидрохлорида, позволяющие определять окончание реакции на каждой из 4-х стадий получения субстанции. Хроматографический контроль состава реакционной смеси облегчается окрашенностью исходных веществ и продуктов реакции.
Контрольная точка №1 1 каплю реакционной суспензии помещают в 2 мл 5%-ной кислоты хлористоводородной и экстрагируют 1 мл хлороформа. Хлороформный экстракт наносят капилляром диаметром 0,5 мм на пластинку силуфол и хроматографируют хлороформом восходящим способом. Отсутствие зеленого пятна с Rf 0,6 исходного соединения и наличие ярко-красного пятна лейкосоединения с Rf 0,2 указывают на окончание 1 реакции. Допускается в следовых количествах наличие пятен фиолетового и серо-зеленого цветов.
Контрольная точка №2
Отбирают пробу реакционной массы, разбавляют 0,3-0,5 мл спирта и наносят на пластинку Силуфол, хроматографируют хлороформом. На хроматограмме не должно быть красного пятна исходного лейкосоединения. Пятно лейкомитоксантрона оранжевого цвета остается на старте. Контрольная точка №3
Пробу реакционной массы растворяют в спирте и каплю полученного раствора наносят на пластинку Силуфол, после подсушивания хроматографируют в системе хлороформ-этанол-концентрированный водный раствор аммиака в соотношении (12:5:0,7). Окисленный продукт и примеси имеют синий цвет и большие значения Rf по сравнению с лейкопроизводным. Процесс окисления считается законченным, если ниже синего пятна митоксантрона с Rf 0,35 отсутствует оранжево-красная зона его лейкопроизводного.
Контрольная точка №4 Основной трудноудаляемой примесью в митоксантроне является 8,11 -дигидрокси-4-(2-гидроксиэтил)6-[[2-(2-гидроксиэтил)-амино]этиламино] 1,2,3,4-тетрагидронафто[2,3-і]хиноксалин-7,12-дион (примесь II) с несколько выше пятна митоксантрона (Rf 0,6) при хроматографировании на Силуфоле в системе этилацетат-спирт- концентрированный водный раствор аммиака (10:3:2). Из-за отсутствия эталона указанной примеси используется образец митоксантрона, содержащий по данным ВЭЖХ 1,4% данного соединения, при допустимом содержании отдельной примеси 1,5%. 0,013г анализируемого образца растворяют в пикнометре на 25мл в смеси этанол-вода (1:1 по объему) Также готовят раствор сравнения с указанным содержанием примеси, 20 мкл (шприц) растворов наносят на Силуфол, тщательно подсушивают в вакууме и хроматографируют в закрытой камере восходящим способом. Длина пробега растворителей 12 см. Содержание примеси оценивают визуально, сравнивая интенсивность пятен с большим Rf. При завышенном содержании примеси, проводят повторную очистку готового продукта.
Наиболее распространенным методом количественного определения и анализа чистоты препарата является метод ВЭЖХ, обладающий высокой чувствительностью. Метод позволяет проводить определение митоксантрона гидрохлорида и его примесей с довольно высокой точностью по интенсивным полосам поглощения в УФ-области спектра. Высокая чувствительность метода ВЭЖХ позволяет решить многие задачи фармацевтического анализа, так как характеризуется высокой чувствительностью, быстротой выполнения, четкостью разделения при относительно низкой температуре.
В литературном обзоре описаны некоторые варианты хроматографического определения митоксантрона гидрохлорида в ЛФ, биологических жидкостях и тканях. Большинство методик трудновоспроизводимы [84, 137, 97], а использование в анализе «экзотических» дорогостоящих растворителей не позволяет рассматривать эти методы как альтернативные фармакопейным [80, 85]. Хроматографические методы анализа требуют использования ГСО митоксантрона. Для его стандартизации помимо других методов анализа необходима разработка химических методов для определения содержания действующего начала.
Разнообразие хроматографических методик определения митоксантрона гидрохлорида в биологических жидкостях и ежегодное появление новых публикаций по этой тематике свидетельствуют об отсутствии унифицированной методики определения митоксантрона. Но нельзя отрицать полезность опубликованных данных для подбора рабочих условий в анализе субстанции и ЛФ препарата.
Митоксантрона гидрохлорид относится к полярным веществам, растворимым в воде, поэтому для разделения его и примесей, прежде всего, рекомендуется применение обращенных фаз.
В анализе митоксантрона гидрохлорида методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в качестве сорбента чаще применяют силикагель, с привитыми к его поверхности химическим путем алкильными цепочками за счет устойчивых силоксановых связей с фенильными, октальными или октадецильными заместителями. Высокополярные растворители, используемые в качестве подвижной фазы в анализе митоксантрона, чаще представляют собой комбинацию водных буферов и широкого набора полярных органических растворителей, например, метанола, ацетонитрила и др.
Путем сравнительной экспериментальной оценки литературных и экспериментальных данных (о сорбенте, элюирующей системе, детекторе и др.) мы подбирали оптимальные условия разделения основного компонента и примесей [76, 168,186]. Выбор оптимальных условий разделения
Для анализа в режиме обращенных фаз нами использовались фирменные колонки импортного и отечественного производства размером 25 см с внутренним диаметром 0,46 см, заполненными как поверхностно-пористыми сорбентами, так и полностью пористыми: «YMC-Pack ODS-AQ», «Bondapack Ci8», «Zorbax ODS», «Zorbax Cg». В качестве ПФ использовали следующие растворители: ацетонитрил, воду, метанол, этанол, а также смеси растворителей: метанол:вода (70:30), этанол:вода (60:40), хлороформ:метанол (70:30). Для создания оптимального рН добавляли формиатный, аммиачный, фосфатный буферные растворы. Анализ с применением вышеуказанных систем растворителей проводили как в изократическом, так и в градиентном режимах. Характер подвижной фазы сильно влияет на избирательность разделения, и скорость разделения веществ.
Количественное определение митоксантрона гидрохлорида методом обратного титрования в неводных средах
Проводили сравнение данных о содержании митоксантрона гидрохлорида в субстанции, полученных при непосредственном добавлении избытка хлорной кислоты к раствору митоксантрона гидрохлорида в муравьиной и уксусной кислотах, и при количественном переносе раствора митоксантрона гидрохлорида в избыток хлорной кислоты. В первой серии сравнения в качестве титранта использовали 0,1М раствор натрия ацетата, во второй -0,05М раствор натрия ацетата.
Установлено, что при использовании в качестве титранта 0,1М раствора ацетата натрия (рис.5) различие между получаемыми значениями незначимо и содержание митоксантрона гидрохлорида в субстанции 98,47% (п=4) при прямом и 98,51% (п=4) при обратном порядке добавления избытка раствора хлорной кислоты.
При проведении подобного сравнения с 0,05М раствором ацетата натрия различие между полученными средними значениями значимо, содержание митоксантрона гидрохлорида в субстанции равно 98,30% (п=4) при прямом и 99,76% (п=4) при обратном порядке добавления хлорной кислоты. Следовательно, при использовании менее концентрированного 2-го титранта (0,05М натрия ацетата) при определении не прореагировавшей с митоксантрона гидрохлоридом хлорной кислоты более точно можно определить количество непрореагировавшей с митоксантрона гидрохлоридом хлорной кислоты. Поэтому в предложенной нами методике количественного определения митоксантрона гидрохлорида в субстанции в качестве второго титранта предложен раствор 0,05 М натрия ацетата в уксусной кислоте.
Кроме определения катионной части соли митоксантрона большое значение для гарантии качества контролируемого препарата имеет требование минимального различия в результатах его количественного определения по ионному хлору и катиону митоксантрона, поскольку состав образцов препарата не всегда соответствует составу средней соли. Для комплексной количественной оценки субстанции митоксантрона гидрохлорида проводили потенциометрическое определение хлорид-ионов 0,1М раствором нитрата серебра в водной среде с добавлением разбавленной азотной кислоты и с использованием серебряного индикаторного электрода и стеклянного электрода сравнения. Содержание хлорид-ионов, определенное таким образом, должно соответствовать результатам ацидиметрического титрования катиона митоксантрона гидрохлорида.
Учитывая все, сказанное выше, для внесения в фармакопейную статью на субстанцию митоксантрона гидрохлорида была предложена следующая методика его количественного определения:
1. Метод неводного титрования Точно 10 мл 0,1 М раствора хлорной кислоты помещают в стакан вместимостью 100 мл (раствор А). Около 0,13 г препарата (точная навеска) помещают в стакан вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл кислоты муравьиной и 2 мл раствора ртути окисной ацетата, перемешивают до растворения навески, прибавляют 20 мл кислоты уксусной ледяной и вновь перемешивают (раствор Б).
При непрерывном перемешивании раствора А к нему медленно приливают (количественный перенос) раствор Б. Стакан, где находился раствор Б, промывают кислотой уксусной ледяной (2 раза по 5 мл), прибавляя ее затем к раствору А. Избыток кислоты хлорной в растворе А титруют 0,05 М раствором натрия ацетата потенциометрически (ГФ XI, вып. 1, с. 120) при перемешивании на магнитной мешалке со стеклянным индикаторным электродом и хлорсеребряным электродом сравнения, заполненным насыщенным раствором перхлората лития в ледяной уксусной кислоте. Параллельно как описано выше проводят контрольный опыт, используя для приготовления раствора Б около 0,03 г (точная навеска) препарата. Процентное содержание митоксантрона гидрохлорида (X) в пересчете на сухое вещество находили по формуле: (VK-V) 0,02587 100 100 Х = , (g-gk) (100-W) где V,VK - объемы точно 0,1 митоксантрона гидрохлорида раствора натрия ацетата, израсходованные на титрование соответственно в основном и контрольном опытах, в миллилитрах; g,gk - навески испытуемого препарата соответственно в основном и контрольном опытах, в граммах; 0,02587 - титр 0,1 митоксантрона гидрохлорида раствора натрия ацетата по митоксантрона гидрохлориду, в граммах на миллилитр; W — потеря в массе при высушивании препарата, в процентах.
Примечание. Приготовление 0,05 М раствора натрия ацетата. 200 мл кислоты уксусной ледяной помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, в колбу порциями при перемешивании прибавляют 4,1 г предварительно растертого натрия ацетата безводного, перемешивают до растворения навески, доводят объем раствора до метки кислотой уксусной ледяной и перемешивают. Молярность полученного раствора устанавливают, используя его в качестве титранта, по 0,05 М раствору кислоты хлорной, взятому в объеме от 5 до 7 мл (полумикробюретка), с кристаллическим фиолетовым в качестве индикатора (ГФ XI, вып. 2, с. 62, второй способ). Титрование проводят до перехода окраски титруемого раствора из желтой в голубовато-зеленую.
Около 0,15 г препарата (точная навеска) растворяют в 50 мл воды, добавляют 0,3мл азотной кислоты разбавленной и титруют потенциометрически 0,1М раствором нитрата серебра с серебряным индикаторным электродом и стеклянным электродом сравнения. 1мл 0,1М раствора нитрата серебра соответствует 0,02587г C22H28O6N4 2НС1.
Значения содержания митоксантрона гидрохлорида в препарате в процентах в пересчете на сухое вещество, определенные по методу l(Xi) и по методу 2(Х2) должны удовлетворять условию 98,0% Xj 101,0% (при i=l и i=2).
По вышеописанной методике были исследованы синтезированные в ФГУП ГНЦ «НИОПИК» образцы митоксантрона гидрохлорида (см. приложение 3). Объективизацию данных о содержании митоксантрона гидрохлорида проводили с помощью комплексного анализа субстанции физическими и физико-химическими методами. Комплексный анализ образцов включал в себя элементный анализ по содержанию в субстанции азота, углерода, водорода, хлора общего и хлора ионного [90]; определялось содержание примесей методом ВЭЖХ; сравнение экспериментально найденного удельного показателя поглощения раствора митоксантрона гидрохлорида с показателем литературных данных, определялось содержание влаги в препарате титрованием по методу К. Фишера, потеря в массе при высушивании, зола (при 500С). Данные титриметрического анализа субстанции митоксантрона гидрохлорида по вышеописанной методике и данные комплексного анализа для некоторых серий представлены в таблице 4.3.
![Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс]](/i/i/4375/184827.png "Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс] Коновалов Андрей Александрович")