Содержание к диссертации
Введение
1. Место АЛС среди современных медицинских препаратов 10
2. Микробиологические показатели качества и безопасности АЛС 29
3. Валидация альтернативных методов 54
Собственные исследования 59
Глава 2. Материалы и методы. 59
Глава 3. Анализ качества АЛС по показателю «Микробиологическая чистота» в соответствии с предложенной классификацией. 68
3.1. Классификация АЛС 68
3.2. Анализ качества АЛС по показателю «Микробиологическая чистота» в соответствии с предложенной классификацией 74
Глава 4. Методические особенности проведения микробиологических исследований качества антисептических препаратов . 81
4.1. Определение антимикробного действия АЛС и способы его устранения .81
4.2. Определение бактерицидности, фунгицидности и спороцидности АЛС 92
4.3. Алгоритм испытания качества АЛС по показателю «Микробиологическая чистота» 97
4.4. Разработка и апробация метода испытания на отсутствие Candida albicans в интравагинальных АЛС 98
4.5. Испытание на отсутствие бактерий рода Salmonella 103
Глава 5. Микроорганизмы-контаминанты АЛС . 108
Глава 6. Обсуждение результатов. 114
Выводы 123
Список сокращений и условных обозначений 125
Список литературы
- Микробиологические показатели качества и безопасности АЛС
- Анализ качества АЛС по показателю «Микробиологическая чистота» в соответствии с предложенной классификацией
- Определение бактерицидности, фунгицидности и спороцидности АЛС
- Разработка и апробация метода испытания на отсутствие Candida albicans в интравагинальных АЛС
Введение к работе
Актуальность темы. Среди препаратов для наружного и местного применения выделяют антисептические лекарственные средства (АЛС). В целом, АЛС - это антимикробные лекарственные вещества для местного (наружного) применения при инфекционно-воспалительных заболеваниях слизистых оболочек, кожи, мягких тканей, полостей организма (Химическая энциклопедия, 1988). Способ применения АЛС зависит от локализации поражения, вида микроорганизма-возбудителя заболевания и т.д. Ассортимент антисептических препаратов, зарегистрированных на российском фармацевтическом рынке, постоянно пополняется новыми наименованиями и лекарственными формами (Государственный реестр лекарственных средств, 2012). Некоторые из АЛС включены в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств (ЖНВЛС).
Основными показателями качества и безопасности АЛС являются подлинность, количественное содержание действующего вещества, содержание посторонних примесей, микробиологическая чистота, а в ряде случаев - стерильность и антибактериальная активность (Государственная Фармакопея XII изд., 2007).
Отличительной особенностью антисептических препаратов является антимикробная активность, которая и обуславливает их применение. Однако с этим сопряжены и трудности, возникающие при анализе качества таких препаратов по микробиологическим показателям. Антимикробное действие некоторых АЛС невозможно устранить в условиях испытания по микробиологическим показателям методами, указанными в ГФ XII изд. В связи с этим встает вопрос для каждого конкретного лекарственного средства о необходимости включения соответствующих разделов в нормативную документацию, целесообразности испытания качества по данным показателям и достоверности получаемых результатов.
К настоящему времени имеются данные о выделении различных клинически значимых микроорганизмов из антисептических препаратов и
дезинфектантов, используемых в медицинской практике (Oie S. et al., 1996; Tswana Gajadhar, 2003; Yeom J.S., 2003; Салманов А.Г. и др., 2011). Известны случаи заболеваний новорожденных детей, вызванных использованием растворов хлоргексидина, контаминированных бактериями рода Chryseobacterium (Mehmet Ceyhan et al, 2011). Вероятно, контаминация АЛС в процессе производства и применения может быть обусловлена резистентностью микроорганизмов к определенным средствам. Как правило, риску подвержены препараты, обладающие невысокой антимикробной активностью. К ним относятся четвертичные аммониевые соединения, некоторые йодофоры, фенолсодержащие препараты, хлоргексидин (Салманов А.Г. и др., 2011).
Среди АЛС особое место занимают препараты интравагинального применения для лечения и профилактики различных инфекционно-воспалительных заболеваний женской мочеполовой сферы: бактериального вагиноза, аэробного вагинита и кандидозного вульвовагинита. Так, например, вульвовагинальный кандидоз традиционно занимает одно из ведущих мест в акушерско-гинекологической практике. Возбудителями кандидоза человека являются дрожжеподобные грибы рода Candida, насчитывающего около 190 видов. По данным международных исследований (PfallerM.A. etc., 2010), проводимых в 41 стране на протяжении 10 лет, 63% случаев возникновения вульвовагинального кандидоза вызваны C.albicans. Присутствие C.albicans в составе микрофлоры влагалища является достаточно распространенным, и любое нарушение местного или общего иммунитета может спровоцировать развитие заболевания, вызванного данным видом микроорганизмов. Наряду с этим, возможно и экзогенное инфицирование (Маянский А.Н. и др., 2003). Очевидно, что присутствие данного вида микроорганизмов в интравагинальных препаратах недопустимо. Однако в современной отечественной нормативной документации такое требование отсутствует.
В настоящее время в нормативной документации на отдельные АЛС наблюдается отсутствие стандартности требований и методик контроля
качества по микробиологическим показателям. При этом в большинстве случаев описание соответствующего раздела носит общий характер, что затрудняет проведение анализа.
Целью настоящего исследования является определение и стандартизация требований и методов, оптимизация проведения анализа качества АЛС по микробиологическим показателям.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительный анализ действующей нормативной документации, регламентирующей требования к качеству АЛС в различных формах выпуска и методы их контроля по микробиологическим показателям.
-
Разработать рабочий алгоритм (практическую схему) контроля качества различных форм выпуска АЛС по показателю «Микробиологическая чистота» и определить методические особенности этих испытаний.
-
Установить видовой состав микроорганизмов-контаминантов АЛС и охарактеризовать их биологические особенности.
-
Предложить целевой метод обнаружения Candida albicans в лекарственных средствах и оценить его эффективность в процессе практической работы.
Научная новизна.
На основании углубленного сравнительного информационно-аналитического исследования установлены характеристики АЛС, которые были положены в основу рабочей классификации, способствовавшей гармонизации исследований.
Впервые определены теоретические, экспериментальные и методические основы всесторонней оценки качества АЛС по показателю «Микробиологическая чистота». Предложенный подход представляет собой оптимальное сочетание методов и условий проведения испытания, обеспечивающего диагностическую информативность результатов.
Впервые в отечественной практике определены доминирующие микроорганизмы-контаминанты АЛС на стадии предрегистрационной
экспертизы качества. Установлен факт сохранения жизнеспособности выделенных микроорганизмов и их видовой спектр (Enterobacter cloacae, Chriseobacterium (Elizabethkingia) meningosepticum, Chriseobacterium indologenes).
Теоретическая и практическая значимость работы.
Разработан алгоритм испытания качества АЛС по показателю
«Микробиологическая чистота», основанный на комплексном изучении
свойств образца: антимикробного (бактериостатического и
фунгистатического) действия и способов его устранения, бактерицидности, фунгицидности, спороцидности препарата.
Проведены модификация и валидация метода диффузии в агар для определения бактерицидности ряда АЛС в рамках предложенного алгоритма.
Результаты проведенных исследований в виде усовершенствованной методики выделения бактерий рода Salmonella из лекарственных средств природного происхождения и разработанной методики выделения и идентификации C.albicans из интравагинальных препаратов включены в проект ОФС «Микробиологическая чистота».
Материалы диссертации внедрены и используются на фармацевтических предприятиях: ООО «Инфамед» (акт о внедрении исх. №11/1 от 01.04.2013), ООО «Вифитех» (акт о внедрении исх. №36-0 от 05.04.2013).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в Испытательном центре экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России в рамках комплексной темы «Научное обоснование методических подходов к экспертной оценке фармакопейных показателей и методов контроля качества лекарственных средств» (регистрационный номер 01201275290).
Апробация работы. Результаты и основные положения работы доложены на первой научно-практической конференции молодых ученых ФГБУ «НЦЭСМП» «Медико-социальные аспекты проведения экспертизы
качества, безопасности и эффективности лекарственных средств в условиях реформирования здравоохранения России» (г. Москва, 2012 г); тематических семинарах ФГБУ «НЦЭСМП» «Перспективы развития микробиологических методов анализа качества лекарственных средств в условиях GMP. Валидация/аттестация микробиологических методик» (г. Москва, март 2011 г, октябрь 2011 г, март 2012 г, октябрь 2012 г); всероссийской научной конференции с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (г. Санкт-Петербург, 2011 г); заседаниях секции медицинской и фармацевтической микробиологии московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г.Москва, 2011 г,2012 г); международной виртуальной интернет-конференции "Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы" (г. Казань, 2012 г); XVII, XVIII, XIX конгрессах «Человек и лекарство» (г.Москва, 2010 г, 2011 г, 2012 г); 67-ой региональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г.Пятигорск, 2012 г); IV Всероссийский научно-практический семинар молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск лекарственных средств» (г. Волгоград, 2012 г).
Положения, выносимые на защиту.
1. Фармакопейный показатель «Микробиологическая чистота» -
основная характеристика безопасности и качества АЛС.
2. Предложенный алгоритм, схему исследования и методы контроля
качества АЛС по показателю «Микробиологическая чистота» целесообразно
использовать как на стадии экспертизы качества, так и при разработке
нормативной документации на данную категорию препаратов.
-
Адаптированный и валидированный метод диффузии в агар позволяет in vitro установить бактерицидность препаратов хлоргексидина, йода, бриллиантового зеленого.
-
Предложенный диагностический комплекс микологических
методов выделения и идентификации позволяет достоверно выявить C.albicans как контаминант АЛС.
Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в постановке задач, выборе объектов изучения, теоретических изысканиях, проведении экспериментальных исследований, обобщении полученных данных и обсуждении результатов в научных публикациях. Автором разработан алгоритм испытания качества АЛС, изучена их микробиологическая чистота, модифицирован метод диффузии в агар для определения бактерицидности АЛС и проведена его валидация. Произведена статистическая обработка результатов (на основании соответствующей нормативной документации с помощью статистических программ Excel 7.0, Stastistica 6.0). Общий вклад в работу составляет 90%.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертация соответствует формуле специальности 14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют пунктам 2 и 3 паспорта специальности.
Публикации. Основное содержание работы представлено в 19 публикациях, среди них 5 статей в изданиях, рецензируемых ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 19 рисунков, включает введение, обзор литературы (глава 1), результаты собственных исследований (главы 2-5), обсуждение результатов (глава 6), выводы, список литературы, содержащий 139 библиографических источников, в том числе 72 иностранных, и приложения.
Микробиологические показатели качества и безопасности АЛС
При включении препаратов в Перечень ЖНВЛС одним из определяющих параметров является эффективность и доступность, а перед поступлением в аптеку должны быть доказаны его безопасность и соответствие качества установленным нормативным требованиям. Контроль качества ЛС проводится по многим показателям, среди которых выделяют «Стерильность» и «Микробиологическая чистота».
На стадии предрегистрационной экспертизы антисептических препаратов исследование по показателю «Микробиологическая чистота» подчас вызывает большие трудности. Это связано с тем, что АЛС обладают сильным антимикробным действием в условиях испытания, которое не всегда устранимо методами, описанными в Государственной фармакопее РФ XII изд. (ГФ XII изд.). С другой стороны, существуют данные о микробной контаминации различными бактериями и грибами некоторых антисептиков, включая хлоргексидин, спирт этиловый и т.д. [4; 6; 7]. Отсутствие стандартности требований к качеству АЛС по микробиологическим показателям, а также методические сложности, возникающие при их испытании, делают необходимым стандартизацию требований и методик анализа качества различных АЛС.
По данным Государственного реестра лекарственных средств, к концу 2012 г в России зарегистрировано более 18500 наименований лекарственных средств (ЛС). Среди них около 142 наименования Л С являются антисептическими [2]. Таким образом, количество АЛС среди общего числа препаратов, зарегистрированных в РФ, составляет приблизительно 1%. Несмотря на небольшую долю АЛС среди общего числа ЛС, антисептики представляют собой важный класс ЛС, использующихся во всех отраслях жизни.
Многие врачи древности независимо друг от друга пришли к выводу о необходимости обеззараживания ран. Термин «антисептика» впервые был предложен английским ученым И. Принглом в 1750 г. для обозначения противогнилостного действия минеральных кислот. В XIX веке этот термин распространили на мероприятия, проводимые для предупреждения послеродовых осложнений и нагноения ран [14].
Впервые Листер «признал кипящую воду лучшим антисептиком из всех существующих», и в своих ранних экспериментах это доказал [15]. Именно он вошёл в историю как основоположник антисептики, создав первый цельный, многокомпонентный способ борьбы с инфекцией. Венгерский врач-акушер И. Земмельвейс в 1847 г. ввел в практическую медицину антисептический метод обработки рук хлорной известью. Великие открытия XIX века в области микробиологии, связанные с именами Роберта Коха, Луи Пастера, включали множество исследований по выявлению антимикробной активности разных веществ. Н.И. Пирогов еще до 1852 г. применял при лечении ран повязки, пропитанные антисептическими веществами (азотнокислое серебро, сернокислый цинк, винный спирт и др.). Начало рациональной методике лечения ран положили Н.И. Пирогов, И. Земмельвейс. Именно такой метод, основанный на открытии Пастера о сущности гниения, в 1865 году окончательно сформулировал Джозеф Листер и опубликовал в журнале «Ланцет».
В последующие годы антисептика совершенствовалась и развивалась в рамках практической хирургии. Ассортимент противомикробных средств конца XIX века был довольно разнообразен: сулема, хлор, озон, йодоформ, ароматические соединения, хинин, марганцевокислое кали, перекись водорода и др. Однако, многие из них были довольно токсичны не только для микробов, но и для человека. Выявлены антибактериальные свойства фитонцидов, содержащихся в ряде растений (чеснок, лук, черёмуха, чёрная смородина, цитрусовые, хвойные деревья и др.) [14].
В настоящее время антисептика продолжает развиваться, список препаратов пополняется более действенными, но менее ядовитыми антисептическими средствами, обладающими бактерицидными и бактериостатическими свойствами, лишенными вредного влияния на организм человека.
В настоящее время ATC/DDD — это общепринятая система исследования использования ЛС в практике международного здравоохранения, это один из основных методологических инструментов проведения фармакоэпидемиологических исследований. ATC/DDD - методология, в свою очередь, предусматривает использование рекомендованных ВОЗ международных непатентованных наименований лекарственных средств. Оценка дозировок использования ЛС проводится с использованием DDD -методологии. Поскольку для получения достоверной информации об употреблении ЛС следует применять строгие методологические стандарты, возникла необходимость не только в наличии общепринятой международной классификационной системы, но и в универсальной единице измерения потребления ЛС. С этой целью была разработана специальная единица, получившая название «установленная суточная доз» (DDD) [16]. Как и всякая классификация, система АТС имеет свои преимущества и недостатки. Преимуществами являются унифицированное описание и сравнение стереотипов использования ЛС; объективная статистика использования медицинских препаратов; возможность сравнения учреждений здравоохранения, регионов и стран. Однако система ATC/DDD сама по себе не подходит для принятия решения о выборе препарата для лечения, оценки его эффективности или о его замене.
В соответствии с классификацией по системе ATC/DDD антисептики относятся к группам D08A - Дерматологические препараты. Антисептики и дезинфектанты, G01A - Гинекологические противоинфекционные препараты и антисептики.
Анализ качества АЛС по показателю «Микробиологическая чистота» в соответствии с предложенной классификацией
Известны способы, основанные на применении питательной среды с рН-индикатором, изменяющим цвет под влиянием метаболизма размножающихся бактерий. Учет результатов испытания основан на регистрации изменения цвета питательной среды после термостатирования смесей раствора дезинфектанта и взвеси бактерий, а также мутности в лунках пластины, куда вносят разведения препарата и бактериальную взвесь. Однако данная методика применима далеко не всегда, и для каждого конкретного средства следует учитывать ряд ограничений: рН и концентрацию самого средства, особенности выбранного тест-микроорганизма [95, 96].
Существуют различные модификации метода диффузии в агар для оценки активности антибиотиков. Один из них основан на использовании цилиндров для создания временного микрорезервуара на поверхности плотной питательной среды, куда вносят раствор антисептика или дезинфектанта и инокулят, а после экспозиции, удаления части жидкости и инактивации, цилиндры удаляют и распределяют оставшуюся смесь по поверхности агара. Эффективность оценивают по коэффициенту редукции [97]. Бондарев и др. измеряли антибактериальную активность дезинфектантов путем применения бумажных дисков, пропитанных препаратом [98]. Вышеуказанные альтернативные методики не всегда позволяют получить данные о бактерицидности препаратов и зачастую являются качественными тестами. В этой связи представляет интерес методика определения бактерицидности дезинфектантов, предложенная Аржаковым В.Н., Ермаковичем М.М., Аржаковым П.В. [99]. Препарат вносят в лунки, вырезанные в толще агара. Взвесь тест-микроорганизма вносят в определенном объеме в расплавленную питательную среду. Препарат считают бактерицидным, если диаметр зоны угнетения роста испытуемых культур составляет 20 мм и более (5 мм от края лунки). Разработанные методики находят широкое применение в медицинских учреждениях, ветеринарных клиниках и т.п. Они служат для определения эффективности дезинфектантов или устойчивости микроорганизмов и не всегда подходят для испытания свойств антисептических препаратов. Чтобы иметь возможности применять разработанные методики для определения бактерицидности антисептиков необходимо провести их оптимизацию, модификацию указанных способов и валидацию.
Таким образом, анализируя методы, представленные в отечественной и Европейской фармакопеях, можно заключить, что в целом наблюдается единый подход к процедурам выделения микроорганизмов из АЛС, относящихся к различным категориям. Наличие в зарубежных фармакопеях дополнительных требований и методов делает необходимым их разработку и внедрение в отечественную фармакопею или дополнения к ней.
Некоторые способы выделения и идентификации С.albicans (например, ПЦР) представляют собой довольно сложные диагностические методики, которые в настоящее время могут быть использованы в основном в научных целях.
Анализ нормативной документации на АЛС природного происхождения выявил необходимость стандартизации нормативных требований и методов определения антибактериальной активности.
Несмотря на существующее разнообразие утвержденных методик определения бактерицидности антисептиков и дезинфектантов, применяемые методы трудоемки, требуют большого объема питательных сред и больших временных затрат. С целью сокращения временных и трудозатрат разработан ряд альтернативных методов, которые служат для определения эффективности дезинфектантов или устойчивости микроорганизмов, однако не всегда подходят для исследования свойств антисептических препаратов. Чтобы иметь возможности применять разработанные методики при определении бактерицидности антисептиков необходимо провести их оптимизацию и валидацию. 3. Валидация альтернативных методов
Согласно ГОСТ Р ИСО 9000-2001, который соответствует интернациональному стандарту, валидация определена следующим образом:
Валидация - это подтверждение на основе представления объективных свидетельств того, что методы, предназначенные для конкретного использования или применения, выполнены, декларируемые свойства и характеристики подтверждаются, а поставленная цель достигнута [100].
Согласно определению Ассоциацией официальных аналитических химиков (АОАС) валидация альтернативной методики - демонстрация того, что обеспечена достаточная уверенность в том, что результаты, полученные с помощью альтернативной методики сравнимы с результатами, полученными с использованием референсного метода при помощи статистических критериев, содержащиеся в утвержденном валидационном протоколе [101].
Согласно определению международной конференции по гармонизации (ICH) цель валидации методики - показать, что она подходит для достижения той цели, для которой она предназначена [102].
FDA определяет валидацию как установленное документальное доказательство, которое обеспечивает высокую степень точности того, что конкретный процесс позволит получить продукт, удовлетворяющий своим предопределенным требованиям спецификации и обладающий характерными для него свойствами [103].
Возможность валидации метода, т.е. подтверждение его способности давать достоверные, воспроизводимые и проверяемые результаты в реальных условиях, может служить основным критерием выбора метода анализа (использование невалидированных методов микробиологического анализа, например, по данным инспекционных проверок FDA, является одним из существенных нарушений в работе контрольных лабораторий) [104].
Определение бактерицидности, фунгицидности и спороцидности АЛС
В соответствии с ГФ XII изд. определение антимикробного (бактериостатического и фунгистатического) действия ЛС проводят двумя методами: методом определения в условиях испытания микробиологической чистоты и методом репликаций. Для нейтрализации антимикробного действия препарата увеличивают разведение препарата, используют специфические и неспецифические инактиваторы, а также применяют метод мембранной фильтрации.
В настоящей работе проведено определение антимикробного действия в условиях испытания микробиологической чистоты ряда АЛС.
Установлено, что растворы спирта этилового 40%, 70%, 90%, 95%; препараты йода (йод, раствор 5% спиртовой, люголя раствор с глицерином, бетадин, йодинол) в условиях испытания по показателю «Микробиологическая чистота» (в разведении 1:10) не обладают антимикробным действием. Анализ проводят методом прямого посева разведения АЛС 1:10. Выявлено антимикробное действие препаратов хлоргексидина биглюконата с различными концентрациями действующего вещества.
Как видно, изучаемые образцы обладают значительным бактериостатическим действием в отношении S.aureus (разведение для нейтрализации - более чем 1:100) , в то время как действие препарата на остальные фармакопейные тест-микроорганизмы усиливается по мере увеличения концентрации раствора. Выявлена достаточно высокая резистентность P.aeruginosa к изучаемому антисептическому средству.
Методические сложности, возникающие при испытании качества препарата хлоргексидин, раствор 5%, связаны с помутнением раствора при разбавлении. В настоящей работе произведен подбор условий испытания микробиологической чистоты указанного АЛС. Установлено, что при использовании стерильной дистиллированной воды в качестве разбавителя раствор остается прозрачным. После разведения в дистиллированной воде полученный раствор переносили в нейтрализующую жидкость, после чего проводили мембранную фильтрацию образца с использованием 500 мл раствора натрия хлорида изотонического 0,9% в качестве промывной жидкости. Выполненная валидация показала, что данный способ позволяет нейтрализовать антимикробное действие исследуемого препарата.
С целью оценки влияния отдельных компонентов АЛС на различные виды микроорганизмов в настоящей работе выполнен факторный эксперимент, который позволил проанализировать совокупное антимикробное действие спирта этилового и хлоргексидина биглюконата. Данный вид эксперимента разрешает одновременный анализ ряда факторов на определяемый параметр. В настоящей работе в качестве исследуемых факторов были выбраны растворитель и вид микроорганизма, в качестве объектов - водный и спиртовой растворы хлоргексидина 0,5%. Определяемой характеристикой являлось антимикробное (бактериостатическое и фунгистатическое) действие в условиях определения микробиологической чистоты. В ходе исследования проводили сравнительную оценку влияния указанных препаратов, а также отдельных компонентов: хлоргексидина, субстанции-раствора 20%, спирта этилового, субстанции-раствора 95% и воды очищенной, - на ряд тест-микроорганизмов, описанных в ГФ XII изд. Результаты исследования представлены в таблице 16 в виде разведений АЛС, позволяющих нейтрализовать антимикробное действие. Если таковым является разведение 1:10, считают, что АЛС не обладает антимикробным действием в отношении исследуемого тест-микроорганизма.
Из полученных данных (таблица 16) видно, что использование спирта этилового в качестве растворителя не приводит к усилению антимикробного действия хлоргексидина в отношении дрожжевых и плесневых грибов. Напротив, на грамположительные спорообразующие палочки В.сегеш и грамотрицательные палочки P.aeruginosa спиртовой раствор хлоргексидина действует сильнее, чем водный. В случае с грамотрицательными палочками E.coli и грамположительными кокками S.aureus для нейтрализации антимикробного действия спиртового раствора требуется меньшее разведение, чем для нейтрализации влияния водного раствора. Таблица 16
Для испытания качества по показателю «Микробиологическая чистота» раствора АЛС, обладающего антимикробным действием применяли метод мембранной фильтрации, для чего в работе проводили подбор условий испытания препарата хлоргексидин-ферейн, раствор для наружного применения спиртовой 0,5%, методом мембранной фильтрации. В качестве промывной жидкости использовали раствор натрия хлорида 0,9% изотонический. Валидацию метода мембранной фильтрации проводили в соответствии с ГФ XII изд. путем внесения взвеси тест-микроорганизмов в концентрации не более 102 КОЕ/мл в последнюю порцию промывной жидкости. После фильтрации фильтр помещали на соответствующую агаризованную питательную среду. Для контроля проводили фильтрацию растворителя, содержащего взвесь клеток тест-штамма. Условия проведения анализа препарата хлоргексидин, раствор для наружного применения спиртовой 0,5%, тест-микроорганизм, используемый для контроля, а также полученные результаты представлены в таблице 17. 1 мл АЛС + 100 млнейтрализующей жидкости(ГФ XII изд., ОФС 42-0067-07,с.168).Количество промывнойжидкости натрия хлорида 0,9%:300 мл 65 ±3 1 мл АЛС + 10 мл нейтрализующей жидкости. Количество промывной жидкости натрия хлорида 0,9%: 300 мл 66 ±2 80 ±5 51 ±2 1мл АЛС + 10 мл нейтрализующей жидкости. Количество промывной жидкости натрия хлорида 0,9%: 500 мл 52 ±3 Таким образом, установлено, что для наиболее эффективной нейтрализации антимикробного действия исследуемого АЛС в качестве разбавителя необходимо использовать нейтрализующую жидкость (ГФ XII изд., ОФС 42-0067-07, с. 168). От количества промывной жидкости результат анализа не зависит. Важно отметить, что в ходе испытания микробиологической чистоты исследуемого препарата хлоргексидин, раствор для наружного применения спиртовой 0,5%, методом мембранной фильтрации после инактивации антимикробного действия с использованием нейтрализующей жидкости в качестве разбавителя удалось установить контаминацию образца грамположительными кокками в количестве, не превышающем установленную норму. Проведенная идентификация показала, что выделенным микроорганизмом является Staphylococcus hominis ssp hominis.
Метод мембранной фильтрации применим для испытания качества препаратов, растворимых в водных растворах или изопропилмиристате [3; 115]. Проведение мембранной фильтрации вызывает трудности в случае с препаратами бриллиантового зеленого. В ходе анализа нормативной документации выявлено отсутствие единого подхода к микробиологическому контролю качества препаратов бриллиантового зеленого: некоторые производители предлагают проводить испытание методом мембранной фильтрации, другие - действовать в соответствии с ГФ XII изд., указывая лишь категорию ЛС; другие нормативные документы не содержат этот раздел вовсе. В настоящей работе определяли антимикробное действие препаратов бриллиантовый зеленый, субстанция, бриллиантовый зеленый 1%, раствор для наружного применения спиртовой, бриллиантовый зеленый 2%, раствор для наружного применения спиртовой, методом репликаций (ГФ XII изд. ОФС 42-0067-07).
Разработка и апробация метода испытания на отсутствие Candida albicans в интравагинальных АЛС
Бриллиантовый зеленый - синтетический анилиновый краситель трифенилметанового ряда. Впервые был получен в 1879 году в Германии. Производится только синтетическим путем в виде солей бис-(пара-диэтиламино)-трифенилангидрокарбинола с различными анионами: оксалатом, сульфатом, основанием. В качестве лекарственного средства используют 1% или 2% спиртовой раствор оксалата (на 57% этаноле, реже - в виде водного раствора, от 0,1% до 2%, по прописи), также выпускается в виде карандаша, входит в состав других АЛС («Жидкость Новикова», «Мозольная жидкость») и питательных сред для микробиологии.
Как установлено в ходе настоящего исследования, субстанция бриллиантового зеленого обладает сильным антимикробным действием, которое невозможно нейтрализовать ни одним способом из указанных в ГФ XII изд. Проведен подбор условий испытания качества бриллиантового зеленого, растворов для наружного применения 1%, 2%, методом мембранной фильтрации. Выявлено, что исследуемые растворы обладают бактерицидностью в отношении исследованных тест-микроорганизмов (S. aureus, P.aeruginosa), но не обладают фунгицидными и спороцидными свойствами, что говорит о целесообразности проведения анализа по показателю «Микробиологическая чистота». Напротив, субстанция бриллиантового зеленого обладает бактерицидными, фунгицидными и спороцидными свойствами в отношении всех исследованных тест-микроорганизмов, что, наряду с методологическими сложностями, свидетельствует об отсутствии необходимости анализа качества данного АЛС по показателю «Микробиологическая чистота».
До настоящего времени не было выявлено ни одного случая несоответствия качества препаратов и субстанции бриллиантового зеленого нормативным требованиям по показателю «Микробиологическая чистота». Однако в средствах массовой информации встречались сообщения
Росздравнадзора «О поступлении информации о выявлении недоброкачественного ЛС» (Номер письма в 2012 г: 04И-484/12), в которых указывалось, что раствор бриллиантового зеленого не соответствовал требованиям по показателям «Количественное содержание» и «Упаковка» на стадии выборочного Государственного контроля.
В литературе описаны случаи контаминации растворов метиленового синего. Выявленными микроорганизмами являлись Pseudomonas aeruginosa [131], Mycobacterium chelonae [132; 133]. Контаминанированные растворы использовались в хирургии и служили причиной послеоперационных инфекций [131;135]. В настоящей работе также выявлена контаминация препарата Метиленовый синий, раствор для местного и наружного применения 1%, грамотрицательными бактериями Cupriavidus pauculus. Это подтверждает необходимость контроля микробиологического качества таких препаратов.
Йод используется в роли антисептического препарата более 100 лет. Он применяется в различных формах как антисептик для кожи, ран, для стерилизации хирургических инструментов и таких материалов как кетгут. Многочисленные соединения йода, применяющиеся в медицинской практике, можно разделить на 3 группы: 1. Препараты, действие которых обусловлено наличием свободного (элементарного) йода (спиртовые растворы йода, раствор Люголя, повидон-йод и т.п.); 2. Вещества, диссоциирующие с образованием йод-ионов (йодиды); 3. Органические соединения йода, в которых он прочно связан в молекуле (йодинол, амилойодид и др.). В ходе настоящей работы было выявлено, что препараты йода (йод, раствор 5% спиртовой, люголя раствор с глицерином, бетадин, йодинол) не обладают антимикробным действием в условиях испытания микробиологической чистоты (в разведении 1:10), что позволяет использовать для испытания таких образцов метод прямого посева. В литературных источниках встречаются упоминания о микробной контаминации препаратов на основе повидон-йода [123 - 126], однако в ходе проведенного в рамках настоящей работы анализа качества указанных АЛС в период 2009 120 2012 гг, таких случаев выявлено не было. Контроль качества субстанции йод кристаллический по показателю «Микробиологическая чистота» представляется невозможным в виду ее нерастворимости в водных растворителях. Такая методическая особенность обосновывает отсутствие указанного раздела в нормативной документации на АЛС.
На основании анализа нормативной документации, обобщения полученных результатов в настоящей работе разработан алгоритм проведения испытания АЛС по показателю «Микробиологическая чистота», позволяющий проводить выбор методики анализа на основании антимикробного (бактериостатического, фунгистатического), действия препарата, способов его устранения, бактерицидности, фунгицидности, спороцидности АЛС.
В соответствии с разработанным алгоритмом, определяющим этапом исследования является определение антимикробного (бактериостатического, фунгистатического) действия образца в условиях испытания по показателю «Микробиологическая чистота». К настоящему времени отечественными и зарубежными авторами показано, что даже препараты не антимикробной направленности (антибиотики и др.) могут обладать антимикробным действием в отношении некоторых тест-микроорганизмов, что обосновывает необходимость определения данной характеристики ЛС в ходе микробиологического испытания ЛС для снижения риска возникновения ложноотрицательных результатов [112; 113]. Для устранения антимикробного действия применяют специфические, неспецифические инактиваторы, специальную нейтрализующую жидкость, увеличивают количество разбавителя, проводят испытание методом мембранной фильтрации [3].
![Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс]](/i/i/4375/184827.png "Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс] Коновалов Андрей Александрович")
![Сравнительное изучение капсулированных препаратов циклоспорина А (контроль качества и терапевтический лекарственный мониторинг) [Электронный ресурс]](/i/i/4288/210981.png "Сравнительное изучение капсулированных препаратов циклоспорина А (контроль качества и терапевтический лекарственный мониторинг) [Электронный ресурс] Ледовских Мария Владимировна")