Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Физиологически активные полимеры на основе полисахаридов 8
1.2. Карбоксиалкильная схема модификации полисахаридов 10
1.3. Конструирование ФАП на основе аминокислот и полисахаридов... 18
1.3.1. ФАП «прививочного типа» содержащие аминокислоты, присоединенные ионными, водородными и координационными связями 19
1.3.2. Физиологически активные полимеры с ковалентними связями между полисахаридом и аминокислотой 20
1.4. Антибиотик-полисахаридные конъюгаты 29
1.4.1. ФАП «прививочного типа» с ионными, водородными и координационными связями 30
1.4.2. Физиологически активные полимеры с ковалентными связями между полисахаридом и антибиотиком 33
2. Обсуждение экспериментальных данных 42
2.1. Синтез карбоксиметилдекстрана, его эфиров, гидразидов и азидов... 45
2.1.1. Синтез карбоксиметилдекстрана 45
2.1.2. Синтез и исследование устойчивости этилового эфира карбоксиметилдекстрана 46
2.1.3. Синтез гидразидов карбоксиметилдекстрана 47
2.1.4. Синтез и исследование устойчивости азидов карбоксиметилдекстрана 48
2.2 Синтез карбоксиэтилдекстрана, его амидов, эфиров, гидразидов и азидов 51
2.2.1. Синтез амидов карбоксиэтилдекстрана 51
2.2.2. Синтез карбоксиэтилдекстрана 54
2.2.3. Синтез бензиловых эфиров карбоксиэтилдекстрана 55
2.2.4. Синтез гидразидов карбоксиэтилдекстрана 57
2.2.5. Синтез, исследование устойчивости и реакционной способности азидов карбоксиэтилдекстрана 63
2.3. Синтез декстран-аминокислотных конъюгатов. 71
2.3.1. Ацилирование аминокислот этиловым эфиром карбоксиметилдекстрана 73
2.3.2. Ацилирование аминокислот азидами карбоксиметилдекстрана.. 76
2.3.3. Ацилирование аминокислот азидами карбоксиэтилдекстрана... 79
2.3.4. Образование азометинов аминокислот с декстранполиальдегидом и карбоксиметилдекстрнполиальдегидом. 82
2.4. Синтез антибиотик-полисахаридных конъюгатов 90
2.4.1. Ацилирование 6-аминопенициллановой кислоты этиловым эфиром карбоксиметилдекстрана 91
2.4.2. Ацилирование антибиотиков азидами карбоксиметилдекстрана 94
2.5. Разработка методов анализа синтезированных веществ 97
2.5.1. Совершенствование методики спектрофотометрического анализа гидразидов и азидов карбоксиэтилдекстрана 97
2.5.2. Разработка методики количественного определения полисахаридов в исследуемых образцах 100
2.5.3. Спектрофотометрическое определение пенициллиновых антибиотиков 104
2.6. Исследование антивирусной активности производных декстрана 109
2.6.1. Изучение цитотоксического и противовирусного действия ремантадин - декстрановых конъюгатов 109
2.6.2. Изучение влияния модифицированного декстрана на биологическую активность вируса гриппа. 113
3. Экспериментальная часть 118
3.1. Приборы и материалы, используемые в исследовании 118
3.2. Химический синтез производных декстрана 119
3.3. Количественный анализ синтезированных производных декстрана 124
4. Выводы 138
5. Список литературы 140
Приложение
- Физиологически активные полимеры с ковалентними связями между полисахаридом и аминокислотой
- Синтез и исследование устойчивости азидов карбоксиметилдекстрана
- Совершенствование методики спектрофотометрического анализа гидразидов и азидов карбоксиэтилдекстрана
- Количественный анализ синтезированных производных декстрана
Физиологически активные полимеры с ковалентними связями между полисахаридом и аминокислотой
Известно, что полисахариды способны образовывать соли с биологически активными соединениями [4, 51], Однако наиболее полезный прием -одновременная фиксация двух и более биологически активных веществ, что позволяет добиться постепенного высвобождения активных компонентов.
Так, в работе [136] патентуется способ получения не растворимых в воде биосовместимых препаратов в виде пленок, гелей, волокон, основанный на смешении в водной среде более двух веществ: полианионный полисахарид, нуклеофильный реагент и активирующий агент (бензотиазол-1-илокси-трис-(диметилаино)-фосфоний гексафторфосфат и др.) при рН 3,5-8. Из полисахаридов используются декстран, карбоксиметилцеллюлоза, карбоксиме-тиламилоза, гиалуроновая кислота, а в качестве нуклеофилов - аминокислоты, амиды, пептиды, белки и др. Данные препараты предлагается использовать при восстановлении организма в послеоперационный период.
Использование одновременной фиксации на полисахаридной матрице аминокислот и веществ, обладающих антибиотической, противовоспалительной и болеутоляющей активностью дало возможность разработать лекарственные формы, повышающие биодоступность лекарственных веществ. Их применение позволяет достичь в крови высоких концентраций активных ингредиентов, не вызывая побочных явлений [135]. В качестве матриц использовали альгиновую кислоту, полиамиды, производные целлюлозы.
В качестве носителя аминокислоты — гистидина — может использоваться целлюлоза. В работе [119] описано получение пористых гранул целлюлозы с последующей адсорбцией на ней аминокислоты, изучена зависимость адсорбции от температуры, времени и рН.
В синтезе ФАП очень широко применяют полисахаридальдегиды (ПА), полученные периодатным окислением полисахаридов. В литературе описаны реакции ПА с веществами, содержащими аминогруппу, в результате которых лекарственные вещества присоединяются к полимеру легко гидро-лизующейся азометиновой связью. Для образования более прочных связей БАВ с полисахаридом азометиновые связи обычно восстанавливают боргид-ридом или цианборгидридом натрия [105, 118, 141]. В зависимости от условий реакции одна или обе группы могут взаимодействовать с аминами с образованием альдиминов [
Полисахаридальдегиды используются для модификации самых различных соединений, содержащих амино- или гидразидную группу, в том числе аминокислот. Производные у-аминомасляной кислоты (ГАМК) с диальде-гидцекстраном получали при рН 7, используя натриевую соль ГАМК. Для повышения стабильности продуктов реакции азометиновую связь в ряде опытов восстанавливали бор гидридом натрия. Степень превращения альдегидных групп в азометиновые составила от 40 до 83% [131].
Восстановление азометиновой связи для повышения стабильности продуктов использовали также в работе [140] по модификации диальдегиддекст-рана избытком соли или метилового эфира а- и ю-аминокислот (фенилала-нин, амин ал он, гамма-аминовалериановая кислота, глутатион).
Авторы работы [21] также модифицировали диальдегиддекстраном у аминомасляную кислоту и ее производные - бутиловый эфир, N никотиноил-у-аминомасляную кислоту. Так, присоединением у аминомасляной кислоты к диальдегиддекстрану, были получены производные с азометиновой связью [21]. Исходные вещества обладали действием на центральную нервную систему. При сравнительном фармакологическом изучении N-никотиноил-у-аминомасляной кислоты и ее декстранового производного было показано, что они обладают примерно равной активностью. Авторы объясняют это слишком быстрым отщеплением кислоты от полимера в организме.
Водорастворимые карбоксиметилазометиновые производные целлюлозы были получены взаимодействием оксицеллюлозы с содержанием окисленных групп не более 20% с растворимыми в воде или органических растворителях аминосоединениями (сс-аминоянтарная кислота и др. аминокис 22 лоты) до получения азометиновых производных и последующим карбокси-метилированием, обработкой монохлоруксусной кислотой [68]. Реакция с аминосоединениями проводилась при 97-100С, 3 часа, при молярном соотношении аминосоединения и альдегидных групп.
Детальное исследование реакции диальдегиддекстрана с глицином показало, что полисахарид реагирует с аминокислотами очень быстро. Повышение температуры и рН реакционной среды ускоряли реакцию. Хотя продукт был устойчив во время гель-фильтрации, используемой для удаления несвязанного глицина, азометиновая связь легко разрушалась при действии 0.3 М НС1. Среди протестированных аминокислот наиболее реакционными оказались гистидин и глицин, а лизин и аргинин проявили меньшую активность в реакции с ДАД [127].
Полимеры с активированными группами для фиксации аминокислот (аргинин, глицин, аспарагиновая кислота) получали [134] на основе диальдегиддекстрана, выдерживая полисахарид в 0,1% растворе соляной кислоты, содержащем аминокислоту при 75С.
Препарат «Поликапран» представляет собой окисленную оксидом азота (IV) целлюлозу, модифицированную s-аминокапроновой кислотой, и является гемостатиком полифункционального действия. Поликапран вызывает стойкий гемостатический эффект, способен рассасываться в тканях организма человека в течение 20-30 дней [19, 87].
Аиилирование аминокислот полисахаридами обычно состоит из двух стадий: активации полисахарида и взаимодействия активированного полимера с аминокислотой. Способность аминокислот подвергаться ацилированию во многом определяется нуклеофильностью аминогрупп, стерическими факторами и ацилирующей способностью производных карбоновых кислот RCOX, которая в свою очередь определяется стабильностью аниона X.
Для ацилирования аминокислот лучше всего использовать производные полисахаридов, которые содержат такие группы, как хлорангидриды, ангидриды, активированные эфиры и т.д. Общие механизмы реакций ацилиро 23 вания карбоновыми кислотами и различными их производными изучены достаточно хорошо [7,13, 14, 21, 50, 91, 92].
Синтез и исследование устойчивости азидов карбоксиметилдекстрана
Для определения влияния порядка загрузки реагентов при ацилирова-нии аминов АзКМД на выход целевого продукта, были проведены 2 опыта: в одном сначала доводили рН раствора азида до оптимального значения, а затем добавлялся бензиламин, а во втором, наоборот, сначала добавлялся амин и затем доводился рН среды до 8. Анализ показал, что в первом случае с амином прореагировало 32% азидных групп КМД, а во втором — 98%. Это подтверждает результаты, полученные при исследовании устойчивости водных растворов азидов.
Уменьшение числа азидных групп в КМД в водных растворах может быть результатом либо гидролиза их до карбоновых кислот, либо перегруппировки с образованием изоцианатов и продуктов гидролиза изоцианатов. Для выяснения этого водные растворы азида КМД (Ска = 0.65, Сазка = 0.27, общая степень замещения 0.92) выдерживали 24 часа при рН 2 и 10 (температура 20С) и 1 час при температуре 40С до отрицательной реакции на наличие азидных групп. После выделения полисахаридных образцов и определения числа карбоксильных групп кондуктометрическим титрованием, оказалось, что их Ска = 0.94 и практически совпала с общей степенью замещения исходного образца. Полученные результаты подтверждают наше предположение о гидролизе азидных групп КМД в водных растворах.
Таким образом, - синтезированы образцы натриевых солей, этиловых эфиров и гидра-зидов карбоксиметилдекстрана со степенью карбоксиметилирования от 0.74 до 1.6, содержанием сложноэфирных групп 0.37-0.70 и содержанием гидра-зидных групп 0.36-0.70 моль на моносахаридное звено полимера, пригодные для дальнейшей модификации полисахарида; - азиды КМД при 20 С наиболее устойчивы в кислых средах, при использовании их в щелочных и нейтральных средах рационально понижать температуру до 0С и загружать амин до создания нужного рН. Карбоксиэтильная схема модификации полисахаридов мало изучена. Вместе с тем, удлинение "вставки" между полисахаридом и карбоксильной группой может повысить доступность активного фрагмента и эффективность действия биополимера. Поэтому нашими задачами были: а) поиск новых и совершенствование уже известных методов синтеза производных карбоксиэтилдекстрана (КЭД); б) исследование свойств и устойчивости некоторых из них; в) использование их для синтеза ФАП. Декстран (I) алкилировали избытком акриламидом в 3-10% водном растворе NaOH, при 40С 3-4 часа. Условия реакции меняли с целью получения образцов АКЭД с различным соотношением амидных и карбоксильных групп. Реакционную массу диализовали для очистки от низкомолекулярных примесей и продукт реакции осаждали этанолом после концентрирования раствора в вакууме. Чистоту АКЭД (VIII) контролировали методом ТСХ. В ИК спектрах образцов АКЭД (VIII) в натриевой форме наблюдается полоса поглощения карбоксилат-аниона v (COO") при 1580 см 1, а также полосы поглощения при 1660-1670 см 1, характерные для v (С=0) "амид I", от 52 сутствующие в спектре исходного декстрана (приложение 4). В ИК спектрах образцов АКЭД (VIII) в Н-форме наблюдаются полоса поглощения при 1720 см"1, характерная для валентных колебаний v (С=0) карбоксильной группы, а также при 1670 и 1580 см"1, характерные для v (С=0) "амид I" и 5 (N-H) "амид II" (приложение 4). Число амидных групп в полимере определяли спектрофотометриче-ским методом [11], количество карбоксильных групп определяли объемным и кондуктометрическим титрованием. Амиды КЭД характеризовали по степени аминокарбонилалкилирова-ния Сака (число амидных групп, приходящихся на монозвено полисахарида), степени карбоксиалкилирования Ска, а также определяли общую степень замещения С3 = Сак:1+Ска. Результаты анализа синтезированных образцов АКЭД приведены в таблице 2.2.1. Относительная погрешность в определении степеней замещения (Скаи С а) не превышает 5 отн%. Ранее [11] было показано, что при периодатном окислении образцов КЭД и АКЭД с различной степенью замещения уменьшение расхода окислителя по сравнению с окислением декстрана происходит строго эквивалентно числу карбоксиэтильных (аминокарбонилэтильных) групп, введенных в полисахарид. На основе полученных результатов было сделано предположение, что сополимеризация при получении АКЭД не идет, и, при условии равномерного распределения заместителей по полимерной цепи, алкилирование декстра-на акриламидом идет в положение С2-0 или/и С4-0, но не в С3-0. Нами проведено исследование распределения заместителей в КЭД методом спектроскопии ЯМР13С в ДМСО на спектрофотометре «Bruker» АМ-500. Положение заместителей в монозвене полисахарида определяли по смещению сигналов в спектре КЭД по сравнению со спектром исходного декстра-на (приложение 5, 6). где -смещение сигнала углерода, обусловленное алкилированием связанного с ним гидроксила, - смещение сигнала углерода, обусловленное алкилированием гидроксила соседнего атома углерода. Известно, что алкилирование гидроксидной группы пиранозного кольца ведет к смещению сигналов как непосредственно связанного с ней углеродного атома на 7-Ю млн. долей в сторону больших величин, так и соседних -на 1-4 млн. доли в сторону меньших величин. При неполном замещении по атому углерода в спектре наблюдаются также исходные пики. Анализ полученных ЯМР спектров показал, что реакция алкилирования в данном случае протекает с малой селективностью и идет по положениям С2-0, С3-О и С4-0 в равных количествах, причем могут быть звенья, содер жащие заместители по трем положениям, по двум, по одному и вообще не содержащие заместителей (таблица 2.2.2). Таким образом, - для последующих синтезов наработаны образцы АКЭД (Сака от 0.33 до 1.08); - при взаимодействии декстрана с акриламидом в водных растворах щелочи все гидроксильные группы моносахаридного звена (в положениях С , С3 и С4) алкилируются приблизительно в равной степени, и в полимерной цепи карбоксиэтильные группы располагаются неравномерно.
Совершенствование методики спектрофотометрического анализа гидразидов и азидов карбоксиэтилдекстрана
Для определения влияния заместителей в бензольном кольце на скорость взаимодействия ароматического амина с азидом КЭД, мы использовали анилины, имеющие в пара-положении электронодонорные (метальную и этокси группы) и электроноакцепторные (нитро группу и бром) заместители. Ацилирование аминов азидами КЭД вели, как описано выше для анилина. Степень амидирования определяли УФ-спектрометрически, для каждого из N-ацил производных аминов по своему калибровочному графику
При исследовании ацилирующей способности азидов КЭД в реакциях с ароматическими аминами было показано, что наибольшее влияние на полноту превращения азидных групп в амидные оказывает основность амина и рН раствора. Как видно из графика 2.2.6 и таблицы 2.2.11 для каждого амина существует свое оптимальное значение рН реакционной среды. Это, вероятно, связано не только с влиянием концентрации протонов на количество нук-леофила в реакционной массе и электрофильность ацильной группы, но и с различной растворимостью аминов в воде.
При этом зависимость Сш от констант заместителей тп в уравнении Гаммета носит линейный характер: Сш = -57.728а„ + 52.927 (n=5, R2 = 0.9786) (рис. 2.2.9). В связи с тем, что карбоксиэтильные группы в процессе химических реакций могут отщепляться от полимера, мы проделали следующий опыт. Образец КЭД (Ска 1.03) превратили в гидразид, затем в азид и в N-бензиламид КЭД. Полученный амид гидролизовали щелочью и образовавшийся образец КЭД титровали кондуктометрически Оказалось, что Ска полученного образца 0.98, что на 4.8% меньше исходной. Следовательно, в процессе синтеза амидов КЭД по предлагаемой нами схеме отщепление кар-боксиэтильных групп от декстрана практически не происходит. Таким образом: - устойчивость азидов КЭД резко уменьшается при повышении рН их растворов и в течение 2 часов мало зависит от времени и температуры в пределах от 0 до 20С. - для каждого амина в реакции с азидом КЭД существует оптимальное значение рН среды, при котором достигается максимальная степень превращения азидов в амиды. Между оптимальными значениями рН и рКя ароматических аминов существует линейная зависимость. -степень амидирования азидов КЭД возрастает с увеличением рА а ароматического амина и линейно зависит от значений ст„-констант Гаммета. Существующие методы [63] синтеза полисахарид-аминокислотных конъюгатов недостаточно изучены, сложны и не всегда позволяют получать ФАП с заданными характеристиками. В связи с этим нашими задачами были поиск новых и совершенствование уже известных методов синтеза декстран-аминокислотных конъюгатов с необходимым содержанием аминокислот, в которых аминокислоты связаны с полимером разными по прочности химическими связями. С этой целью нами исследованы реакции аминокислот с этиловым эфиром и азидом КМД и азидом КЭД, а также с декстранполиальдегидами. Продукты реакции амиды и азометины осаждали этанолом и переосаждали из 0,1 н. раствора NaOH или воды и сушили в вакууме (20-25 мм рт. ст.) при 61 С. Отсутствие низкомолекулярных примесей в синтезированных веществах определяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Замещенные амиды карбоксиметил- и карбоксиэтилдекстрана и азометины представляют собой белые или белые с желтоватым оттенком аморфные порошки, хорошо растворимые в воде, нерастворимые в спирте, ацетоне, эфире и большинстве других органических растворителей. В ИК спектрах натриевых солей производных карбоксиалкилдекстрана наблюдаются полосы поглощения при 1580 и 1600 см"1, характерные для кар-боксилат-иона, уширенные за счет вклада карбоксилат иона аминокислоты. В спектрах Н4"- форм этих веществ имеются полосы при 1530-1540 и 1640-1675 см 1, отсутствующие в спектрах исходных веществ и характерные для 5(N-H) "амид II" и v(C=0) "амид I ", и полосы поглощения при 1720-1740 см"1, характерные для карбоксильных групп декстрана и аминокислот. В спектрах полученных соединений также наблюдаются полосы поглощения при 840-890 см 1, характерные для ароматических циклов исходных аминокислот (приложение 18 - 26). В ИК спектрах полученных азометинов были обнаружены полосы поглощения 1640-1660 см 1 характерные для v «C=N» При модификации декстрана аминокислотами, содержащими ароматические кольца, очень удобным методом качественного и количественного анализа продуктов реакции оказалась УФ спектроскопия, поскольку спектры водных растворов N-замещенных амидов карбоксиметилдекстрана, азометинов и самих аминокислот одинаковы (табл.2.3.1), а полисахарид в этой области УФ спектра не поглощает (приложение 27-31). Количественно амиды КМД и КЭД характеризовали степенью амино-карбонилалкилирования Сака» а реакцию ацилирования - расчетом степени амидирования Ст. Значения Сака рассчитывали по данным элементного анализа и УФ спектрометрии. Ранее было показано, что этиловый эфир КМД хорошо ацилирует алифатические и ароматические амины [37], поэтому нами исследована реакция ЭЭКМД с аминокислотами, которая в синтезе декстран-аминокислотных конъюгатов практически не применялась. Для определения условий реакций, позволяющих связывать с полисахаридом заданное количество аминокислот, исследовали зависимость Сш от соотношения реагентов, времени и температуры реакции, используя аминокислоты, часто применяющиеся для синтеза лекарственных веществ. Как и предполагалось, этиловый эфир КМД ацилирует аминокислоты, но с а-аминокарбоновыми кислотами в воде и в этаноле ЭЭКМД реагирует хуже, чем с другими аминокислотами (табл. 2.3.2).
Этот факт, вероятно, можно объяснить, во-первых, большим влиянием карбоксильной группы в а-аминокислотах на нуклеофильность аминогруппы и её доступность для ацилирующего агента, чем в других аминокислотах, а во-вторых, физико-химическими свойствами аминокислот, которые плохо или вообще не растворяются в воде и большинстве органических растворителей. Добавление оснований в реакционную массу для растворения субстрата в воде вызывает гидролиз сложного эфира КМД, который идет быстрее, чем реакция ацилирования. В связи с этим ЭЭКМД в водных средах практически не ацилирует триптофан, который плохо растворяется даже в растворах щелочей, и плохо реагирует с Р-фенил-а-аланином, растворимость которого несколько лучше, чем у триптофана. То же наблюдается и в среде этанола, в котором ЭЭКМД плохо ацилирует а-аминокислоты, независимо от их растворимости в спирте.
Лизин и є-аминокапроновая кислота растворяются в воде при рН 7-8 и реагируют с ЭЭКМД приблизительно так же, как алифатические амины. Степени амидирования ЭЭКМД в реакциях с этими аминокислотами также приблизительно одинаковы, причем в реакциях с лизином она несколько больше. Это позволило предположить, что в молекуле лизина преимущественно реагирует Е-аминогруппа, но при этом нельзя исключать и ацилирование а-аминогруппы. Увеличение времени ацилирования аминокислот в воде не повышает значение Сад, т.к. не вступившие в реакцию с аминокислотой слож-ноэфирные группы КМД гидролизуются.
Количественный анализ синтезированных производных декстрана
- При ацилировании а-аминокислот азидами КМД и КЭД для каждой кислоты существует оптимальное значение рН, при котором достигается максимальная С, при этом азиды КЭД реагируют при более высоких значениях рН среды и несколько хуже, чем азиды КМД, однако возможность увеличения времени реакции позволяет достигать сравнимые значения Сш азидов КМД и КЭД.
Целый ряд широко применяемых в настоящее время антибиотиков представляют собой аминокислоты, т.е. соединения, содержащие карбоксильную и аминогруппы (антибиотики группы пенициллина и цефалоспори-нов, леворин и др.) В связи с этим нашей задачей было исследовать возможность применения разработанных методов модификации декстрана аминокислотами для синтеза антибиотик - пол исахаридных конъюгатов.
С этой целью нами исследованы реакции 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК) и амоксициллина с этиловым эфиром и азидом КМД. Синтезированные антибиотик-декстрановые конъюгаты представляют собой белые или белые с желтоватым оттенком аморфные порошки, хорошо растворимые в воде, нерастворимые в спирте, ацетоне, эфире и большинстве других органических растворителей.
В ИК спектрах натриевых солей полученных соединений, содержащих 6-АПК, наблюдается полоса поглощения при 1600 см"1, характерная для кар-боксилат-иона, которая затрудняет обнаружение и идентификацию амидных групп, и полоса при 1740-1750 см"1, характерная для v "С=0" четырехчленного лактамного цикла. В спектрах ІҐ - форм этих веществ имеются полосы поглощения при 1530 и 1640-1650 см"1, отсутствующие в спектрах исходных веществ и характерные для 5(N-H) "амид II" и v(C=0) "амид I ", а также полоса поглощения при 1730-1740 см 1, характерная для v "С=0" карбоксильной группы и v "С=0" четырехчленного лактамного цикла 6-АПК. В ИК спектрах продуктов реакции с амоксициллином видны полосы поглощения при 840 см"1, характерные для v "С=С" ароматического цикла.
Количественно конъюгаты и реакцию ацилирования антибиотиков характеризовали так же, как и в случае амидов КМД: степенью аминокарбони-лалкилирования Стш и степенью амидирования Сш. Значения Сшкй рассчитывали по данным элементного анализа и спектрофотометрического метода, основанного на гидроксамовой реакции, предложенного и разработанного нами для анализа пенициллиновых антибиотиков. Первый метод дает возможность определить общее число аминокарбонилметильных групп в полисахариде, а второй - число молекул активного антибиотика, сохранивших р-лактамные циклы. щелочей, поэтому нами изучено влияние концентрации растворов ТЭА, загружаемого в реакционную массу для растворения аминокислоты, на стабильность лактамного цикла (табл. 2.4.1, рис. 2.4.1),
Установлено, что в случае пятикратного избытка ТЭА через 1 час сохраняется лишь 52% Р-лактамных циклов, при уменьшении избытка ТЭА до 2,5 моль - 82%. Концентрация ТЭА 1,5 моль на моль 6-АПК оказалось недостаточным для её растворения, и реакционная масса в данном случае была гетерогенная, чем и объясняется низкий процент разрушенных Р-лактамных циклов. Поэтому оптимальными условиями реакции являются: 2 моль ТЭА и 0С, при которых за 1 час разрушилось лишь 8% р-лактамных циклов.
Приблизительно такие же результаты получены при ацилировании 6-АПК ЭЭКМД в воде в присутствии ТЭА (табл.2.4.2). Наименьшая степень разрушения 6-АПК наблюдается при 2-кратном избытке ТЭА (9%) и 0С. Однако выбранные условия не позволяют ввести в молекулу декстрана более, чем 0.1-0,2 моль 6-АПК на моносахаридный фрагмент.
Аминогруппа в 6-АПК более доступна для нуклеофила, чем в а-аминокарбоновых кислотах, поэтому ацилирование её в водных растворах (табл. 2.4.2) идет легче, чем ос-аминокислот. Так, при ацилировании фенилаланина в аналогичных условиях Сш не превысила 30%, а в случае 6-АПК Сам достигает 60%. Не смотря на это, ацилирование 6-АПК идет значительно труднее, чем первичных алифатических аминов. При этом нет возможности увеличить время реакции, т.к. разрушается антибиотик и гидролизуется ЭЭКМД. По тем же причинам нельзя повысить реакционную способность нуклеофила за счет добавления большого избытка основания, т.к. при этом резко возрастают скорости этих двух побочных процессов. - Ска=0.97, CMKa=0.66, продукт, содержащий ковалентно- и ионносвязанный антибиотик.
Действительно, при ацилировании 6-АПК ЭЭКМД в этаноле при нагревании значения С возросли до 75 - 84%, однако р-лактамный цикл в этих условиях раскрывается практически также, как в воде.
В ходе исследования было обнаружено, что число Р-лактамных циклов в синтезируемом ФАП сильно зависит от процедуры очистки его от ионо-связанного БАВ. Эффективность модификации полисахарида возрастает во много раз, если получать конъюгаты, содержащие ковалентно- и ио несвязанный антибиотик. Так, ацилированием б-АПК ЭЭКМД (20С, этанол, 24 часа) без переосаждения из водного раствора щелочи был получен продукт, содержащий 1.17 моль 6-АПК на моль монозвена полисахарида, при этом 6-АПК практически на 100% сохранила свою структуру.
