Введение к работе
Актуальность темы. В результате проведенных ранее исследований (Данилец М.Г. и др., 2009; Данилец М.Г. и др., 2010) было показано, что полисахаридные комплексы (ПСК), выделенные из надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила, листьев мать-и-мачехи, обладают иммуномодулирующими свойствами, стимулируя выработку оксида азота и подавляя аргиназу, что является наиболее выгодной комбинацией для регуляции иммунного ответа. Исходя из этого, полисахариды (ПС) указанных растений могут быть использованы в лечении хронических, вялотекущих инфекционных заболеваний, а также при иммунотерапии онкологических заболеваний. Кроме того, указанные ПСК могут являться основой создания препаратов для профилактики и лечения аллергических (иммуноглобулин Е-зависимых) заболеваний (Лигачева А.А. и др., 2008).
Наряду с этим известно, что иммуномодулирующая активность ПС во многом обусловлена особенностями их химической структуры (особенностями строения основной и боковых цепей, конформацией мономеров и ЗО-структурой макромолекул, способностью к образованию димеров и агрегатов) и широким диапазоном молекулярных масс (Termeer С. et al., 2000, 2002; Марков П.А. и др., 2010; Попов СВ., 2010).
Таким образом, изучение химической структуры ПС лекарственных растений Сибири, обладающих иммуномодулирующими свойствами, установление связи между структурой и активностью ПС и разработка методик их стандартизации является актуальным направлением исследований.
Цели и задачи исследования. Цель работы - на основании результатов изучения структуры и иммуномодулирующих свойств полисахаридов листьев мать-и-мачехи установить биологически активные компоненты и разработать параметры их стандартизации.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Обосновать выбор перспективного объекта исследования на основе сравнительной характеристики полисахаридных комплексов высших растений, обладающих иммуномодулирующей активностью.
-
Выделить индивидуальные компоненты из перспективного объекта исследования - полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи и изучить их химическую структуру.
-
Провести сравнительное исследование иммуномодулирующей активности индивидуальных компонентов полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи.
4. Разработать параметры стандартизации полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи для проекта ФСП «Полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи».
Научная новизна. Впервые охарактеризованы полисахаридные комплексы листьев мать-и-мачехи, надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила по компонентному составу, их молекулярной массе и содержанию уроновых кислот. Выявлено, что:
полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи содержит 26,37±0,09% уроновых кислот и состоит из 5 основных компонентов с молекулярными массами: 590 кДа (8,06%), 415 кДа (8,6%), 338 кДа (20,43%), 82 кДа (38,17%), 20 кДа (24,73%);
полисахаридный комплекс надземной части клевера лугового содержит 74,64±0,07% уроновых кислот и состоит из 5 компонентов с молекулярными массами: 720 кДа (12,94%), 620 кДа (12,94%), 320 кДа (38,83%), 35 кДа (19,42%), 20 кДа (15,86%);
полисахаридный комплекс корневищ и корней девясила содержит 51,75±0,13% уроновых кислот и состоит из 5 компонентов с молекулярными массами: 620 кДа (17,16%), 490 кДа (17,16%), 280 кДа (62,4%), 50 кДа (1,72%), 10 кДа (1,56%).
Впервые установлена структура индивидуально выделенных компонентов полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи, являющихся нейтральными (3 компонента) и кислыми полисахаридами (2 компонента):
нейтральные полисахариды -
-
а-В-галакто-(1,4)-сс-0-глюкан, содержащий фрагменты арабиногалактана с разветвлениями, состоящими из остатков a-L-рамнопиранозы, a-L-арабинофуранозы и маннопиранозы (молекулярная масса 590 кДа);
-
а-В-галакто-(1,4)-а-В-глкжан, содержащий фрагменты арабиногалактана с разветвлениями, состоящими из остатков a-L-рамнопиранозы, a-L-арабинофуранозы и P-D-ксилопиранозы (молекулярная масса 415 кДа);
-
cc-D-ranaKTo-(l,4)-ct-D-nnoKaH, содержащий фрагменты арабиногалактана с разветвлениями из остатков a-L-рамнопиранозы, a-L-арабинофуранозы, P-D-ксилопиранозы и маннопиранозы (молекулярная масса 338 кДа).
кислые полисахариды -
-
а(1,2)і-рамно-а(1,4)-В-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, галактозы и глюкозы (молекулярная масса 82 кДа);
-
а(1,2)^-рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, глюкозы и галактозы (молекулярная масса 20 кДа).
Впервые проведено изучение влияния индивидуальных компонентов полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей. Показано, что NO-стимулирующей активностью обладают следующие кислые полисахариды:
а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, глюкозы и галактозы (молекулярная масса 20 кДа, уроновых кислот - 57,69±0,03%);
ос(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-В-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, глюкозы и галактозы (молекулярная масса 82 кДа, уроновых кислот - 5,02±0,03%).
Практическая значимость. Установленная химическая структура и иммуномодулирующая активность ПС листьев мать-и-мачехи дают основание для их дальнейшего исследования с целью разработки на их основе новых лекарственных средств, предназначенных для терапии аллергических заболеваний, хронических и вялотекущих инфекционных заболеваний, а также для иммунотерапии онкологических заболеваний.
Полученные экспериментальные данные позволили обосновать аналитические подходы к стандартизации биологически активных ПС листьев мать-и-мачехи. Разработана валидированная методика количественного определения кислых ПС в ПСК листьев мать-и-мачехи.
На основании проведенного исследования разработан проект фармакопейной статьи предприятия «Полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи».
Внедрение. Результаты исследований включены в учебное пособие «Методы количественного определения поли- и олигосахаридов», которое внедрено в научно-исследовательский и учебный процесс кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития России и в учебный процесс кафедры фармации ФПК и ППС ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России. На основании результатов диссертационной работы разработаны методические рекомендации «Методика количественного определения кислых полисахаридов в лекарственном растительном сырье и полисахаридных комплексах», которые внедрены в научно-исследовательский процесс Лаборатории инновационных фармацевтических технологий ЦНИЛ ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России и в научный и учебный процесс кафедры фармацевтической химии ГБОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития России.
Разработанная методика количественного определения кислых ПС в ПСК листьев мать-и-мачехи, включенная в проект ФСП «Полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи», апробирована (акт апробации от 05.05.2010 г.) и внедрена (акт о внедрении от 18.05.2010) в контрольно-аналитической лаборатории Центра по сертификации и контролю качества лекарственных средств Томской области.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Результаты скрининговых исследований полисахаридных комплексов листьев мать-и-мачехи, надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила и выбор перспективного объекта исследования - полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи.
-
Результаты исследований по выделению, идентификации и установлению структуры полисахаридов листьев мать-и-мачехи.
-
Результаты изучения иммуномодулирующей активности полисахаридов листьев мать-и-мачехи.
-
Результаты разработки параметров стандартизации полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи.
Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармации ФПК и ППС и Лаборатории инновационных фармацевтических технологий ЦНИЛ ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России и комплексной целевой программой СО АМН Российской федерации «Разработка инновационных технологий новых фармацевтических продуктов на основе природных биологически активных комплексов» (№ государственной регистрации 0121152362).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на X Межрегиональной научно-практической фармацевтической конференции «Современные траектории развития фармацевтической практики» (Новосибирск, 2010); международной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 2010); Российской научно-практической конференции «Создание лекарственных средств на основе продуктов природного происхождения» (Пермь, 2010); 66-ой региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2011); XII научно-практической конференции «Молодежь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2011); юбилейной научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 60-летию работы Новокузнецкого ГИУВа в Кузбассе «Медицина XXI века» (Новокузнецк, 2011); XIV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2011); XII Российском конгрессе молодых ученых с международным участием «Науки о человеке» (Томск, 2011); X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2011); 69-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2011); XIX Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине,
биологии, фармакологии и экологии New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology IT+M&E» (Украина, Крым, Гурзуф, 2011); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Ученые Урала и Сибири - развитию отечественной фармации: от синтеза до инновационных лекарственных средств» (Новосибирск, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 6 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, выводов, списка литературы и трех приложений. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 33 рисунками. Библиографический указатель включает 244 источника литературы, из них 152-зарубежных.
