Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Современное состояние исследований лекарственных растений, содержащих тимол 12
1.1.1 Ботаническая характеристика тимолсодержащих лекарственных растений 12
1.1.1.1. Душица обыкновенная 12
1.1.1.2. Тимьян обыкновенный 13
1.1.1.3. Тимьян ползучий (чабрец) 15
1.1.1.4. Монарда дудчатая 16
1.1.1.5. Ажгон душистый 18
1.1.2. Химический состав тимолсодержащих лекарственных растений 19
1.1.3. Биологическая активность эфирных масел тимолсодержащих лекарственных растений 27
1.1.4. Опыт применения тимолсодержащих растений в народной и научной медицине 33
1.2. Характеристика ферментов высших растений 37
1.2.1. Полифенолоксидаза высших растений 37
1.2.2. Малатдегидрогеназа высших растений 39
1.2.3. Лактатдегидрогеназа высших растений 42
Глава 2. Объекты и методы исследования 44
2.1. Объекты исследования 44
2.2. Методы исследования 44
2.2.1. Методы фитохимического анализа 44
2.2.2. Методы биохимического анализа 48
2.2.3. Методы микробиологического анализа 52
Глава 3. Исследование химического состава и антимикробной активности травы и эфирного масла монарды дудчатой, культивируемой в самарской области 53
3.1. Изучение компонентного состава биологически активных веществ травы монарды дудчатой, культивируемой в Самарской области 53
3.2. Изучение компонентного состава и антимикробной активности эфирного масла травы монарды дудчатой, культивируемой в Самарской области 58
Глава 4. Разработка методик качественного анализа тимолсодержащих растений семейства яснотковых . 68
Глава 5. Разработка товароведческих показателей сырья «монарды дудчатой трава», культивируемая в самарской области 76
Глава 6. Определение активности пфо тимолсодержащих растений семейства яснотковых по фазам вегетации 84
Глава 7. Изучение фракционного состава белков и мф дегидрогеназ в различные фазы вегетации тимолсодержащих растений семейства яснотковых 87
Общие выводы 95
Список литературы 97
Приложение 120
- Характеристика ферментов высших растений
- Методы исследования
- Изучение компонентного состава и антимикробной активности эфирного масла травы монарды дудчатой, культивируемой в Самарской области
- Разработка методик качественного анализа тимолсодержащих растений семейства яснотковых
Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время, несмотря на увеличение числа препаратов, полученных синтетическим путем, в медицинской практике всё большую популярность приобретают лекарственные средства растительного происхождения. До 40 % всех лекарственных препаратов, применяемых в современной медицине, получают из растительного материала.
По своей фармакологической активности фитопрепараты не уступают своим синтетическим аналогам, в то же время благодаря сбалансированному комплексу биологически активных веществ они благоприятно действуют на организм человека, практически без побочных эффектов.
В научной медицине нашли значительное применение эфиромасличные растения. Среди них большой интерес представляют растения семейства Яснотковых и Сельдерейных: тимьян обыкновенный, тимьян ползучий, душица обыкновенная, ажгон душистый и другие, в состав которых входит тимол, карвакрол, цимол, борнеол, гераниол и другие ароматические и терпеноидные соединения.
Эти вещества определяют широкий спектр фармакологического действия эфирных масел. Имеется огромный практический опыт использования ряда препаратов, содержащих эфирные масла. Их применяют для лечения заболеваний дыхательных путей, неврозов и почечно-каменной болезни, т.к. эфирные масла, входящие в их состав, оказывают противовоспалительный, антибактериальный, фунгицидный, потогонный, спазмолитический и мочегонный эффекты.
Несмотря на богатство флоры Российской Федерации, ресурсы лекарственного растительного сырья (ЛРС) не безграничны, к тому же некоторые лекарственные растения имеют ограниченный ареал. В связи с этим возникла необходимость изыскания таких видов растений; которые обладают высокой биологической активностью, и могут выращиваться в условиях, отличных от условий исторической родины.
До недавнего времени в нашей стране имелись промышленные запасы таких растений, как тимьян обыкновенный и ажгон душистый. Эти эфиромасличные растения оказывают отхаркивающий и противомикробный эффекты.
Однако в настоящее время промышленные плантации тимьяна обыкновенного и ажгона душистого находятся в СНГ. В этой связи возникает необходимость расширения сырьевой базы в России путем культивирования тимьяна обыкновенного или ажгона душистого, либо путем возделывания другого растения, обладающего таким же фармакологическим эффектом.
Таким требованиям удовлетворяет монарда дудчатая, имеющая ареал в Северной Америке. В условиях России этот вид культивируется в европейской части страны и в Сибири. Учеными Никитского ботанического сада была показана перспективность использования данного растения в медицинской практике в качестве антимикробного средства [74,75]. Сотрудниками кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии экспериментально было доказано, что монарда может культивироваться в условиях Самарской области.
Этот вид дает высокий выход эфирного масла, которое обладает бактерицидной, антибиотической активностью, иммуномодулирующими свойствами. Эфирное масло используется для ингаляций при заболеваниях верхних дыхательных путей [20, 74, 75].
Применение ЛРС при лечении различных заболеваний определяет повышенные требования к его качеству.
Одной из актуальных проблем современной фармации является анализ ЛРС. Стандартизация лекарственных средств растительного происхождения имеет свои особенности, связанные со сложным составом биологически активных веществ.
В связи с этим становится актуальным исследование не только химического состава, но и биохимических характеристик ЛРС, в частности, изучение состава и динамики активности терминального фермента гликолиза
7 лактатдегидрогеназы (L-лактат: NAD-оксидоредуктаза, 1.1.1.27, ЛДГ), ключевого фермента цикла трикарбоновых кислот малатдегидрогеназы (L- малат: NAD-оксидоредуктаза, 1.1.1.37, МДГ) и фракций белка по фазам вегетации, а также полифенолоксидазы (op/wo-дифенол: Ог-оксидоредуктаза;
КФ 1.10.3.1.), фермента, ответственного за накопление и окисление фенольных соединений в лекарственных растениях.
Государственная фармакопея СССР XI издания предлагает для стандартизации многих видов ЛРС, в т. ч. «Трава чабреца», «Трава душицы обыкновенной», следующие параметры: внешние признаки, микроскопия и ряд числовых показателей, в частности, содержание экстрактивных веществ, эфирного масла, влажность, количество золы общей и другие.. Для стандартизации исследуемого ЛРС выше названных параметров недостаточно.
Одними из перспективных методов стандартизации ЛРС являются хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ), колоночная хроматография, газожидкостная хроматография (ГЖХ), позволяющие объективно решать проблему идентификации сырья и фитопрепаратов, но также дающие полную комплексную оценку подлинности и качества сырья.
Экспериментальное обоснование и рекомендация некоторых из выше перечисленных методов для стандартизации ЛРС также является актуальной задачей данного исследования.
Цель работы: фитохимическое и биохимическое исследование травы монарды дудчатой {Monarda jlstulosa L.), выращенной в условиях Самарской области; сравнительное изучение полученных параметров качественного состава биологически активных соединений травы монарды дудчатой и официнальных тимолсодержащих видов сырья семейства Яснотковых (трава душицы обыкновенной - Herba Origani vulgaris и трава чабреца - Herba Serpylli).
Для достижения поставленной цели предстояло решать следующие конкретные задачи:
1. Исследовать состав биологически активных соединений (БАС) эфирного масла травы монарды дудчатой.
Определить товароведческие показатели для сырья «Монарды дудчатой трава».
Составить пояснительную записку и проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) травы монарды дудчатой, выращенной в условиях Самарской области.
Научно обосновать целесообразность создания новых лекарственных средств на основе травы монарды дудчатой - настойка и эфирное масло.
Определить антимикробную активность эфирного масла, водных и водно-спиртовых извлечений травы монарды дудчатой.
Разработать методику качественного анализа тимола в траве душицы обыкновенной и траве чабреца.
Изучить динамику фракционного состава белков и возможность применения полученной информации для идентификации лекарственных растений в различные периоды развития.
Исследовать активность полифенолоксидазы (ПФО) ЛРС по фазам вегетации.
Определить состав и динамику активности молекулярных форм (МФ) малатдегидрогеназы (МДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) исследуемого ЛРС по фазам вегетации.
Научная новизна.
Впервые разработан проект ФСП на новый вид ЛРС «Монарды дудчатой трава» - {НегЪа Monarda fistulosae).
Впервые выделено эфирное масло из травы монарды дудчатой, культивированной в Самарской области.
Впервые проведена газожидкостная хроматография (ГЖХ) фракций и эфирного масла травы монарды дудчатой.
В сравнительном плане определена антимикробная активность эфирного масла, водных и водно-спиртовых извлечений травы монарды дудчатой.
Впервые выделен и идентифицирован тимол из травы монарды дудчатой, культивированной в Самарской области.
Разработана методика качественного анализа для доказательства подлинности травы душицы обыкновенной и травы чабреца по содержанию тимола в ЛРС с использованием рабочего стандартного образца (РСО) тимола.
Для установления периода вегетации предлагается использовать определение активности ПФО йодометрическим методом.
Для изучения динамики фракционного состава белков и активности МФ лактат- и малатдегидрогеназы в сырье душицы обыкновенной, чабреца, монарды дудчатой в целях определения периодов вегетации предлагается использовать метод электрофореза в полиакриламидном геле.
Практическая значимость.
В результате проведенных исследований разработаны: проект ФСП на лекарственное растительное сырье «Монарды дудчатой трава» методика качественного анализа травы душицы обыкновенной с использованием РСО тимола. методика качественного анализа травы чабреца с использованием РСО тимола. методика определения периодов вегетации высушенного ЛРС по динамике фракционного состава белков и активности ПФО, МФ ЛДГ и
МДГ душицы обыкновенной, чабреца, монарды дудчатой.
На защиту выносятся: результаты исследования по разработке проекта ФСП на ЛРС «Монарды дудчатой трава».
10 результаты исследования химического состава эфирного масла травы монарды дудчатой, выращенной в условиях Самарской области. данные исследований по разработке методик качественного анализа
БАС травы душицы обыкновенной, чабреца. результаты исследований по разработке методики определения сроков вегетации высушенного ЛРС.
Апробация диссертации.
Основные положения работы докладывались в течение 2000-2003 г.г. на 8 научных конференциях, в частности, научной конференции молодых исследователей «Аспирантские чтения» (Самара, 2001, 2002); 68-й итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2002); 58-й межрегиональной конференции по фармации и фармакологии: «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2003).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в Самарском государственном медицинском университете в соответствии с. планом научно-исследовательских работ (№ государственной регистрации 01200109135 и договор № 10/02 от 28 мая 2002 г. - заказчик ЗАО «Самарская фармацевтическая фабрика») и соответствует тематике Проблемной комиссии по фармации № 36.08 РАМН, МЗ РФ.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 23 таблицы, 15 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов и списка литературы, включающего 210 источников, из которых 72 на иностранных языках.
Характеристика ферментов высших растений
Другой функцией полифенолоксидазы является защитная [92, 139, 147, 152, 172, 176, 191]. Повышенная активность полифенолоксидазы приводит к более легкому течению заболевания и повышению сопротивляемости растения различным болезням. Полифенолоксидаза широко распространена в растениях. Она локализуется в хлоропластах, митохондриях и клеточном соке клеток растений. Так, связанная с хлоропластами фенолоксидаза была найдена в листьях свеклы [158]. В листьях чая активность полифенолоксидазы была обнаружена в цитозоле и хлоропластах [78]. Полифенолоксидаза содержит в своем составе медь. Содержание меди в очищенных препаратах полифенолоксидазы составляет около 0,2 %, причем в свежеприготовленных препаратах фермента медь содержится в основном в восстановленном виде. Если каким-либо образом связать медь фермент инактивируется. Молекулярная масса полифенолоксидазы колеблется в пределах 50 000 - 400 000 Да. В молекуле полифенолоксидазы может находиться два активных центра: монофенолоксидазный и полифенолоксидазный [65, 200]. Из листьев Vanilla planifolia (Andr.) выделена полифенолоксидаза, которая обладала монофенолазной активностью, но в то же время оказывала влияние на дифенолы [154]. Полифенолоксидаза травы эхинацеи пурпурной ЕсЫпасеае purpurea является только дифенолазой [175]. Установлено, что этот фермент может существовать в виде одной и нескольких МФ [163,177, 178,179,180, 188,205].
Так, в плодах двух разных видов ежевики была выявлена только 1 МФ фермента [162], в кожице банана Musa sapentum L., в листьях и плодах кофе Coffea arabica L. были обнаружены 2 МФ [181, 205,206], в листьях китайской капусты Brassica тара L., в семенах Duranta plumieri были найдены З МФ фермента [185, 193]. Ряд исследователей определили, что спектр МФ фермента может меняться в процессе вегетации растения [85,90]. Существует несколько методов определения активности полифенолоксидазы, например, манометрический метод, при котором измеряется количество кислорода, потребляемого на окисление пирокатехина. Кроме манометрического, применяются также методы, основанные на определение непосредственных или вторичных продуктов окисления, катализируемого полифенолоксидазой. Это такие методы как перманганатный и йодометрический методы. Предложен также колорометрический метод определения полифенолоксидазы [65, 66, 67]. Активность полифенолоксидазы связана с возрастным состоянием растительной ткани. В период наиболее интенсивной синтетической деятельности клеток наблюдается наивысшая активность полифенолоксидазы. С увеличением возраста растения имеет место падение активности полифенолоксидазы [81,138,149,164]. При изучении относительной активности полифенолоксидазы сахарного тростника Saccharum officinarum Var. в процессе вегетации обнаружено, что активность полифенолоксидазы была высока в ранней стадии развития, несколько ниже в процессе созревания, и затем оставалась относительно постоянной в конце зрелости [189]. Таким образом, информация об относительной активности полифенолоксидазы может быть использована для определения сроков вегетации ЛРС. Малатдегидрогеназа (L-малат: NAD-оксидоредуктаза, 1.1.1.37, МДГ) участвует в цикле трикарбоновых кислот и катализирует обратимую реакцию окисления яблочной кислоты [54]. МДГ представляет собой мультифункциональный фермент. Он имеет практически универсальное распространение среди живых организмов, встречается в клетках подавляющего большинства представителей бактериальных, а также в тканях всех животных и растительных организмов [129,132, 133,204]. МДГ представлена в клетках различных организмов- в виде множественных молекулярных форм, число которых варьирует в зависимости от групповой принадлежности живых существ, от их образа жизни и от сложности метаболизма [106]. В клетках прокариотов, где внутреннее содержимое разделено на отдельные компоненты, число изоформ МДГ является минимальным. Таким образом, например, в клетках Escherichia coli обнаружена лишь одна МФ МДГ [182]. При переходе к эукариотическому типу организации происходит пространственное и временное разделение транскрипции и трансляции, и, как следствие — разобщение отдельных метаболических процессов, что ведет к возрастанию общего числа изоформ МДГ внутри клетки. В клетках низших эукариотов, например Aspergillus niger и Aspergillus oryzae, обнаруживаются лишь два изофермента МДГ, имеющих соответственно цитоплазматическую и митохондриальную локализации [177]. Вместе с тем усложнение структуры и функций органов и способов размножения многоклеточных животных приводит к возрастанию генетической вариабельности изоферментного спектра МДГ. Однако при этом в их клетках присутствуют лишь молекулярные формы МДГ, имеющие митохондриальную и цитоплазматическую локализации [112, 130, 132,133].
Методы исследования
Высушенной и измельченной травы монарды дудчатой заливали 70 мл этилового спирта и оставляли в закрытой колбе на 7 суток при периодическом помешивании. По прошествии данного времени, вытяжку сливали, сырье отжимали с помощью пресса, промывали этиловым спиртом и снова отжимали. Полученные вытяжки объединяли и доводили объем до 50 мл этанолом. Метод перколяции. 10,0 г высушенной и измельченной травы монарды дудчатой заливали 10 мл этилового спирта и оставляли для набухания на 4 - 6 ч. Набухшее сырье загружали в перколятор и заливали экстрагентом до «уровня зеркала» при закрытом кране перколятора. Сырье оставляли на 24 ч. По прошествии суток края перколятора открывали и сливали извлечение со скоростью 1/24 от рабочего объема перколятора в минуту. Затем сырье промывали экстрагентом до получения нужного объема настойки. Для тонкослойно-хроматографического анализа извлечений из растительного сырья использовали готовые пластинки «Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ» (Россия) и «Силуфол УФ-254» (Чехословакия). Хроматографирование проводили при температуре 18-20 С. Фронт прохождения растворителя 8 - 9 см (сорбфил) и 12 - 13 см (силуфол). Хроматографический анализ выполняли с использованием следующих систем растворителей: 1. хлороформ : этанол -2:1; 2. хлороформ : этанол — 4:1; 3. хлороформ : этанол -6:1; 4. хлороформ : этанол -9:1; 5. хлороформ : метанол : вода-26:14:3. В качестве рабочего стандартного образца (РСО) использовали чистый тимол (ТУ 6-09-3736-79). Детекцию веществ осуществляли просмотром хроматограмм в УФ-свете (360 и 254 нм) и проявляли раствором диазобензолсульфокислоты (ДСК). Разделение компонентов эфирного масла проводили с помощью метода жидкостной адсорбционной колоночной хроматографии. Элюирование проводили гексаном, хлороформом, гексанохлороформными смесями. Приготовление колонки: В химический стакан помещали 6,0 силикагеля L 40/100 и 15 мл гексана, перемешивали стеклянной палочкой до вытеснения пузырьков воздуха. Полученную таким образом взвесь переливали в колонку хроматографическую и формировали слой сорбента, высотой около 1,5 см. В выпарительную чашку отвешивали 5,0 силикагеля L 40/100, на который помещали 3 мл эфирного масла и перемешивали стеклянной палочкой. Порошок эфирного масла с силикагелем из выпарительной чашки равномерно высыпали в слой гексана, не нарушая сформированного столба сорбента.
Сверху в хроматографическую колонку помещали небольшой тампон ваты. Для идентификации основных компонентов эфирного масла использовали газожидкостную хроматографию, ЯМР-спектроскопию. В качестве неподвижных фаз использовали жидкости различной полярности (неполярная неподвижная фаза - Apiezon L; полярная неподвижная фаза - Carbowax 20М), нанесенные на хроматон со степенью пропитки 15 %. Для ввода проб использовался хроматографический шприц "Газохром-ІОІ". Время удерживания фиксировалось с помощью секундомера. На хроматографическое поведение карвакрола и тимола на неподвижных фазах (НФ) различной полярности в значительной степени влияет наличие в их молекулах двух функциональных групп: гидроксильной и ароматического углеводородного фрагмента. Очевидно, что в зависимости от природы неподвижной жидкости основной вклад в удерживании сорбатов будет вносить та или иная функциональная группа. На неполярной НФ - Apiezon L - определять характер межмолекулярного взаимодействия в системе "сорбат — сорбент" будет ароматический углеводородный фрагмент сорбатов. Однако в этом случае добиться удовлетворительного разделения изомерных карвакрола и тимола достаточно сложно, поскольку углеводородные фрагменты их молекул имеют очень близкие топологические, структурные и физико-химические характеристики. Тем не менее, нами в работе проведено разделение этих компонентов и их идентификация с помощью вещества сравнения (тимол) и построенной сорбционно-структурной корреляции (карвакрол).
Изучение компонентного состава и антимикробной активности эфирного масла травы монарды дудчатой, культивируемой в Самарской области
По литературным данным, содержание эфирного масла в траве монарды дудчатой достигает до 3 % в период массового цветения.
Эфирное масло получали перегонкой с водяным паром. Средний выход составил 2,84 ±0,14 %.
Содержание эфирного масла в объёмно-весовых процентах (X) в пересчете на абсолютное сухое сырье вычисляли по формуле:
Высокое содержание эфирного масла в траве монарды дудчатой делает вид перспективным для дальнейшего изучения и применения в медицинской практике. В качестве новой лекарственной формы возможно использование эфирного масла травы монарды дудчатой.
Разделение компонентов эфирного масла монарды дудчатой проводили с помощью метода жидкостной адсорбционной колоночной хроматографии. Элюирование проводили гексаном, хлороформом, гексано-хлороформными смесями.
В плоскодонных колбах с притертыми пробками готовили 100 мл элюентной смеси гексан - хлороформ (90:10) и 50 мл элюентной смеси гексан - хлороформ (80:20).
Далее открывали кран хроматографической колонки и элюировали гексаном, собирая 2 фракции объемом 50 мл каждая, скорость элюирования около 1,5 — 2 мл/мин, затем элюировали смесями гесан - хлороформ, собирая фракции объемом 50 мл каждая. Далее в колонку приливали хлороформ порциями по 20 - 30 мл и собирали 12 фракций по 10 мл каждая.
Полученные фракции упаривали до объема равного 2,0 - 2,5 мл в колбе на роторном испарителе, в состав которого входят водяная баня, обратный холодильник и сборник отгона.
Фракции анализировали методом ТСХ на пластинках «Силуфол УФ -254» в хроматографической камере в системе хлороформ : метанол : вода (26:14:3). Проявляли хроматограммы в УФ-свете при 254 и 360 нм и с помощью диазобензолсульфокислоты. Полученные результаты представлены на рис. 5. Как видно из рисунка, во фракциях № 1, 2, 3, 4 и в эфирном масле содержится тимол, проявляющийся под действием диазобензолсульфокислоты в виде ярко оранжевого пятна с Rf =0,63. РСО 0,5 % раствор тимола.
Благодаря высокой точности и универсальности ГЖХ данный метод занимает ведущее место в анализе биологически активных веществ. В частности, мы использовали ГЖХ для анализа масла монарды дудчатой.
Хроматограмма ГЖХ анализа эфирного масла травы монарды дудчатой представлена на рис. 6. Было найдено 11 компонентов, из которых идентифицировано два соединения, отвечающие за проявляемый фармакологический эффект: 2-изопропил-5-метилфенол (тимол) и 5-изопропил-2-метилфенол (карвакрол).
По методике ГЖХ проводили анализ фракций, полученных адсорбционной жидкостной хроматографией эфирного масла (см. выше).
Результаты, представленные на рис. 7, свидетельствуют, что во фракции № 1, полученной элюированием гексаном, доминирует тимол, а карвакрол практически не обнаруживается, во фракции № 2 и 3, элюированных смесями данных растворителей (хлороформ : гексан - 1:9; 1:4 соответственно) резко уменьшается количество тимола и возрастает содержание карвакрола. Фракция № 4 содержит практически только карвакрол, что соответствует данным, полученным нами ранее при ГЖХ анализе эфирного масла, вопреки утверждениям ряда исследователей о доминирующем содержании тимола [20, 31, 46, 47, 48, 161, 162]. Однако некоторые авторы говорят о возможности большего содержания карвакрола [79].
На кафедре микробиологии Самарского государственного медицинского университета была изучена антимикробная активность фракций эфирного масла монарды, полученных адсорбционной колоночной хроматографией и тимола в отношении золотистого стафилококка и кишечной палочки методом бумажных дисков. Данные показали, что наименьшей активностью обладает фракция 1, где тимол доминирует. При увеличении содержания карвакрола (фракция №2 и 3) антибактериальная активность увеличивается и превышает активность тимола, как жидкого, так и кристаллического (табл.4).
Разработка методик качественного анализа тимолсодержащих растений семейства яснотковых
При разработке методик качественного анализа душицы обыкновенной, чабреца и монарды дудчатой за основу были взяты подходы к стандартизации, которые позволяют объективно оценить качество сырья и позволяют отличить данные объекты от других видов ЛРС. С целью определения подлинности травы душицы обыкновенной, тимьяна ползучего и монарды дудчатой разработана методика ТСХ-анализа данных видов растений. Объектами исследования служили образцы водных и водно-спиртовых извлечений, полученные из надземной части вышеперечисленных растений. В качестве экстрагента использовали воду очищенную и 70% этиловый спирт. Для получения извлечений брали по 1,0 г высушенной и измельченной травы растений, помещали сырье в колбу емкостью 30 мл, заливали 10 мл экстрагента и экстрагировали с обратным холодильником в течение 20 мин на кипящей водяной бане. Для качественной идентификации ЛРС применяли ТСХ. В извлечении травы монарды обнаружили тимол (под действием реактива пятно окрашивается в ярко-оранжевый цвет), в извлечениях травы душицы и травы чабреца тимол не обнаружен (рис.9 и 10). Методика определения подлинности травы монарды дудчатой. В колбу на 30 мл помещают 1,0 г высушенной травы монарды дудчатой, заливают 10 мл 70 % спирта и экстрагируют с обратным холодильником в течение 20 мин на кипящей водяной бане, фильтруют. Далее наносят на стартовую линию хроматографической пластинки 10 мкл фильтрата и 4 мкл 0,5 % раствора РСО тимола и затем хроматографируют восходящим способом.
После того, как фронт растворителя пройдет около 8 см, хроматограмму извлекают и высушивают на воздухе при комнатной температуре для удаления запаха растворителей, просматривают в УФ — свете (254 нм) и проявляют раствором диазобензолсульфокислоты. На хроматограмме анализируемого извлечения на уровне РСО тимола должно обнаруживаться пятно оранжевого цвета с величиной Rf около 0,9; допускается наличие других пятен. Методика определения подлинности травы душицы обыкновенной и травы чабреца. В колбу на 30 мл помещают 1,0 г сырья, заливают 10 мл 70 % спирта и экстрагируют с обратным холодильником в течение 20 мин на кипящей водяной бане, фильтруют. Полученный фильтрат (около 5 мл) помещают в делительную воронку на 30 мл, добавляют 1 мл хлороформа, взбалтывают, отделяют слой хлороформа. Наносят на стартовую линию хроматографической пластинки 30 мкл раствора хлороформного извлечения фильтрата и 4 мкл 0,5% раствора РСО тимола и затем хроматографируют восходящим способом. После того, как фронт растворителя пройдет около 8 см, хроматограмму извлекают и высушивают на воздухе при комнатной температуре для удаления запаха растворителей, просматривают в УФ — свете (254 нм) и проявляют раствором диазобензолсульфокислоты. На хроматограмме анализируемого извлечения на уровне РСО тимола должно обнаруживаться пятно оранжевого цвета с величиной Rf около 0,9; допускается наличие других пятен.
