Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние проблемы загрязнения лекарственных растений, сырья и фитопрепаратов экотоксикантами 15
1.1. Некоторые аспекты проблемы оценки качества лекарственного растительного сырья по содержанию тяжелых металлов 16
1.2. Оценка качества фитопрепаратов по содержанию тяжелых металлов 29
1.3. Содержание пестицидов в сырье лекарственных расте-ний 31
1.4. Оценка качества фитопрепаратов по содержанию пестицидов 35
Резюме 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Общая характеристика района исследования 37
2.2. Объекты исследования 39
2.3. Методы анализа 48
2.3.1. Методы определения тяжелых металлов 49
2.3.2. Методы определения хлорорганических пестицидов и по-лихлорбифенилов при их совместном присутствии 52
2.3.3. Методы фармакогностического анализа 58
2.4. Статистическая обработка результатов исследования 58
ГЛАВА 3. Содержание экотоксикантов в почвах района исследований 59
3.1. Оценка содержания тяжелых металлов в почвах 60
3.2. Оценка содержания хлорорганических пестицидов и по- лихлорбифенилов в почвах 63
Резюме 64
ГЛАВА 4. Оценка содержания тяжелых металлов в лекарственном растительном сырье 66
4.1. Содержание эссенциальных и условно эссенциальных элементов - металлов (Fe, Со, Си, Zn, Mn, Cr, Ni) 67
4.2. Содержание потенциально токсичных металлов (Cs,Sr) 78
4.3. Содержание токсичных металлов (Pb, Cd, Hg, Be, Al) 82
4.4. Сравнительная оценка содержания тяжелых металлов в лекарственном сырье, относящемся к разным морфологическим группам 91
Резюме 96
ГЛАВА 5. Оценка содержания хлорорганических пестицидов и поли-хлорбифенилов в лекарственном растительном сырье ...97
5.1. Содержание гексахлорциклогексана и его изомеров 97
5.2. Содержание ДДТ и его метаболитов 100
5.3. Содержание гексахлорбензола 105
5.4. Содержание полихлорбифенилов 108
5.5. Сравнительный анализ содержания хлорорганических пестицидов и полихлорбифенилов в лекарственном растительном сырье разных морфологических групп 111
Резюме 116
ГЛАВА 6. Оценка содержания тяжелых металлов в фитопрепаратах 118
6.1. Содержание эссенциальных и условно эссенциальных элементов - металлов (Fe, Со, Си, Zn, Mn, Cr, Ni) 118
6.1.1. Настои и отвары 118
6.1.2. Жидкие экстракты и настойки 134
6.1.3. Густые и сухие экстракты 146
6.2. Содержание потенциально токсичных металлов (Sr,Cs) 159
6.2.1. Настои и отвары 159
6.2.2. Жидкие экстракты и настойки 166
6.2.3. Густые и сухие экстракты 168
6.3. Содержание токсичных металлов (Cd, Pb, Hg, Be, Al) 174
6.3.1. Настои и отвары 174
6.3.2. Жидкие экстракты и настойки 187
6.3.3. Густые и сухие экстракты 193
6.4. Сравнительная оценка содержания тяжелых металлов в различных фитопрепаратах 202
Резюме 214
ГЛАВА 7. Содержание хлорорганических пестицидов и полихлорбифенилов в фитопрепаратах 215
7.1. Содержание гексахлорциклогексана и его изомеров 215
7.1.2. Жидкие экстракты и настойки 220
7.1.3. Густые и сухие экстракты 224
7.2. Содержание ДДТ и его метаболитов 227
7.2.1. Настои и отвары 227
7.2.2. Жидкие экстракты и настойки 237
7.2.3. Густые и сухие экстракты 245
7.3. Содержание гексахлорбензола 251
7.3.1. Настои и отвары 251
7.3.2. Жидкие экстракты и настойки 256
7.3.3. Густые и сухие экстракты 260
7.4. Содержание полихлорбифенилов 265
7.4.1. Настои и отвары 265
7.4.2. Жидкие экстракты и настойки 270
7.4.3. Густые и сухие экстракты 274
Резюме 278
ГЛАВА 8. Содержание экотоксикантов в сборах, Б А Дах и водных извлечениях из них 280
8.1. Содержание тяжелых металлов 280
8.1.1. Сборы и БАД 280
8.1.2. Водные извлечения из сборов и БАД 290
8.2. Содержание хлорорганических пестицидов и полихлор бифенилов 317
8.2.1. Сборы и БАД 317
8.2.2. Водные извлечения из сборов и БАД 322
Резюме 340
ГЛАВА 9. Содержание экотоксикантов в цепи: почва - лекарственное растительное сырье - лекарственная форма. Оценка риска медицинского использования растительного сырья с различным содержанием экотоксикантов 342
9.1. Тяжелые металлы 342
9.2. Хлорорганические пестициды и полихлорбифенилы...353
9.3. Оценка возможного риска медицинского использования растительного сырья и фитопрепаратов с разным уровнем экотоксикантов 362
Резюме 367
Обсуждение результатов 369
Выводы 377
Литература 381
Приложения 396
- Оценка качества фитопрепаратов по содержанию тяжелых металлов
- Методы определения хлорорганических пестицидов и по-лихлорбифенилов при их совместном присутствии
- Сравнительная оценка содержания тяжелых металлов в лекарственном сырье, относящемся к разным морфологическим группам
- Жидкие экстракты и настойки
Введение к работе
Актуальность темы. Лекарственные растения сравнительно недавно стали предметом экологических исследований. Начиная с 70-х годов XX века в России, а до этого и в Западной Европе, началось изучение содержания в лекарственном растительном сырье, используемом в фармации и медицине, различных экотоксикантов (тяжелых металлов, пестицидов, радионуклидов и др.). Причиной тому послужили работы немецких ученых S.Ali и H.Shilcher (188, 189, 192, 226), которые впервые обнаружили аномально высокие концентрации пестицидов в растительном сырье и препаратах на его основе. Полученные результаты привлекли внимание широкого круга ученых, которые занялись решением выявившейся проблемы. В ходе экспериментальных работ по изучению экотоксикантов сформировался ряд научных школ (С.А. Листов, А.И. Попов, Н.И. Гринкевич, Х.С. Зайнутдинов, А.П. Авцын, А.А. Жаворонков и другие).
Параллельно выполненным научным работам появились и некоторые административные документы, регулирующие возможность использования в медицинской и фармацевтической практике растительного сырья с различными уровнями экотоксикантов. В частности, таковым явился приказ МЗ № 95 от 12.04.95 "О пересмотре нормативной документации на лекарственные средства и лекарственное растительное сырье". Суть этого пересмотра состояла в обязательном включении в нормативную документацию на лекарственное растительное сырье и фитопрепараты показателей содержания ксенобиотиков, таких как тяжелые металлы, пестициды, радионуклиды . Но даже при наличии этого весьма актуального приказа целый ряд проблем, касающихся степени риска использования сырья и лекарственных форм с разным уровнем экотоксикантов, остался нерешенным. Поэтому экспериментальные исследова- * - Настоящий приказ утратил свою силу 2001 г.
8 ния в этом направлении в настоящее время продолжаются, однако, эти работы касаются отдельных аспектов проблемы. В частности, разработаны и утверждены допустимые уровни содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье (128, 149).
Загрязнение окружающей среды повлекло за собой изменение экологических условий во многих районах заготовок дикорастущего лекарственного растительного сырья. Это обуславливает необходимость проведения на современном уровне оценки качества сырья лекарственных растений с учетом не только традиционных фармакопейных показателей, но и требований экологической чистоты. Особенно актуальны подобного рода исследования для районов, имеющих достаточную сырьевую базу лекарственных растений, но в силу различных причин оказавшихся под интенсивным антропогенным воздействием. К числу таковых относится территория Алтайского края, расположенная в непосредственной близости к Семипалатинскому полигону и испытавшая на себе его воздействия. Проведенные ранее исследования выявили присутствие в различных объектах окружающей среды этого региона кроме радионуклидов значимых концентраций пестицидов и тяжелых металлов. Учитывая тот факт, что реализация многих эффектов отдельных факторов (например, радиационного) зависит от дополнительного воздействия других факторов, например, химического, становится понятным необходимость предотвращения комплексного многофакторного воздействия. К числу таких территорий относится Алтайский край, находившийся в течение длительного времени в зоне радиационного воздействия при ядерных взрывах на Семипалатинском испытательном полигоне.
Цель и задачи исследования. Разработка современных теоретических и экспериментальных подходов к решению проблемы оценки эко-токсикантов в лекарственном растительном сырье и фитопрепаратах.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: оценить содержание тяжелых металлов (Pb, Cd, Hg, Zn, Си, Mn, Со, Cr, Ni, Cs, Sr, Be, Fe, Al) в почве района исследований, заготавливаемом на его территории лекарственном растительном сырье и приготовленных из него лекарственных формах; оценить содержание хлорсодержащих пестицидов (а-, (3-, у-изомеров гексахлорциклогексана, гексахлорбензола, ДДТ и его метаболитов (ДДЕ, ДДД)) в почве, лекарственном растительном сырье и фитопрепаратах;
3. оценить содержание полихлорбифенилов в почве района иссле дований, заготавливаемом на его территории лекарственном рас тительном сырье и приготовленных из него лекарственных фор мах; определить виды и морфологические группы сырья, совокупность экотоксикантов в которых находится в максимальных количествах; изучить особенности количественного перехода экотоксикантов из растительного сырья в фитопрепараты; провести информационно-аналитические исследования в сравнительном аспекте уровней содержания экотоксикантов в лекарственном растительном сырье из разных регионов и лекарственных формах; выявить особенности транссредовых переходов экотоксикантов в цепи: почва - ЛРС - фитопрепарат и оценить возможность медицинского применения ЛРС региона исследований; определить содержание вышеуказанных экотоксикантов в сборах и БАДах, реализуемых через аптечную сеть и водных извлечениях из них;
9. на основе проведенных исследований обосновать необходимость экологической оценки качества лекарственного растительного сырья.
Научная новизна исследования. Впервые проведено изучение особенностей качественного и количественного состава неорганических и органических токсикантов при их совместном присутствии в цепи: почва - лекарственное растительное сырье - лекарственная форма и дана оценка их транссредового перехода для сырья лекарственных растений, содержащих эфирные масла, флавоноиды, горечи, витамины и другие биологически активные вещества на примере флоры Алтайского края.
Предложена математическая модель перехода экотоксикантов из сырья в фитопрепараты, позволяющая определить возможные пределы их содержания и степень перехода в лекарственные формы.
Выявлены тенденции к уменьшению перехода экотоксикантов (тяжелых металлов и пестицидов) в лекарственные формы в зависимости от концентрации в исходном сырье.
Обоснована возможность использования данных, полученных на модельной территории для оценки уровней содержания экотоксикантов в лекарственном растительном сырье, заготавливаемом в тех регионах России, где содержание тяжелых металлов и пестицидов в почвах не превышает ПДК.
Полученные результаты могут быть использованы для последующих исследований в фармакогнозии и технологии лекарственных форм, касающиеся механизмов трансграничных переходов экотоксикантов в лекарственные растения и лекарственные формы.
Практическая значимость работы. Обоснована возможность проведения заготовок и использования лекарственного растительного сырья с установленным уровнем загрязнения экотоксикантами в пределах мо- дельной территории (Алтайский край) и сходных по этому признаку районов Российской Федерации и СНГ.
Использование данных о содержании экотоксикантов, полученных на модельной территории, позволяет оценить целесообразность проведения заготовок и использования лекарственного растительного сырья, собираемого в различных экологических условиях.
Впервые предложены проекты ОФС «Определение содержания тяжелых металлов в лекарственном растительном сырье» и ОФС «Определение содержания пестицидов в лекарственном растительном сырье», регулирующих содержание тяжелых металлов и пестицидов в лекарственном растительном сырье.
Полученные данные позволяют выбрать оптимальные по уровню содержания экотоксикантов лекарственные формы для лекарственного растительного сырья, содержащего различное количество хлорорганиче-ских пестицидов, полихлорбифенилов и тяжелых металлов.
Комитетом по фармацевтической деятельности и производству лекарственных средств администрации Алтайского края приняты к использованию фармацевтическими предприятиями и аптечными учереж-дениями края «Методические материалы по рациональному выбору путей использования лекарственного растительного сырья, содержащего различные уровни тяжелых металлов и пестицидов» (акт внедрения № 594 от 08.06.05) и ЗАО «Эвалар» (акт внедрения № 47 от 17.08.05.).
Результаты определения экотоксикантов в лекарственном растительном сырье и лекарственных средствах использованы ОКК ОАО "Красногорсклексредства" для оценки качества партий растительного сырья, закупаемых для производства БАД и чайных напитков (акт вне-_ дрения№ 1417 от 01.12.04.).
Результаты по определению токсичных элементов и хлорорганиче-ских пестицидов в лекарственном растительном сырье и БАДах исполь-
12 зованы в производственном процессе изготовления БАДов из сырья лекарственных растений Алтайского края, при разработке ТУ 9198-024-485405709-02 "Фиточаи Алтайские. Чайные напитки № 1-7" и ТУ 9198-015-10046011-03 "Фиточаи Алтайские. Чайные напитки № 8-21" (акт внедрения № 135 от 12.07.04).
Данные изучения закономерностей транссредового перехода эко-токсикантов в цепи "почва - лекарственное сырье - лекарственная форма" использованы ГУ НИИ региональных медико-экологических проблем (г. Барнаул) при реализации Государственной программы "Реабилитация населения и социально-экономическое развитие районов Алтайского края, подвергшихся радиационному воздействию, вследствие ядерных испытаний на Семипалатинском полигоне в 1949 - 1963 гг.» (акт внедрения № 54 от 26.07.04.).
Результаты изучения содержания тяжелых металлов и хлороргани-ческих пестицидов в лекарственном растительном сырье, заготавливаемом на территории Рубцовского района Алтайского края использованы в учебном процессе Алтайского государственного медицинского университета (акт внедрения № 120 от 19.07.04).
Апробация диссертации. Основные результаты исследований докладывались на ежегодных научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава АГМУ (Барнаул, 1995 - 2002), Международной научной конференции "Фармация в XXI веке: инновации и традиции" (Санкт-Петербург, апрель 1999), научно-практической конференции, посвященной 20-летию фармацевтического факультета КГМА "Фармацевтическая наука и практика" (Кемерово, 1999), научно-практической конференции "Природные и антропогенные предпосылки состояния здоровья населения Сибири" (Барнаул, 2001), научно-практической конференции, посвященной 20 фармацевтического факультета БГМУ (Уфа, 2002), XXXVI научной конференции "Обществен-
13 ное здоровье третьего тысячелетия" (Новокузнецк, 2002), 53-й региональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2004), XI и XII Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 2004; Москва, 2005), научно-практической конференции "Клиническая фармакология в России: достижения и перспективы" (Москва, 2004), научной конференции, посвященной 50-летию АГМУ "Лекарственные растения в фармакологии и фармации" (Барнаул, 2004), VIII и IX международных съездах «Актуальные проблемы создания новых лекарств и средств природного происхождения» (Миккеле, Финляндия, 2004; Санкт-Петербург, 2005), 2-й Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фар-мобразования» (Воронеж, 2005).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Алтайского медицинского университета по медико-биологическим проблемам, раздел "Фармация" (№ Гос. регистрации 01200004423), Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (№ Гос. регистрации 01970007164) «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из лекарственного растительного сырья и разработка методов их стандартизации с учетом антропогенных факторов, оценки качества и стандартизации»; в рамках научного обеспечения Государственной программы по реабилитации населения и социально-экономическому развитию населенных пунктов Алтайского края, подвергшихся радиационному воздействию в результате ядерных испытаний на Семипалатинском полигоне.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 печатных работ, в т. ч. в центральных изданиях, материалах научных конференций и съездов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 8 глав экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 395 страницах машинописного текста, содержит 175 рисунков, 103 таблицы, 16 приложений. Список литературы включает 227 источников, в том числе 44 на иностранных языках.
Положения, выносимые на защиту.
Оценка взаимосвязи содержания экотоксикантов (тяжелых металлов (Pb, Cd, Hg, Zn, Си, Mn, Со, Cr, Ni, Cs, Sr, Be, Fe, Al) и хлорсодержащих пестицидов (a-, (3-, у-измеров гексахлорцикло-гексана, гексахлорбензола, ДДТ и его метаболитов (ДДЕ, ДДД)), полихлорбифенилов) в почве региона заготовок и лекарственном растительном сырье разных видов.
Закономерности перехода экотоксикантов из лекарственного растительного сырья в лекарственные формы.
Особенности перехода экотоксикантов в лекарственные формы в зависимости от вида используемого экстрагента (настои и отвары, настойки, жидкие, густые и сухие экстракты).
4. Особенности содержания экотоксикантов в сборах и БАДах, реализуемых через аптечную сеть, а также водных извлечениях из них.
Сравнительная оценка экотоксикантов в лекарственном растительном сырье различных регионов.
Количественная оценка перехода экотоксикантов к цепи: почва -ЛРС - фитопрепарат.
Оценка качества фитопрепаратов по содержанию тяжелых металлов
Наибольший практический интерес для медицины и фармации представляют данные о содержании ТМ в фитопрепаратах. Этот аспект проблемы наименее исследован, о чем свидетельствует относительно малочисленный список публикаций (44, 46, 80, 98,121, 122, 155-157, 160, 185, 186, 200, 207, 208, 113, 219, 225, 226). По мнению ряда авторов, эти данные позволяют оценить значимость ТМ в проявлении фармакологической активности различных ЛФ. Другим важным аспектом этого вопроса является изучение потенциального токсического влияния высоких концентраций ТМ в лекарственных формах на человека (80,100, 164, 165, 180).
Наиболее популярными формами использования лекарственных растений являются настои и отвары. Исследования показали, что в отвар или настой переходит лишь некоторая доля металла, содержащегося в ЛРС (19, 44, 98). Концентрации микроэлементов, извлекаемых в настои и отвары, в большинстве случаев уменьшаются в ряду: Fe— Mn— Zn—»Cu— Ni— Сг, причем значительно преобладают только первые два элемента этого ряда, концентрации которых в водных извлечениях близки к 1 мкг/мл (120). Однако, относительное содержание железа в настоях и отварах наименьшее и не превышает 10%, а кадмия, цинка и свинца - достигает 23,4%, 17,2% и 16,5% соответственно (19, 95). Абсолютное и относительное содержание ТМ в водных извлечениях зависит как от вида ЛРС, так и режима настаивания. В частности, в настоях и отварах из ЛРС растений рода пустырник и валериана содержание свинца достигало 15%, цинка - 10%, хрома - 8%, железа - 29,8%, стронция - 4,7% (10). В то время как в настоях листьев подорожника и отварах корней одуванчика концентрации свинца, меди и цинка существенно ниже (79, 82).
Исследования кинетики извлечения элементов в отвары показали, что наибольший выход элементов (марганца, цинка и меди) достигается при использовании фармакопейной методики приготовления водных извлечений (133). Исследования водных извлечений из сбора "Мирфазин", включающий 12 видов ЛРС, показали, что 60 -90% хрома, наряду с марганцем и цинком переходят в водное извлечение (57).
В водно-спиртовые растворы ТМ из ЛРС извлекаются в меньших количествах, чем в настои и отвары: медь - в 1,68 раза, марганец - в 3,45 раза, цинк - в 3,15 раза, железо - в 26,43 раза, никель - в 1,63 раза, хром -в 2,85 раза (101, 182). Установлено, что кобальт и селен переходят в настойку валерианы в больших количествах, чем в отвары (10).
Сведения о содержании токсичных ТМ в лекарственных препаратах ограничены. Преимущественно они касаются водных лекарственных форм, в которых по данным S.L.Ali, H.Shilcher и других исследователей содержание свинца может достигать 76,3% от исходного содержания в сырье, кадмия - 15% (44, 79, 189, 208, 209, 219, 226). 1.3. Содержание пестицидов в сырье лекарственных растений
На сегодняшний день известно более 1200 наименований пестицидов, около 500 из них активно используются, в том числе на территории Алтайского края. Они относятся преимущественно к 3 классам: хлорор-ганические, фосфорорганические и производные сим-триазина. Известно, что уступая по токсичности современным фосфорорганическим пестицидам, ХОП способны длительное время находиться и циркулировать в неизменном виде в почве, растениях, живых организмах. Кроме того, продукты их метаболизма иногда проявляют сравнительно большую токсичность нежели исходные соединения (171). Механизмы их токсического действия на организм человека, среди которых канцерогенное -одно из опаснейших, являются предметом исследований (168).
Особенно токсичными хлорорганическими пестицидами принято считать полихлорированные бифенилы (ПХБ) и гексахлорбензолы (ГХБ). Проведенные в разных странах исследования показали, что принимаемые с 1973 г. меры ограничения или запрещения использования хлорорганических пестицидов пока не привели к снижению содержания их в различных объектах окружающей среды ввиду их высокой стойкости (90, 196, 206). Эти вещества длительное время фиксируются в почвах, характеризуются высокой растворимостью в жирах и органических растворителях и накапливаются в тканях, богатых липидами и жирами.
Согласно литературным данным, ПХБ достаточно широко используются в различных отраслях промышленности (135). По своим физико-химическим свойствам , а также распределению в окружающей среде ПХБ в известной степени напоминают ДДТ. Однако, меньшая степень изученности и разнообразие источников поступления в окружающую среду ПХБ не позволяют в настоящее время составить точную модель переноса этих соединений в объектах биосферы. Учитывая потенциаль 32 ную опасность и широкое распространение в окружающей среде этого класса соединений сочли необходимым определить концентрации ПХБ в образцах растительного сырья.
Не все из вышеуказанных хлорорганических пестицидов активно используются в сельском хозяйстве. В частности, уже несколько десятилетий существует запрет на использование ДДТ. Однако, особенности химической структуры этого и других хлорорганических пестицидов позволяют им длительное время циркулировать в окружающей среде в неизменном виде. Поэтому, остаточные количества хлорорганических пестицидов и сегодня обнаруживаются в объектах окружающей среды, одними из которых являются лекарственные растения.
Ранее проведенные на Алтае исследования обнаружили в объектах окружающей среды остаточные количества хлорорганических пестицидов, таких как линдан (у-изомер гексахлорциклогексана), ДДТ и его метаболиты, а также полихлорбифенилы (25).
В литературе имеется ряд публикаций, свидетельствующих о способности пестицидов мигрировать не только по почвенному профилю, но и переходить в сопредельные среды (в частности, подземные органы растений, атмосферу, грунтовые воды), а также кумулировать в них (84, 174). Установлено, что до 50% хлорорганических пестицидов, содержащихся в почве способны поглощаться и накапливаться растениями. Они дольше, чем фосфорорганические пестициды сохраняются в лекарственном растительном сырье в неизменном виде (7, 12, 76). При этом, величина остаточных количеств пестицидов в растительном сырье зависит от многих факторов, в частности концентрации препарата, нормы расхода при внесении в почву, вида растения, агрегатного состояния пестицида (в виде дуста, раствора и др.), а также температуры окружающей среды, удаленности места произрастания растения от района применения пестицидов и почвенно-климатических условий региона сбора сырья (194). Источники поступления, транспорт и трансформация пестицидов в окружающей среде изложены в научных обзорах (62, 96, 135).
С появлением первых данных о накоплении в лекарственных растениях и препаратах на их основе в начале 90-х годов XX века все чаще появляются публикации о необходимости контроля этих токсикантов в отечественном лекарственном растительном сырье (70, 101).
В здравоохранении используется сырье ЛР, как культивируемых, так и дикорастущих. Отдельные виды ЛР произрастают нередко вблизи полей с сельскохозяйственными культурами и по обочинам дорог. Такие условия произрастания могут способствовать накоплению пестицидов в сырье (12).
Методы определения хлорорганических пестицидов и по-лихлорбифенилов при их совместном присутствии
Определение ХОП и ПХБ (тетра-, пента- и гексахлорбифенилы) основан на извлечении их из исследуемого объекта (образцов почв, растительного сырья, экстрактов, настоев, отваров, настоек) органическим растворителем, очистке полученных экстрактов серной кислотой и на колонке с окисью алюминия, концентрировании и измерением содержания методом газожидкостной хроматографии с масс-селективным детектором (112, 124, 170). Масс-спектрометрическое окончание методики отработано и адаптировано в соответствии с областью аккредитации и технической компетентностью центра. Пределы обнаружения метода для почв, ЛРС и сухих экстрактов -0,1 нг/г; для настоев и отваров, жидких экстрактов и настоек - 0,1 нг/мл; для густых экстрактов - 0,2 нг/г. Методом добавок установлено, что степень определения ХОП и ПХБ составила: в почвах, ЛРС, настоях, отварах - 80%; в жидких и густых экстрактах, настойках - 70%. При этом определению ХОП и ПХБ не мешало присутствие других соединений. Погрешность определения составляла 35%. Относительная погрешность результатов параллельных измерений не превышала 15%. Определения проводили с использованием газового хроматографа HP 5890А с масс-селективным детектором HP 5972А, автосамплером и системой обработки данных ChemStation; на базе персонального компьютера HP Vectra фирмы "Hewlett - Packard" и стандартных веществ (ГСО состава а-ГХЦГ, у-ГХЦГ, ГХБ, ДДТ, ДДЕ и "Совола"(ПХБ)), а также внутренних стандартов (4,4 -дибромбифенила и 9,10-диметилфентантрена).
Определение ХОП и ПХБ в объектах исследования состояло из трех последовательных этапов: экстракции, очистки экстрактов и хромато -масс - спектрометрического анализа (ГХ/МС). Сначала пробы почв, растительного сырья и сухих экстрактов дополнительно измельчали до размеров частиц 0,5 мм. Затем точную навеску (массой около 5 г) помещали в коническую колбу на 100 мл, прибавляли 100 мкл стандартного раствора смеси внутренних стандартов с концентрацией 1 мкг/мл и 50 мл перегнанного гексана, перемешивали на магнитной мешалке в течение 1 часа при нагревании. После этого экстракт отфильтровывали через стекловату и проводили повторную экстракцию 30 мл гексана. Остаток на фильтре промывали 30 мл гексана и промывную жидкость присоединяли к экстрактам. К объединенному экстракту добавляли натрия сульфат безводный в соотношении 1:10 и выдерживали 1 - 1,5 ч, а затем упаривали на ротационном вакуумном испарителе до объема 10-15 мл. Для анализа водных настоев и отваров к 50 мл пробы прибавляли 100 мкл стандартного раствора смеси внутренних стандартов с концентрацией 1 мкг/мл и экстрагировали в делительной воронке 20 мл гекса-на. Экстракцию повторяли 3 раза. Объединенный экстракт сушили натрия сульфатом безводным и упаривали на ротационном вакуумном испарителе до объема 10-15 мл. Для анализа жидких экстрактов и настоек после прибавления к 50 мл пробы 100 мкл стандартного раствора смеси внутренних стандартов с концентрацией 1 мкг/мл, в колбу добавляли 150 мл, а для анализа сиропов - 200 мл воды очищенной, после чего экстракцию с последующим упариванием экстракта проводили аналогичным образом.
Точную навеску густого экстракта массой около 1- 2 г растворяли в 50 мл 96% спирта, переносили в делительную воронку и прибавляли 100 мкл стандартного раствора смеси внутренних стандартов с концентрацией 1 мкг/мл, 150 мл воды очищенной. Затем проводили экстракцию и упаривание полученного экстракта как описано выше.
Очистку полученных гексановых экстрактов от сопутствующих веществ осуществляли кислотой серной концентрированной. Для этого в делительную воронку на 100 мл к 10 - 15 мл экстракта добавляли 20 - 25 мл кислоты, содержимое осторожно встряхивали 5-10 раз и оставляли до расслоения фаз, после чего нижний слой (сернокислый) отбрасывали. Очистку повторяли несколько раз до получения бесцветного слоя серной кислоты. Очищенные экстракты нейтрализовали 0,5 н раствором натрия бикарбоната и промывали водой очищенной до нейтральной реакции промывных вод. После чего их пропускали через колонку (длиной 10 см и диаматром 1 см), последовательно заполненную алюминия оксидом (высотой слоя 3 см) и натрия сульфатом безводным (высотой слоя 3 см). Колонку промывали 20 мл метиленхлоридом. Полученный экстракт упаривали на ротационном вакуумном испарителе досуха. Сухой остаток растворяли в 1 мл ацетона.
Хромато-масс-спектрометрический анализ полученных растворов проводили на газовом хроматографе HP 5890А с масс-селективным детектором HP 5972А и автосамплером. Для анализа использовали 30 м кварцевую капиллярную колонку HP-5MS (сополимер 5%-дифенил-95%-диметилсилоксана) с внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,3 мкм. Анализ осуществляли при условиях, указанных в таблице 10. Масс-спектры регистрировали при ионизации электронным ударом с энергией ионизации 70 эв. Скорость сканирования составляла 1 скан/сек при диапазоне сканирования 40 - 600 а.е.м. Идентификацию ХОП и ПХБ проводили по времени удерживания стандартных образцов и сопоставлением экспериментальных масс-спектров с масс-спектрами из базы данных NIST CSD (275000 соединений) с помощью стандартной системы обработки данных ChemStation. Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили в режиме селективного детектирования индивидуальных ионов с идентификацией ХОП и ПХБ по характеристическим ионам и времени удерживания с использованием растворов стандартных веществ (табл.11).
Сравнительная оценка содержания тяжелых металлов в лекарственном сырье, относящемся к разным морфологическим группам
Анализ образцов сырья, собранных в 2000 г. показал, что содержание в них А1 снизилось и составило 13,00 - 1227,00 мкг/г, где минимальная концентрация соответствовала плодам шиповника, а максимальная -траве чабреца (табл.19). Тенденция к накоплению металла отдельными видами и морфологическими группами сырья не изменилась: наименьшие количества были характерны для плодов (19,20 - 19,22 мкг/г), а для трав, листьев и корней - более высокие (240,75 - 754,50 мкг/г). Максимальная средняя концентрация обнаружена в траве чабреца (754,5 0±54,59 мкг/г). В одном из образцов травы горца почечуйного концентрация А1 была аномально высокой (2457,0 мкг/г), хотя, данные об избирательном накоплении А1 этим видом отсутствовали (78, 104).
Концентрации РЬ в сырье исследованных видов были существенно ниже, чем А1. В образцах сырья 1999 г. сбора они варьировали в диапазоне 0,006 - 2,10 мкг/г, где минимальная концентрация обнаружена в траве тысячелистника, а максимальная - в листьях крапивы. Установлено, что только в 4,8% изученных образцов (листья крапивы) концентрации превышали допустимые уровни РЬ для овощей и фруктов (147). Диапазон средних значений содержания РЬ в сырье большинства видов находился в пределах 0,01 - 0,35 мкг/г. Наименьшие значения были характерны для плодов. Средняя концентрация РЬ в листьях крапивы была максимальной среди изучаемых видов ЛРС.
В образцах сырья, собранных в 2000 г. РЬ не обнаружен лишь в 1 образце корней солодки. Диапазон концентраций металла в сырье практически не изменился и составил 0,01 - 1,90 мкг/г. В 6,0% изученных образцов содержание РЬ превышало допустимые уровни для овощей и фруктов (0,5 мкг/г) (147). Таковыми были отдельные образцы: корневищ и корней кровохлебки - 1, травы чабреца 2, листьев крапивы - 1. Минимальная концентрация была в плодах боярышника, максимальная - в листьях крапивы. Полученные результаты хорошо согласовались с литературными сведениями об избирательном накоплении РЬ в листьях крапивы (101, 104). Средние концентрации для большинства видов находились в диапазоне 0,01 - 0,41 мкг/г. Сравнительно высокие концентрации РЬ в отдельных образцах листьев крапивы и травы чабреца (0,93 - 1,9 мкг/г) требуют дальнейшего изучения и проведения соответствующей серии отдельных экспериментов.
Анализ полученных результатов показал, что концентрации РЬ превышают допустимые уровни для овощей и фруктов в 4,8% образцов, собранных в 1999 г. и 6,0% образцов, собранных в 2000 г. Однако, выявленные концентрации значительно ниже допустимых уровней металла для БАД на растительной основе (147).
Содержание Cd в сырье было меньше по сравнению с РЬ. Металл обнаружен во всех образцах ЛРС, собранных в 1999 г. в концентрациях 0,004 - 0,170 мкг/г. В 53,2% образцов содержание Cd было выше допустимых уровней для овощей и фруктов (0,03 мкг/г). Среди таковых отсутствовали образцы корней солодки, плодов шиповника, жостера слабительного и боярышника. Во всех образцах корней одуванчика концентрации Cd более, чем в 3 раза превышали допустимые уровни. Максимальная концентрация Cd определена в корнях одуванчика и листьях крапивы, минимальная - в плодах жостера слабительного. Средние значения содержания Cd в сырье находились в диапазоне 0,005 - 0,076 мкг/г, где минимальная концентрация определена для плодов жостера слабительного, а максимальная - для травы тысячелистника.
В образцах сырья, собранных в 2000 г. концентрации Cd практически не отличались от результатов анализа ЛРС 1999 г. сбора. Диапазон концентраций составил 0,004 - 0,170 мкг/г. При этом, в 44,8%) образцов концентрации металла превышали допустимые уровни для овощей и фруктов (147), среди которых отсутствовали образцы корней солодки, плодов шиповника и жостера слабительного. Максимальная концентрация определена в корнях одуванчика, минимальная - в плодах калины. Средние значения содержания Cd в ЛРС находились в диапазоне 0,006 -0,068 мкг/г, где минимальная концентрация определена для плодов жостера слабительного, а максимальная - для травы тысячелистника.
Hg обнаружена лишь в 56,6% образцов сырья, а в остальных ее концентрации не найдены ( в частности, во всех исследованных образцах сырья подземных органов и отдельных образцах плодов). В листьях и травах Hg присутствовала во всех образцах. Для сырья, собранного в 1999 г., диапазон варьирования концентраций Hg составил 0,005 - 0,029 мкг/г. Минимальная концентрация обнаружена в образцах плодов, а максимальная концентрация в листьях крапивы. Концентрации Hg в большинстве образцов были значительно ниже допустимых уровней для овощей и фруктов (0,02 мкг/г). Лишь в 6,5% образцов (травы горца птичьего, листьев крапивы и березы) превышали таковые. Средние концентрации в ЛРС находились преимущественно в диапазоне 0,004 -0,010 мкг/г. Для плодов шиповника и жостера слабительного среднее значение содержания рассчитать не представлялось возможным, поскольку в большинстве исследованных образцов концентрации Hg не обнаружены. Максимальная средняя концентрация металла определена в листьях крапивы (0,019±0,001 мкг/г).
В сырье 2000 г сбора Hg найдена в 58,2% образцов, где концентрации варьировали в диапазоне 0,004 - 0,036 мкг/г. В остальных образцах сырья металл не обнаружен. Минимальная концентрация Hg была в плодах изученных видов ЛРС, а максимальная концентрация - в листьях крапивы. Концентрации Hg в большинстве образцов были значительно ниже допустимых уровней для овощей и фруктов (0,02 мкг/г) и лишь в 7,5% образцов (травы горца птичьего и листьев крапивы) превышали таковые. Средние концентрации Hg в ЛРС находились преимущественно в диапазоне 0,004 - 0,015 мкг/г. Небольшой объем выборки и различия концентраций металла в плодах боярышника и жостера слабительного не позволили рассчитать средние содержания для этих видов. Максимальные средние концентрации определены для листьев крапивы (0,015±0,002 мкг/г) и травы горца птичьего (0,015±0,001 мкг/г).
Жидкие экстракты и настойки
Найден в 60,0% исследованных густых и сухих экстрактов. В остальных экстрактах (3 (из 13) густых и 1 (из 17) сухой экстракт солодки, 5 (из 6) густых экстрактов одуванчика, 9 (из 9) густых экстрактов крапивы) металл не обнаружен (табл.46). Содержание металла в экстрактах не превышало 0,069 мкг/г. Максимальная концентрация РЬ обнаружена в сухом экстракте солодки (0,116 мкг/г). Среднее содержание РЬ в густых и сухих экстрактах возможно было рассчитать только для экстрактов солодки. При этом средняя концентрация РЬ в густых экстрактах была в 3,3 раза меньше, чем в сухих экстрактах. В густых экстрактах крапивы и корней одуванчика среднее содержание рассчитать не представлялось возможным, поскольку в большинстве образцов металл не обнаружен. Выявленные концентрации РЬ не превышали допустимых уровней для БАД на растительной основе (147).
Степень извлечения РЬ в густые экстракты корней солодки не превышала 35% (табл. 47). В сухих экстрактах солодки она достигала 68,49%. Средние значения степени перехода РЬ в густые экстракты солодки в 3,8 раза ниже, чем в сухие экстракты. При содержании РЬ в большинстве образцов ЛРС не более 0,36 мкг/г, его концентрации в экстрактах не превышали 0,074 мкг/г. Степень перехода металла достигала максимальных значений (68,49%) при его содержании в ЛРС менее 0,17 мкг/г (рис. 81 и рис.82). Концентрации Hg во всех исследованных густых и сухих экстрактах не обнаружены (табл.46, 47).
Be в густых и сухих экстрактах найден в 40,0% образцов (5 (из 13) густых и 13 (из 17) сухих экстрактов солодки (табл.46, 47). В остальных экстрактах концентрации металла не обнаружены. Бериллий не найден во всех исследованных образцах густых экстрактов одуванчика и крапивы. Установлено, что среднее значение степени перехода металла в сухие экстракты было в 7,8 раза выше по сравнению с густыми экстрактами солодки, а максимальное значение достигало 84%. При содержании Be в ЛРС преимущественно не более 0,024 мкг/г, его концентрации в густых и сухих экстрактах не превышали 0,0041 мкг/г. Степень перехода металла в экстракты уменьшалась по мере увеличения содержания в сырье (рис.83 и рис.84).
Концентрации А1 в большинстве густых и сухих экстрактах находились в диапазоне 1,89 - 19,59 мкг/г (табл.46). В 17,8% образцов экстрактов концентрации металла составляли 22,36 - 45,79 мкг/г. Максимальное содержание металла было найдено в сухом экстракте солодки (71,99 мкг/г), минимальное - в густом экстракте крапивы (1,89 мкг/г). Средние значения металла в экстрактах из разных видов ЛРС находились в диапазоне 4,43 - 22,17 мкг/г. При этом, выявлено более низкое содержание металла в густых экстрактах из корней по сравнению с густыми экстрактами из листьев. Среднее содержание металла в густых экстрактах солодки в 2,9 раза было ниже, чем в сухих экстрактах.
Степени извлечения А1 в густые и сухие экстракты в большинстве образцов находились в диапазоне 0,22 - 9,37% (табл.47). В 11,1% образцов экстрактов (все из которых сухие экстракты солодки) степень извлечения металла составляла 12,79 - 17,12%, а максимальное значение -достигало 30,63%. Средние значения степени перехода А1 в густые и сухие экстракты составили 0,53 - 8,74%. В густых экстрактах одуванчика это значение было наименьшим (0,53±0,07%), а в сухих экстрактах солодки - наибольшим (8,74±0,74%). Отмечено, что степень перехода металла в густые экстракты солодки в 3,6 раза ниже, чем в сухие экстракты. При содержании А1 в сырье преимущественно не более 467 мкг/г, его концентрации в густых и сухих экстрактах не превышали 45.79 мкг/г. С увеличением содержания металла в сырье до 2213 мкг/г, его концентрация в экстрактах снижалась до 5 мкг/г. Степень перехода металла в большинстве случаев не превышала 17% и уменьшалась до 2,95% по мере увеличения концентрации А1 в сырье (рис.85 и рис.86).
Таким образом, установлено, что в густых и сухих экстрактах исследованных видов из токсичных ТМ обнаруживались, главным образом, Cd и А1, в меньшей степени - РЬ и Be. Выявленные концентрации-были ниже имеющихся допустимых уровней для БАД на растительной основе (147).
Анализ содержания эссенциальных и условно эссенциальных металлов в различных лекарственных формах показал, что в большинство экстрактов, настоев, отваров и настоек Fe переходил в сравнительно больших количествах, а Сг и Со - в наименьших.
В лекарственных формах из корней солодки наиболее высокое содержание большинства металлов отмечено в сухих экстрактах (рис.87). Содержание Sr и А1 было максимальным в отварах. Наименьшими были концентрации Fe, А1 и Ni в густых экстрактах. Средние значения степени перехода большинства тяжелых металлов в густые экстракты солодки сравнительно выше, чем в сухие экстракты. В отварах в большинстве случаев степень перехода ТМ, была наименьшей (рис.88). Сравнительный анализ содержания металлов в лекарственных формах из корней одуванчика показал, что в отварах концентрации большинства металлов выше по сравнению с густыми экстрактами (рис.89). Во всех лекарственных формах не обнаружено содержание Cr, Cs и Hg, а в отдельных образцах - содержание РЬ. Максимальные концентрации РЬ в отварах были в 2,7 раза выше по сравнению с густыми экстрактами. Средние значения степени перехода большинства металлов, за исключением Си, были выше в отварах корней одуванчика по сравнению с густыми экстрактами из этого ЛРС (рис.90). Максимальная степень перехода РЬ в отвары более, чем в 4 раза превышала переход в густые экстракты.
