Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Растительные лекарственные средства, используемые при воспалительных заболеваниях полости рта 10
1.2. Характеристика биологически активных веществ ЛС растительного происхождения, применяемых для профилактики и лечения заболеваний полости рта в официнальной медицине 16
1.3 Современное состояние и перспективы стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС) 19
1.4. Экстракты из лекарственного растительного сырья:
характеристика, современные подходы к контролю качества..22
Выводы к главе 1 26
Экспериментальная часть
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 27
ГЛАВА 3. Разработка и стандартизация сбора "ФИТОСТОМ" 32
3.1. Обоснование состава растительного сбора 32
3.2. Выбор оптимального соотношения компонентов исходной растительной композиции 33
3.3. Разработка технологической схемы получения сбора 35
3.4. Изучение внешних признаков 35
3.5. Микроскопическое исследование сбора 36
3.6. Товароведческий анализ растительной смеси 39
3.7. Исследование качественного состава сбора 41
3.7.1. Качественные реакции на основные группы биологически активных веществ (БАВ) 41
3.7.2. Изучение УФ-спектров водного и водно-спиртового извлечений сбора 43
3.7.3. Изучение основных групп БАВ сбора методом ТСХ...48
3.7.4. Идентификация фенолъных соединений, органических кислот и свободных Сахаров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 55
3.8. Разработка методик количественного определения основных групп БАВ в сборе «Фитостом» 60
3.8.1. Определение содержания дубильных веществ 60
3.8.2. Определение суммы органических кислот 61
3.8.3. Определение содероісания глицирризиновои кислоты...62
3.8.4. Определение содержания полисахаридов 64
3.8.5. Определение содержания флавоноидов 68
3.8.6. Разработка методики количественного определения по сумме фенолъных соединений спектрофотометрическим методом 72
Выводы к главе 3 75
ГЛАВА 4. Разработка способа получения сухого экстракта сбора "фитостом" 76
4.1. Определение коэффициента водопоглощения сбора «Фито стом» 77
4.2. Разработка способа получения сухого экстракта 78
4.2.1. Подбор оптимальных условий экстракции биологически активных веществ 78
4.2.2. Методика получения сухого экстракта 78
4.2.3. Изложение технологического процесса получения сухого экстракта 81
4.2.4. Характеристика сухого экстракта 85
Выводы к главе 4 86
ГЛАВА 5. Ставдартизация сухого экстракта сбора "фитостом" 87
5.1. Определение показателей качества сухого экстракта 87
5.2. Иследование качественного состава сухого экстракта 88
5.2.1. Идентификация основных групп БАВ при помощи
качественных реакций 88
5.2.2. Идентификация основных групп БАВ при помощи УФ-спектрофотометрии 89
5.2.3. Идентификация основных групп БАВ методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) 90
5.2.4 Идентификация основных групп БАВ методом жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 90
5.3. Количественное определение БАВ в сухом экстракте 94
5.3.1. Определение содержания дубильных веществ 94
5.3.2. Определение суммы органических кислот 95
5.3.3. Определение содержания глицирризиновой кислоты...95
5.3.4. Определение содержания полисахаридов 96
5.3.5. Определение содержания флавоноидов 97
5.3.6. Разработка методики количественного определения по сумме фенолъных соединений спектрофотометрическим методом 98
Выводы к главе 5 100
ГЛАВА 6. Разработка показателей качества сбора "фитостом" и сухого экстракта 101
6.1. Разработка показателей качества сбора "Фитостом" 101
6.2. Разработка показателей качества сухого экстракта 111
Выводы к главе 6 117
Общие выводы 118
Список литературы 120
- Характеристика биологически активных веществ ЛС растительного происхождения, применяемых для профилактики и лечения заболеваний полости рта в официнальной медицине
- Разработка технологической схемы получения сбора
- Разработка способа получения сухого экстракта
- Идентификация основных групп БАВ при помощи УФ-спектрофотометрии
Введение к работе
Актуальность темы. Заболевания пародонта представляют собой одну из наиболее сложных проблем современной стоматологии. По данным ВОЗ их уровень колеблется от 55% до 98%. В возрастной группе 15-19 лет он составляет 55-89%, а в возрастной группе 35-44 года — 65-98%. Широкая распространенность и значительное «омоложение» данной патологии, неблагоприятное влияние очагов пародонтальной инфекции на организм, а также высокий уровень осложнений вплоть до полной утраты зубов, — все это определяет как медицинскую, так и социальную значимость данной проблемы.
Выявлена связь поражения пародонта с такими факторами, как возрастные изменения, генетическая предрасположенность, беременность, наличие соматических заболеваний. Установлено, что изменения в пародонте в 50-100% случаев сочетаются с патологией внутренних органов.
В этой связи весьма актуальным является поиск и изучение новых лекарственных средств для профилактики и коррекции заболеваний пародонта.
Особый интерес представляют лекарственные средства растительного происхождения, выгодно отличающиеся от синтетических аналогов широким спектром терапевтического действия, малой токсичностью и связанной с этим возможностью длительного применения. Весьма эффективными при профилактическом и терапевтическом использовании являются многокомпонентные препараты, содержащие биологически активные вещества, относящиеся к различным классам химических соединений, оказывающих комплексное воздействие на основные звенья патогенетического процесса.
На основании вышеизложенного считаем целесообразным и своевременным разработку лекарственного средства растительного происхождения ввиду того, что ассортимент таких препаратов весьма ограничен в Государственном Реестре.
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явились разработка и стандартизация нового многокомпонентного лекарственного средства растительного происхождения, рекомендуемого для профилактики и коррекции заболеваний пародонта.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать и обосновать рациональный состав многокомпонентной растительной композиции;
провести исследование по изучению внешних и анатомо-диагностических признаков компонентов растительного сбора;
установить качественный состав биологически активных веществ сбора;
определить содержание доминирующих групп БАВ с целью разработки методик стандартизации сбора;
оценить влияние различных факторов на процесс экстракции и определить наиболее оптимальные параметры экстракции БАВ;
разработать технологическую схему получения сухого экстракта на основе исследуемого сбора;
изучить качественный состав сухого экстракта, разработать методы его стандартизации.
разработать и оформить нормативную документацию на растительный сбор и сухой экстракт из него.
Научная новизна работы. Разработан и обоснован состав и соотношение компонентов растительной композиции.
Установлены критерии подлинности сбора, на основании химического состава и приоритетности групп БАВ каждого из входящих в сбор компонентов, разработаны методики его качественной и количественной оценки. С
учетом данных изучения параметров экстракции (тип экстрагента, соотношение сырьё-экстрагент, температурный режим, степень измельчения, гидродинамические условия) определены оптимальные условия получения сухого экстракта, что подтверждено последующей количественной оценкой содержания БАВ в сухом экстракте.
Разработаны методики качественного и количественного анализа сухого экстракта.
Состав лекарственного растительного сбора защищен патентом на изобретение «Лекарственный растительный сбор «Фитостом» для лечения воспалительных заболеваний пародонта», №2308965 от 27.10.2007 года.
Практическая значимость работы. По результатам исследований разработаны и внедрены:
Проект ФСП «Сбор Фитостом» (Акт внедрения методики количественного определения кислоты глицирризиновой в сборе «Фитостом» методом ВЭЖХ, ОАО «Красногорсклексредства»);
Проект ФСП «Фитостома экстракт сухой» (Акт внедрения методики количественного определения суммы фенольных соединений в экстракте сухом в ГУЗ «ЦСиККЛ ДЗ»);
Патент № 2308965 от 27.10.2007 г. «Лекарственный растительный сбор «Фитостом» для лечения воспалительных заболеваний пародонта».
Связь задач исследования с проблемным планом научного совета по фармакологии и фармации.
Работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований». Per. Номер 01.2.006 06 352.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК. Основные положения, выносимые на защиту:
результаты по разработке, обоснованию рационального состава и соотношения компонентов сбора;
результаты фармакогностического исследования сбора, установления критериев подлинности и содержания биологически активных веществ;
результаты обоснования и разработки технологической схемы получения сухого экстракта;
результаты качественного и количественного анализа сухого экстракта.
Характеристика биологически активных веществ ЛС растительного происхождения, применяемых для профилактики и лечения заболеваний полости рта в официнальной медицине
Проведенное исследование номенклатуры лекарственных средств показало, что на данном этапе ассортимент отечественных растительных препаратов в целевой фармакотерапевтической группе недостаточно широк, кроме того, в большинстве случаев, это средства с ограниченным спектром действия. В этой связи разработка и стандартизация новых комплексных растительных препаратов является своевременной и актуальной задачей. 1.2. Характеристика биологически активных веществ лекарственных средств растительного происхождения, применяемых для профилактики и лечения заболеваний пародонта в официнальной медицине.
Терапия заболеваний пародонта представляет собой сложную неоднозначную многоцелевую задачу. Одним из важнейших преимуществ лекарственных средств растительного происхождения является оказание мультипо-лярного воздействия на патогенез заболевания за счет содержания в расти тельном лекарственном сырье целого комплекса различных биологически активных веществ.
По данным литературы корневища и корни кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.) содержат полифенольный комплекс, включающий дубильные вещества (до 22%), эллаговую и галловую кислоты, пирогаллол, катехин и галлокатехин, что обуславливает вяжущие, кровоостанавливающие, антибактериальные свойства данного вида сырья.
Содержащиеся в корневищах и корнях флавоноиды (кверцетин, кемпферол, лютеолин и их гликозиды, антоцианы, лейкоантоцианы) являются мощными антиоксидантными агентами [18,41,52,130].
Сапонины кровохлебки сангвисорбин и потерин (до 4%) предположительно оказывают противовоспалительное и противоотечное действие [21, 105].
По данным многочисленных исследований, аскорбиновая кислота, также содержащаяся в вышеуказанном сырье, оказывает антиоксидантное действие; ретинол стабилизирует физиологические процессы в тканях, способствует заживлению поврежденных тканей [89,129].
По данным литературы, эфирное масло корневищ имбиря лекарственного (Zingiber officinale Rose), содержащее до70% цингиберена, а также цин-гиберол, бисаболен, линалоол, гераниол, камфен, цинеол, цитраль, обеспечивает антисептическое действие препаратов данного вида сырья [78,113].
Новейшие исследования растительных полисахаридов, в значительном количестве содержащиеся в корневищах имбиря, показали, что данная группа БАВ оказывает иммуномодулирующее и антиоксидантное действие [74,81].
Смола, представленная смесью двух соединений цингерона и- шогаола, способствует оказанию анальгетического эффекта [123]. Комплекс биологически активных веществ корней солодки голой и уральской (Glycyrrhiza glabra L., Glycyrrhiza uralensis Fisch.) содержит витамины, белки, горькие (до 4%) и смолистые (3-4%) вещества, липиды (около 4%), полисахариды (4-6% пектиновых веществ и крахмал), моносахариды и дисахариды (всего до 20%).
Наибольший вклад в оказание фармакотерапевтического эффекта вносят флавоноиды (3-4%) и тритерпеновые сапонины (около 20%).
Среди 27 разнообразных флавоноидов выделяют как наиболее фармакологически активные флавонол и халкон, а также их изоформы — ликура-зид, кемпферол, ликвиритозид, ликвиритин, изоликвиритин, неоликвиритин, рамноликвиритин, уралозид, рамноизоликвиритин и т. д. По имеющимся данным флавоноиды солодки оказывают выраженное антиоксидантное действие [43,72,107,109,130].
Среди тритерпеновых сапонинов основным является- глицирризин. Кроме того, в корнях и корневищах солодки уральской обнаружен агликон ураленоглюкуроновой кислоты — оксиглицирретиновая кислота.
Глицирризин представляет собой кальциево-калиевую соль глицирри-зиновой кислоты, установленный спектр действия которой включает противовоспалительные, антиаллергические, антивирусные и иммуномодулирую-щие свойства [21,42,107].
Всестороннее изучение отечественного солодкового корня провели проф. И. А. Муравьев, К. 3. Закиров, В. И. Литвиненко. В 1964 г. в лаборатории ВИЛР было доказано противовоспалительное действие препаратов солодки, близкое к эффекту кортизона; Препараты глицирризиновой кислоты, угнетают как экссудативную, так и пролиферативную фазы воспалительного процесса. Препараты солодки способствуют заживлению экспериментальных язв желудка [17].
Разработка технологической схемы получения сбора
Схема получения сбора была разработана на основании общепринятых технологических операций для изготовления данной лекарственной формы в соответствии с требованиями стандарта ОСТ 42-510-98 и «Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств».
Основные стадии технологического процесса: ВР. 1. Подготовка производственных помещений, оборудования и персонала. ТП 1. Подготовка лекарственного растительного сырья (измельчение и просеивание); ТП 2. Получение готового продукта; УМО 1. Фасовка и упаковка готового продукта.
Согласно ОФС ГФ XI изд. сборы представляют собой смеси нескольких видов измельченного, реже цельного, лекарственного растительного сырья, иногда с примесью солей, эфирных масел и пр., используемые в качестве лекарственных средств. Исследуемый сбор - это смесь измельченных корневищ имбиря, корневищ с корнями кровохлебки и корней солодки с морфологическими признаками, характерными для каждого вида сырья.
Аналитическую пробу массой 10 г помещали на чистую гладкую поверхность и определяли ее составные компоненты по внешнему виду, рассматривая невооруженным глазом и с помощью лупы (ХЮ).
Цвет сырья определяли на белом фоне при дневном освещении, запах — при соскабливании, вкус - в водном извлечении (по методике ОФС ГФ XI «Сборы» с 266, т.1).
Сбор представляет собой смесь неоднородных частиц сырья различной формы желтовато-серого цвета, желтовато-бурого цвета и светло-желтого цвета, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 5 мм.
Запах ароматный, вкус извлечения жгучий, терпкий, вяжущий. Микроскопическое исследование сбора
Нами были исследованы методом микроскопии и предложены следующие диагностические признаки сбора: - фрагменты темно-бурой пробки, состоящей из мелких клеток, тангентально вытянутые крупные клетки паренхимы с утолщенными оболочками, мелкие овальные или округлые, простые, реже сложные крахмальные зерна, крупные друзы (кровохлебки корневища и корни); - фрагменты клеток, заполненных крупными крахмальными зернами, овальной формы, заостренными, с заметной поперечной слоистостью; сосуды ксилемы; клетки, заполненные эфирным маслом или смолой оранжево-коричневого цвета (имбиря корневища); - группы волокон с кристаллоносной обкладкой из призматических кристаллов оксалата кальция; обрывки сосудов с широкими короткими члениками («бочковидные»), имеющими пористый тип вторичного утолщения; стенок с окаймленными порами, обрывки покровной ткани (пробки), состоящей из прямостенных многоугольных клеток с утолщенными стенками (корни солодки).
Нами был проведен товароведческий анализ нескольких серий сбора. Анализ проводился по следующим показателям: внешние признаки, измель-ченность, влажность, зола общая, зола, нерастворимая в 10% хлористоводородной кислоте, примеси: органические, минеральные, части растения, изменившие цвет; отсутствие амбарных вредителей, экстрактивные вещества, радионуклиды. Результаты анализа представлены в таблицах 3.6.3 и 3.6.4.
Определение проводилось на трех сериях сбора по методикам, изложенным в соответствующих статьях ГФ XI изд. вып.1. Испытание радиоактивности проводилось по двум радионуклидам: цезию-137 и стронцию-90 (ОФС 42 0011-03). Стронций-90 определяли в навеске лекарственного растительного сырья по бета-измерению, цезий-137 - в зольном остатке лекарственного растительного сырья по гамма-измерению.
На основании проведенных испытаний для сбора «Фитостом» установлены следующие показатели: содержание экстрактивных веществ не менее 30%, влажность не более 13%, содержание общей золы не более 10%, золы, нерастворимой в 10% хлористоводородной кислоте не более 4%, частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 5 мм не более 7%, частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм не более 6%, органической примеси не более 2%, минеральной примеси не более 2%, содержание радионуклидов в соответствии с ОФС 42-0011-03. зараженность амбарными вредителями, плесень, затхлость, посторонние запахи и привкусы не допускаются.
Для идентификации основных групп БАВ использовали качественные реакции с водным извлечением сбора (соотношение сырье:экстрагент — 1:10) с применением общих и специфических реактивов в соответствии с требованиями ГФ XI.
По результатам проведенных испытаний предлагается включить следующие качественные реакции для определения подлинности сбора «Фито-стом»: при прибавлении к 2-3 мл водного отвара сбора 4-5 капель раствора железоаммониевых квасцов или хлорида окисного железа появляется сине-черное окрашивание (дубильные вещества); готовят препарат в растворе Судана III и подогревают над пламенем горелки; капли эфирного масла окрашиваются в оранжево-розовый цвет (эфирное масло); аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл 50 % спирта. Колбу присоединяют к- обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок.
Разработка способа получения сухого экстракта
Сравнительная оценка перехода целевых групп БАВ при применении различных экстрагентов была проведена с использованием воды и этилового спирта различных концентраций.
Для этого 100,0 г сбора помещали в колбу со шлифом вместимостью 500 мл, доводили соответствующим экстрагентом до метки и кипятили с обратным холодильником на водяной бане, при перемешивании, трижды по два часа. Объединенные извлечения фильтровали, упаривали на роторном испарителе под вакуумом и сушили в вакуум-сушильном шкафу. Сухой остаток взвешивали и анализировали на содержание суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту.
Результаты исследований приведены в таблице 4.2.2.20. Как видно из вышеприведенной таблицы, наиболее оптимальными экс-трагентами являются горячая вода (80 С) и 30% этиловый спирт. Одновременно фармакологическими исследованиями установлено, что водный экстракт обладает более выраженным эффектом.
Оптимальное соотношение фаз сырье — экстрагент, определенное опытным путем, составило 1:10; коэффициент поглощения Кв равен 2,28±0,2.
Последующие исследования показали, что с увеличением продолжительности и количества экстракций, увеличивается выход экстрактивных веществ и суммы фенольных соединений (таблица 4.2.2.21).
При исследовании контактов фаз и времени экстракции установлено, что равновесное состояние при I контакте фаз достигается через 1 час, при II контакте фаз - за 45 минут, при III контакте - за 30 минут.
Трехкратная экстракция обеспечивает истощение сырья в среднем на 85-90 % от исходного содержания в сырье. Потери биологически активных веществ составляют 10-15% от исходного содержания в сырье.
Технологическая схема производства сухого экстракта включает в себя следующие стадии: подготовка лекарственного сырья, получение водного экстракта, упаривание, сепарирование, сушка (рис 4.2.3.20).
На основании проведенных экспериментальных исследований и разработанной технологической схемы получения сухого экстракта были проведены загрузочные испытания получения сухого экстракта.
Экстрагирование сырья производили в реакторе из нержавеющей стали с ложным дном, вместимость 150 л, имеющей мешалку лопастного типа, делающей 60 об/мин., боковым загрузочным люком, паровой рубашкой и гильзой для термометра. На дно реактора помещали серошинельное сукно и 2 слоя бязи, при сливе извлечения одновременно фильтровались. Очистку объединенных водных извлечений осуществляли фильтрацией через друк-фильтр и сепарированием. Для упаривания извлечений применяли циркуляционный вакуум-выпарной аппарат «Simax» (Чехия).
Упаривание вели при температуре 40С и давлении 0,69 мПа приблизительно до 1/15 первоначального объема. Водный кубовый остаток сливали в сборник и сепарировали.
Очищенный экстракт сушили с помощью распылительной установки фирмы «Автомайзер-Нирс» (Дания) при давлении 5,2 кгс/см (0,52 мПа), при температуре на входе 200С, на выходе 80С. Скорость подачи жидкости поддерживалась в пределах 2,0-2,5 л/г.
На всех стадиях технологического процесса осуществляли контроль за содержанием суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту. Проведен анализ исходного сырья, водных извлечений шрота, балластных веществ после сепарирования, сухого экстракта-субстанции.
Идентификация основных групп БАВ при помощи УФ-спектрофотометрии
Определение фенольных соединений сухого экстракта методом ТСХ проводилось в условиях аналогичных приведенным в главе 3.7.3. для сбора «Фитостом».
В результате проведенных исследований было установлено наличие в экстракте ликуразида, лютеолина-7 гликозида, галловой кислоты, танина. Идентификация основных групп БАВ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Идентификация фенольных соединений
Около 1,0 г экстракта помещали в колбу вместимостью 250 мл, прибавляли по 50 мл спирта этилового 70 %, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объёмом 100 мл и доводили спиртом этиловым 70 % до метки (исследуемый раствор).
Параллельно аналогичным способом готовили серию 0,05 % растворов сравнения: рутина, кверцетина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, галловой кислоты, кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, гиперозида, геспереди 91 на, апигенина, феруловой кислоты, витексина, робинина, гликуразида, гли-цирризиновой кислоты, байкалина.
По 20 мкл исследуемых растворов и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали.
Результаты проведенных исследований приведены на рисунке 5.2.4.22. По полученным данным можно сделать вывод об идентичности состава фенольных соединений сбора «Фитостом» и полученного из него сухого экстракта. не, затем охлаждали, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводили объём извлечения 0,01М раствором серной кислоты до метки, перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр (испытуемый раствор).
Параллельно готовили серию растворов сравнения: Около 0,025 г щавелевой, яблочной (маликовой), янтарной, винной, салициловой и бензойной кислот помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в 25 мл 0,01 М раствора серной кислоты и доводили тем же растворителем до метки. По 20 мкл испытуемого раствора и растворов РСО последовательно вводили в хроматограф и хроматографировали.
Результаты определения позволяют сделать вывод об идентичности состава органических кислот сбора «Фитостом» и его сухого экстракта. Идентификация свободных Сахаров.
Около 1,50 экстракта помещали в колбу вместимостью 20 мл, прибавляли 10 мл воды дистиллированной и нагревали с обратным холодильником в течение одного часа. Смесь охлаждали, фильтровали в мерную колбу вместимостью 20 мл и доводили тем же растворителем до метки (исследуемый раствор).
Параллельно готовили серию растворов сравнения: По 0,15 г рамнозы, ксилозы, мальтозы, сорбитола, глюкозы, лактозы, арабинозы, сахарозы, фруктозы, галактозы помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 15 мл 0,005 N раствора серной кислоты и доводили тем же растворителем до метки, перемешивали.
По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения Сахаров вводили в хроматограф и хроматографировали. Результаты исследований приведены на рисунке 5.2.4.24. Как следует из результатов определения состав свободных Сахаров экстракта и сбора полностью идентичен.
