Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Нарушение адаптационных процессов в организме как причина развития патологических состояний 10
1.2. Регулирующее действие БАВ лекарственных растений на адаптивные процессы организма человека 15
1.3. Фармакологические аспекты действия адаптогенов 26
1.4. Современные. методы стандартизации спиртосодержащих многокомпонентных фитопрепаратов 32
1.5. Характеристика лекарственного растительного сырья, входящего в состав сбора 37
1.5.1. Девясил высокий-Irmla heleniumL 37
1.5.2. Солодка голая- Glycyrrhiza glabra L. и солодка уральская Glycyrrhiza uralensis Fisch 38
1.5.3. Календула лекарственная- Calendula officinalis L 39
1.5.4. Облепиха крушиновидная- Hippophae rhamnoides L 39
1.5.5. Родиола розовая- Rhodiola rosea L 40
1.5.6. Боярышник- Fructus Crataegus 41
1.5.7. Бадан толстолистный- Bergenia crassifolia Fritsch 42
1.5.8. Шиповник - Fructus Rosae 42
1.5.9. Крапива двудомная- Urtica dioica L 43
1.5.10. Аир болотный- Acorus calamus L 43
1.5.11. Левзея сафлоровидная- Rhaponticum carthamoides 44
1.5.12. Имбирь аптечный-Zingiber officinale 44
1.5.13. Кардамон настоящий-Elettaria cardamomum 45
1.5.14. Мускатный opex-Myristica fragrans 45
1.5.15. Перец черный-Piper nigrum L 46
1.5.16. Петрушка кудрявая- Petroselinum sativum Hoffm 46
1.5.17. Пятилистник кустарниковый-Pentaphylloides fruticosa L 47
Экспериментальная часть 49
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Объекты исследования 49
2.2. Физико-химические методы качественного и количественного анализа БАВ 50
2.3. Вспомогательные вещества и материалы 53
2.4. Методы статистической обработки полученных результатов 54
Глава 3. Фитохимическое изучение растительной композиции
3.1. Обоснование подбора исходной композиции 55
3.2. Товароведческий анализ растительного сырья, входящего в состав исходного сбора 57
3.3. Выбор оптимального соотношения ингредиентов растительного сбора 69
3.4. Изучение химического состава растительного сбора 70
Выводы к главе 3 80
Глава 4. Количественное определение БАВ в растительном сборе
4.1. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в растительном сборе 81
4.2. Разработка методики количественного определения суммы восстанавливающих моносахаров ПСК растительного сбора 91
4.3. Количественное определение основных БАВ в сборе 101
Выводы к главе 4 106
Глава 5. Разработка способа получения лекарственного средства
5.1. Технологические свойства сырья 108
5.2. Подбор оптимальных условий экстрагирования растительного сбора 110
5.3. Технологическая схема получения жидкого экстракта 115
Выводы к главе 5 119
Глава 6. Стандартизация жидкого экстракта «Тантон»
б.І.Фитохимическое изучение жидкого экстракта «Тантон» 121
6.2. Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов и полисахаридов в жидком экстракте «Тантон» 128
6.2.1. Количественное определение суммы флавоноидов в жидком экстракте «Тантон» 128
6.2.2. Количественное определение суммы восстанавливающих моносахаров ПСК жидкого экстракта «Тантон» 131
6.3. Установление показателей качества и срока годности жидкого экстракта «Тантон» 135
Выводы к главе 6 136
Общие выводы 139
Список литературы 141
Приложения
- Регулирующее действие БАВ лекарственных растений на адаптивные процессы организма человека
- Пятилистник кустарниковый-Pentaphylloides fruticosa L
- Разработка методики количественного определения суммы восстанавливающих моносахаров ПСК растительного сбора
- Количественное определение суммы восстанавливающих моносахаров ПСК жидкого экстракта «Тантон»
Введение к работе
Актуальность темы. В течение последних десятилетий особо выделяется направление в фармации по созданию лекарственных препаратов, способных поддерживать защитные силы организма, в частности средства тонизирующего, общеукрепляющего (адаптогенного) действия.
Многочисленные неблагоприятные экологические факторы, недостаточное употребление натуральных продуктов, витаминов, минеральных веществ, пищевых волокон, биологически активных веществ растений, стрессы, чрезмерные физические и умственные нагрузки, ограничение двигательной подвижности провоцируют состояние стресса с последующим нарушением обмена веществ и повышением уровня свободных радикалов в организме [Барабой В.А., 1993; Дичев Т.Г., 1994].
Для нормализации работы физиологических систем необходимы комплексные лечебно-профилактические средства, помогающие восстановить защитные функции организма. Одним из подходов к решению этой проблемы является разработка биологически активных добавок (БАД) к пище восполняющих дефицит необходимых организму нутриентов, содержащих антиоксиданты, иммуномодуляторы, стимуляторы внутренних органов. В этой связи интерес для научных исследований представляет разработка безопасных фитосредств, созданных на основе знаний традиционной тибетской медицины прошлых веков, и современных научных достижений. Преимущества фитопрепаратов обусловлены широким спектром фармакологического действия, в отличие от химических препаратов они способны оказывать мягкое действие без побочных последствий, могут использоваться для людей постоянно подверженных воздействию неблагоприятных экологических факторов, в целях профилактики заболеваний, для реабилитации больных после операций, а также для снижения утомляемости и повышения работоспособности [Гриневич М.А., 1990; Воскресенский О.Н., 1992; Кидалов В.Н., 1998]. Таким образом, является актуальным внедрение в медицинскую практику эффективных комплексных средств профилактического действия, которые позволят существенным образом поддерживать здоровье человека на высоком уровне, расширить и улучшить ассортимент лекарственных средств адаптогенного действия.
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка состава и технологии нового эффективного адаптогенного лекарственного средства растительного происхождения, представляющего собой жидкий экстракт, и способов его стандартизации.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие
рос. национальная!3 библиотека
J^fleT«p6>pr 8MSPK
основные задачи:
-разработать оптимальный состав исходной лекарственной растительной композиции для получения фитосредства,
-изучить качественный состав растительной композиции с использованием современных физико-химических методов анализа и определить содержание основных действующих веществ;
-изучить факторы, влияющие на выход БАВ из растительной композиции и разработать технологию производства жидкого экстракта;
-изучить качественный состав жидкого экстракта, разработать методики количественного определения БАВ и показатели качества для его стандартизации;
-разработать нормативную документацию в виде ФСП, ТУ, ТИ на средство, рекомендуемое для внедрения в медицинскую практику.
Научная новизна. Подобран и обоснован рациональный состав исходной растительной композиции, на основе которой разработано новое средство с адаптогенной активностью в виде жидкого экстракта (условно названного) «Тантон».
С использованием современных методов анализа установлено наличие в исходной композиции и жидком экстракте «Тантон» биологически активных соединений, относящихся к классу флавоноидов и фенолкарбоновых кислот, тритерпеноидов, дубильных веществ, витаминов, аминокислот, алколоидов, полисахаридов. Изучен состав эфирного масла исходного сбора, в результате идентифицировано более 40 индивидуальных соединений, для некоторых из них установлены растительные источники; изучен микроэлементный состав исходного сбора и полученного на его основе жидкого экстракта, в результате обнаружено 30 макро- и микроэлементов; установлен качественный и количественный состав аминокислот в жидком экстракте.
Установлено количественное содержание основных действующих веществ в исходном сборе, разработаны методики количественного определения по сумме флавоноидов и полисахаридов.
Разработана технология получения жидкого экстракта из
растительного сбора, определены параметры экстрагирования сырья,
обеспечивающие максимальный выход биологически активных веществ,
обусловливающих адаптогенную, антистрессорную,
иммуностимулирующую активность экстракта.
Разработаны методики качественного и количественного определения БАВ и определены показатели качества для стандартизации жидкого экстракта.
Получено положительное решение на выдачу патента «Лекарственное средство «Тантон», обладающее адаптогенной
активностью».
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработана нормативная документация:
проект ФСП на лекарственное средство-жидкий экстракт «Тантон» (утвержден на заседании Ученого совета ИОЭБ СО РАН, протокол № 7 от 07.09.2004 г.);
технологические условия (ТУ 9197- 014-53015183-04) на биологически активную добавку (БАД) к пище жидкий экстракт «Тантон»; Технологическая инструкция (ТИ);
растительный сбор внедрен в производство в Центре Восточной медицины МЗ РБ (акт внедрения от 11.05.2004 г);
установлено, что жидкий экстракт «Тантон» обладает
антиоксидантной, иммуномодулирующей, адаптогенной,
актопротекторнои активностью Исследования специфической активности проведены в лаборатории экспериментальной фармакологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН.
Апробация работы и публикации.
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на:
-третьем конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», Томск, 16-17 мая 2002 года;
-научно-практической конференции ВСГ'ГУ: «Химия и биологически активные вещества», Улан-Удэ, 15 апреля, 2003 г.;
-научно-практической конференции «Биологически активные добавки в профилактической медицине», Улан-Удэ, 18-19 сентября 2003 г.;
-научно-пракіической конференции посвященной 70-летию службы контроля качества лекарственных средств в Бурятии;
-заседании объединенного семинара лабораторий медико-биологических исследований, экспериментальной фармакологии и безопасности биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН (г. Улан-Удэ, 18.04.2004 г.)
Основное содержание диссертации опубликовано в 8 научных работах; в ТУ 9197- 014-5301518304 и в ТИ на производство биологически активной добавки (БАД) к пище жидкий экстракт «Тантон», проекте ФСП на жидкий экстракт «Тантон».
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Отдела биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по программе: «Создание информационного банка данных по тибетской медицине и разработка новых лекарственных препаратов» (номер государственной регистрации 01.9400031.83); «Лекарственные растения Сибири и Дальнего Востока»,
являющейся разделом (6.3) Государственной программы «Сибирь» на период 1986-2005 гг и тематикой проблемной комиссии по фармации №36.08 РАМН МЗ РФ.
Работа по исследованию химического состава БАВ растительного сбора и жидкого экстракта «Тантон» поддержана грантом по программному мероприятию ] .2 Федеральной целевой программы «Интеграция науки высшего образования России на 2002-2006 годы» и проводилась в 2004 году во Всероссийском институте лекарственных и ароматических растений г Москвы, под руководством главного научного сотрудника лаборатории стандартизации ВИЛАР, д.фарм.н., профессора Даргаевой Тамары Дарижаповны.
Основные положения, выносимые на защиту:
-обоснование растительной композиции и возможности создания препарата адаптогенного действия на его основе;
- результаты исследований по содержанию действующих веществ в исходном сборе и готовом препарате;
-способ получения лекарственного средства, обладающего адаптогенной активностью;
-методики стандартизации жидкого экстракта «Тантон».
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 168 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, шесть глав экспериментальных исследований, 49 таблиц, 13 рисунков, общие выводы, список используемой литературы, включающий 269 источников, из них 29 зарубежных научных публикаций. Приложения содержат (ТУ 9197- 014-53015183-04), ТИ на биологически активную добавку (БАД) к пище жидкий экстракт «Тантон»; проект ФСП на средство жидкий экстракт «Тантон».
Регулирующее действие БАВ лекарственных растений на адаптивные процессы организма человека
Нормализация функционирования адаптивного механизма возможна лишь при одновременном воздействии на все напряженные и нарушенные звенья метаболизма. Этому требованию наилучшим образом могут отвечать многокомпонентные препараты природного происхождения, что обусловлено полифункциональностью их фармакологического действия [159, 160, 246].
В последние годы складывается концепция, в основе которой развитие патологического процесса практически при любых заболеваниях рассматривается как нарушение последовательности биохимических реакций в результате снижения функции определенных ферментных систем. Так, при аддитивной терапии предусматривается введение в организм продуктов промежуточного обмена, дефицит которых возникает в результате снижения активности какого-либо фермента в биохимической цепи реакций. Такими продуктами могут быть витамины, минералы, аминокислоты, жирные, органические кислоты и другие, биологически активные вещества, которые в богатом разнообразии присутствуют в многокомпонентных препаратах-эликсирах, сухих полиэкстрактах, отварах и чаях из сборов различных лекарственных растений. Лечебно-профилактический эффект таких препаратов связан с содержанием целого комплекса действующих веществ, участвующих в метаболических процессах тканей и в антиоксидантной активности клетки [32,43,82, 101, 115, 160, 161, 176].
Известно, что снижение активности антиоксидантной защиты характеризуется развитием свободнорадикальных повреждений разных компонентов клетки и тканей, составляющих синдром пероксидации и включающий следующие изменения: повреждение мембран, инактивацию или трансформацию ферментов, подавление деления клеток, накопление в клетке инертных продуктов полимеризации. Периодически повторяющийся синдром пероксидации составляет фактор патогенеза многих заболеваний.
Таким образом, при действии природных адаптогенов достигается снижение интенсивности перекисного окисления липидов и защита тканей организма от деструкции.
Антиокислительную активность проявляют различные биологически активные вещества, входящие в состав лекарственных растений: токоферолы, стероидные гормоны, убихиноны, биофлавоноиды [45]. Имеются сведения о применении в клинической практике синтетических антиоксидантов (АО): дибунол, пробукол, препараты никотиновой кислоты-компламин, глуникат [34]. Наиболее широко используемые в медицине группы АО-доноры протонов: токоферол, пробукол, дибунол, аскорбиновая кислота, биофлавоноиды, комплексы антиоксидантов; полиены: ретинол, каротиноиды. По некоторым данным наибольшие перспективы клинического применения имеют представители групп катализаторов и ловушек радикалов: в первую очередь за счет наиболее универсального ингибирующего действия на свободнорадикальное окисление [84].
В научной литературе рассматривается проблема влияния биологически активных веществ (БАВ) лекарственных растений на процессы детоксикации и состояние внутренней среды организма, источниками загрязнения которого являются как экзогенные, так и эндогенные факторы. Важным этапом детоксикации организма является очистка желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) комплексами БАБ лекарственных растений, основными факторами действия которых являются энтеросорбция, восполнение связанных с ней потерь микронутриентов, регенерация пристеночного слизистого слоя, язвозаживляющее и регенерирующее действие, повышение переваривающей способности ЖКТ, улучшение микроциркуляции в стенках ЖКТ, антиоксидантное, антигипоксантное, антиканцерогенное действие, нормализация локального иммунитета и функции эндокриноцитов, эфферентное действие. Основными системными факторами очистки организма являются ферментные системы детоксикации (цитохром Р-450, ферменты конъюгации) и система антиоксидантной и антиперекисной защиты. Отмечается влияние комплекса природных веществ лекарственных растений, включающих витамины, минералы, флавоноиды, лигнаны, катехины, растительные индолы, серосодержащие соединения и др., на функционирование этих систем, а также основных элиминирующих факторов организма [72, 122, 255].
Различают биоантиоксиданты прямого действия: витамины-токоферол, аскорбат, биофлавоноиды, ретинол, серосодержащие аминокислоты-цистеин, серосодержащий бетаин-эрготионеин; биоантиоксиданты непрямого действия: витамины - рибофлавин, никотиновая кислота, аминокислоты-метионин, микроэлементы-селен, медь, цинк, марганец. Основная роль перечисленных биоантиоксидантов обусловлена вхождением и функционированием их в составе физиологической антиоксидантной системы [36, 54].
Существенный интерес представляют полифенольные соединения, включающие биофлавоноиды, катехины, антоцианидины, феноловые кислоты, специфические гликозиды родиолы розовой, элеутерококка, лигнаны левзей сафлоровидной и др., которые оптимизируют адаптацию организма к действию большого числа экстремальных факторов [125].
Наиболее распространенной группой биологически активных веществ в составе многокомпонентных препаратов являются флавоноиды. Они содержатся практически во всех растениях в разных количествах. Из растений, содержащих флавоноиды, могут быть выделены-бессмертник, боярышник, бузина черная, горцы, земляника, липа, морковь, подорожник, рябина, арония, солодка, шиповник смородина и другие. Большинство флавоноидов присутствует в тканях растений в виде соединений с сахарами (гликозидов) и органическими кислотами, некоторые из них входят в состав дубильных веществ, а также обладают витаминной активностью [239].
Опубликовано много данных о влиянии их на пищеварительный тракт и печень, противолучевом, спазмолитическом, антиоксидантном, противовоспалительном, противоопухолевом, ранозаживляющем, эстрогенном, и других типов действия. Отмечается некоторая специфичность биологического действия флавоноидов в зависимости их от класса [20, 21, 89]. Характерными свойствами изофлавоновых соединений является их эстрогенное действие. Флавоны оказывают бактерицидное, спазмолитическое, гипотензивное. Флавонолы в зависимости от структуры обладают разносторонним влиянием на организм, например госсипетин, морин, кверцетагетин, кверцетин и др.-антиоксидантное; робинии, леспелин, биоробин, диоробин, гиперозид имеют гипоазотемическое свойство; госсипол-антиканцерогенное [59]. Многие полифенольные соединения растительного происхождения, в том числе и флавоноиды, обладают радиозащитным действием: рутин, цитрин, лейкодельфинидин, кверцетин, катехины чая и используются для лечения, профилактики лучевых повреждений [59, 131]. Недостаток антиоксидантов в организме человека стимулирует накопление свободных радикалов. Антиоксиданты очень важны для нормального обмена живой клетки. Известно, что в состав клеточных мембран входят легко окисляющиеся липиды. При перекисном окислении липидов клеточных мембран образуются токсические продукты, нарушается обмен в клетке, работа ее угнетается вплоть до гибели клетки. Поступление в организм экзогенных антиоксидантов ведет к исчезновению таких процессов, как митоз, злокачественное перерождение, атеросклероз и т.п.[11, 25, 34, 35, 40, 72, 95, 237].
При недостаточном снабжении тканей организма кислородом и (или) нарушении его утилизации возникает состояние гипоксии. Следствием гипоксии являются нарушения процессов обмена в тканях. В первую очередь, страдает энергетическое обеспечение клеток, что приводит к развитию различных патологических сдвигов и формированию острых и хронических заболеваний. Некоторые лекарственные растения и препараты из них, обладают противогипоксическим действием и могут применяться для лечения гипоксических состояний [167].
Особенно важно отметить, что биофлавоноиды подавляют перекисные процессы на самых первых стадиях, предотвращая образование последующих, более опасных продуктов перекисного окисления: гидроксил-иона, синглетного кислорода и др. [45, 226, 251, 252, 259].
Отмечают мембраностабилизирующий, антигипоксантный, иммуномодулирующий эффекты биологически активных веществ шиповника, солодки голой, разных видов боярышника, родиолы розовой, элеутерококка колючего [5, 26, 46, 73].
Большой биологической активностью обладают сапонины, которые по химической структуре относятся к гликозидам. Они широко распространены в растительном мире и кроме растений-адаптогенов содержатся в кукурузе, одуванчике, подорожнике, первоцвете, почечном чае, солодке и других растениях. В присутствии сапонинов, которые действуют подобно желчным кислотам, легче всасываются другие лекарственные вещества. Некоторые сапонины повышают секреторную деятельность желез внутренней секреции, обуславливают отхаркивающее, тонизирующее, слабительное действие, многие действуют мочегонно. Стероидные сапонины входят в состав препаратов, применяемых при атеросклерозе как гипохолестеринемические средства, также их используют для получения кортикотропных гормонов -кортизона, гидрокортизона, преднизолона. Тритерпеновые гликозиды, выделяемые из растений семейства аралиевых (аралия маньчжурская, женьшень, элеутерококк и др.), обладают иммуностимулирующими и адаптогенным действием. Они стимулируют физическую и умственную работоспособность, понижают уровень сахара в крови. Такие препараты способствуют резкому увеличению синтеза рибонуклеиновой кислоты (РНК), которая служит своеобразной матрицей для производства белков, в том числе ферментов [2, 112, 114, 124, 157, 165,240].
Пятилистник кустарниковый-Pentaphylloides fruticosa L
Химический состав. Разные части растения содержат тритерпеноиды (урсоловая кислота); витамины С, Р; фенолкарбоновые кислоты и их производные (кофейная, синаповая, феруловая, n-кумаровая); дубильные вещества (до 9%); катехины ((±)-катехин, (-)-эпикатехин, (-)-эпигаллокатехин); флвоноиды (кверцетин, кверцетрин); кумарины (эллаговая кислота), полисахариды.
Использование. Широко используется в народной медицине в виде отвара как кровоостанавливающее, противовоспалительное, успокаивающее, обезболивающее, антибактериальное, противодиарейное средства. Принимают внутрь при желудочно-кишечных, гинекологических заболеваниях, наружно используют для лечения ран, фурункулов, в виде полосканий при ангине. В практике тибетской медицины используют отвары из побегов, листьев, цветков при желудочно-кишечных заболеваниях, туберкулезе легких, как отхаркивающее средство. В монгольской медицине при нервно-психических заболеваниях.
В экспериментальных исследованиях выявлено, что экстракт пятилистника кустарникового обладает антиульцерогенным действием, ингибирует перекисное окисление липидов, обладает [23, 81, 158]. Препараты из пятилистника кустарникового оказывают терапевтическое влияние на течение экспериментального диабета у животных, что выражалось в снижении уровня глюкозы в крови [29]. Были установлены радиозащитное и противовоспалительное, бактерицидное [134], тромбопластическая активность [188] препаратов из курильского чая.
В клинической практике отвар из надземных органов курильского чая используется при дисбактериозе. Отмечено его антитоксическое действие при пищевых отравлениях, выявлен легкий желчегонный эффект. Кроме того, курильский чай издавна пользуется популярностью у народов Сибири и Дальнего Востока как повседневный напиток - заменитель чая [169, 209].
Целесообразность выбора композиции, состоящей из названных лекарственных растений подтверждена фармакологическими исследованиями, проведенными в лаборатории экспериментальной фармакологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. При изучении его специфической активности, установлена антиоксидантная, иммуномодулирующая, адаптогенная, актопротекторная активность полученного средства [96].
Разработка методики количественного определения суммы восстанавливающих моносахаров ПСК растительного сбора
Из данных литературы установлено, что во многих компонентах сбора (корнях родиолы, левзей, девясила, цветках календулы, побегах курильского чая и др.) содержатся полисахариды (ПС) [136]. Известно, что они проявляют иммуностимулирующую, противоопухолевую активность, это обусловлено их способностью активировать Т-лимфоциты, систему комплимента, увеличивать продукцию интерферона, повышать функциональную активность лизосомальных ферментов. ПС являются потенциальными ингибиторами аллергических и воспалительных реакций, отмечается гипогликемическое действие, также они используются для лечения заболеваний вызванных ретровирусами, выведения из организма радиоактивных элементов [130, 199].
В настоящее время для , количественного определения содержания полисахаридов в растительном сырье используют ряд методов [38, 75, 85, 192, 247]. В Государственной фармакопее принят гравиметрический метод количественного определения полисахаридов [ГФ XI, вып. 2, ст. 20].
Для разработки методики количественного содержания восстанавливающих Сахаров в составе полисахаридного комплекса (ПСК) многокомпонентного сбора, был использован метод спектрофотометрии, основанный на способности моносахаридов, образовавшихся после гидролиза ПСК, восстанавливать в щелочной среде пикриновую кислоту до пикрамовой. За основу принята методика количественного определения полисахаридов в траве мать-и-мачехи [28].
Для определения влияния типа экстрагента на выход полисахаридов (ПС) из растительного сбора использовали гравиметрический метод определения полисахаридов из ГФ XI. Результаты анализа представлены в таблице 4.2.18.
Для исключения влияния сопутствующих биологически активных веществ-сапонинов и флавоноидов, которые являются гликозидами и могут искажать результаты количественного определения моносахаров, образовавшихся после гидролиза ПС комплекса, применяли метод последовательной экстракции спиртом этиловым и водой.
1,0 (точная навеска) растительного сбора заливали последовательно 100 мл 70% спирта этилового и водой очищенной, нагревали на кипящей водяной бане в течение 45 минут. В результате получали три извлечения: первую и вторую экстракцию проводили 70% спиртом этиловым, в котором ПС не растворяются (извлечения 1, 2), а для извлечения ПС проводили третью экстракцию водой очищенной (извлечение 3). Полученные экстракты 1, 2, 3 фильтровали, концентрировали, остаток растворяли в 95% спирте этиловом и анализировали методом тонкослойной хроматографии на присутствие в них сапонинов и флавоноидов.
Для обнаружения сапонинов на линию старта пластин «Silufol» наносили по 0,05 мл растворов, хроматографировали восходящим способом в системе растворителей VII. В качестве детектирующего реагента использовали 20% раствор кислоты серной. Фронт растворителя 90 мм. На хроматограмме (см. рис.4.2.6) отмечалось уменьшение интенсивности окраски пятен во втором образце по сравнению с первым и отсутствие пятен в третье образце, что свидетельствует об эффективности данного метода очистки для сапонинов.
Для проверки эффективности очистки извлечения от флавоноидов, аналогично хроматографировали три извлечения на пластинках «Silufol» в системе растворителей I. После проявления хроматограммы 5% спиртовым раствором алюминия хлорида установлено, что в водном извлечении флавоноиды отсутствуют (см. рис.4.2.7).
Для методики количественного определения суммы ПС рекомендуем использовать последовательно трехкратную экстракцию растительного сбора: первую и вторую 70% спиртом этиловым для очистки от сопутствующих соединений и третью водой очищенной для количественного определения ПС.
Поскольку растительный сбор многокомпонентный и сырье является неоднородным, то принято для устранения ошибки результата единичного определения измельчить аналитическую пробу сырья до размеров частиц 0,5-1 мм.
Используя воду в качестве экстрагента, подобрано оптимальное соотношение сырье-экстрагент, для анализа использовали гравиметрический метод определения полисахаридов предложенном ГФ XI в ст. 20. Результаты представлены в таблице 4.2.19.
Наиболее оптимальным является соотношение 1:70.
Подобрано время нагревания на водяной бане и кратность экстракции I фаза-15, 30, 45, 60 минут, II фаза-15 минут, III фаза-15 минут при соотношении сырье -экстрагент 1:70. Результаты представлены в таблице 4.2.20.
Исследования показали, что при использовании метода двукратной экстракции I фаза-30 минут, II фаза-15 минут извлечение ПС из растительного сбора происходит полностью.
Для подбора оптимальных условий гидролиза полисахаридного комплекса до моносахаридов, испытаны различные концентрации кислоты хлористоводородной. Полноту гидролиза контролировали методом нисходящей хроматографии на бумаге в системе растворителей VI. Гидролизаты нейтрализовали бария карбонатом, обрабатывали катионитом КУ-1 (в ЕҐ-форме), затем концентрировали и хроматографировали. Обнаружение Сахаров осуществляли анилинфталатным реактивом. Установлено, что гидролиз полисахаридного комплекса 9% кислотой хлористоводородной в объеме 5 мл завершался через 10 минут при 100С.
Полученный гидролизат ПС комплекса хроматографии на бумаге в системе растворителей VI параллельно с РСО глюкозы, в результате обнаружено пятно, показатель Rf которого совпал с таковым глюкозы.
Для методики количественного определения ПС в сборе в качестве стандартного образца использовали рабочий стандартный образец глюкозы.
Спектры поглощения полученных восстанавливающих моносахаров с кислотой пикриновой в щелочной среде имеют максимум поглощения при 470 нм.
Количественное определение суммы восстанавливающих моносахаров ПСК жидкого экстракта «Тантон»
В основу методики количественного определения суммы восстанавливающих моносахаров ПСК положен аналогичный метод разработанный для исходного растительного сбора. Установлено, что спектры поглощения продуктов гидролиза жидкого экстракта «Тантон» и раствора РСО глюкозы с кислотой пикриновой в щелочной среде совпадают и имеют максимум при длине волны 470 нм.
Для очистки жидкого экстракта «Тантон» от флавоноидов использовали колонку с алюминия оксидом. Экспериментально подбирали необходимое количество, используя 4, 6, 8 и 10 г алюминия оксида. Полноту осаждения контролировали с помощью качественных реакций на флавоноиды, которые проводили для жидкого экстракта, прошедшего через колонку. В результате установлено, что при использовании 10 г алюминия оксида флавоноиды осаждаются полностью. Для промывки колонки использовали 4, 6, 8, 10 и 12 мл 40% спирта этилового. Полученную в результате прохождения колонки промывную жидкость исследовали на наличие оставшихся на сорбенте ПС, методом гидролиза полисахаридного комплекса 1 мл кислоты хлористоводородной концентрированной. Установлено, что гидролиз полисахаридного комплекса завершался через 10 минут при 100С. Гидролизаты нейтрализовали бария карбонатом, обрабатывали катионитом КУ-1 (в ГҐ-форме), затем концентрировали и хроматографировали методом нисходящей хроматографии на бумаге в системе растворителей VI. Обнаружение Сахаров осуществляли- анилинфталатным реактивом. Установлено, что для промывки колонки достаточно 10 мл 40% спирта этилового.
Далее для осаждения сапонинов использовали 10% раствор свинца ацетата (основного). Раствор добавляли по каплям в очищенный от флавоноидов жидкий экстракт до прекращения образования осадка, в результате потребовалось около 2 мл 10% раствора свинца ацетата (основного) при условии отстаивания экстракта в течение 30 минут.
Осаждение свинца ацетата (основного) осуществляли кислотой хлористоводородной концентрированной, добавляя ее по каплям в полученный экстракт до исчезновения образования взмученного белого осадка в слое жидкости.
Для подбора оптимальных условий гидролиза полисахаридного комплекса до моносахаридов, к 20 мл извлечения прибавляли 5 мл кислоты хлористоводородной концентрированной до получения разбавленного раствора кислоты хлористоводородной. Полноту гидролиза контролировали методом, описанным в разработке методики количественного определения суммы восстанавливающих Сахаров ПСК в растительном сборе. В результате установлено, что гидролиз полисахаридного комплекса 9% кислотой хлористоводородной в объеме 2 мл завершался через 10 минут при 100С.
Экспериментально установлено время проведения восстановительной реакции моносахаров с 1% раствором кислоты пикриновой-комплекс становится устойчивым через 70 минут.
Полученные в ходе экспериментов оптимальные параметры легли в основу методики количественного определения суммы полисахаридов в жидком экстракте «Тантон» и приведены в описании методики. Методика определения суммы восстанавливающих моносахаров ПСК в жидком экстракте «Тантон» 30 мл жидкого экстракта «Тантон» пропускают через колонку с 10 г алюминия оксида, колонку промывают 10 мл 40% спирта этилового, затем проводят осаждение сапонинов 10% раствором свинца ацетата (основного), раствор добавляют по каплям до прекращения образования осадка, оставляют для отстаивания в течение 30 минут, затем для контроля полноты осаждения добавляют еще 1-2 капли ацетата свинца (основного). Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр. Осадитель удаляют добавлением концентрированной кислоты хлористоводородной в количестве около 1 мл, раствор центрифугируют в течение 15 минут со скоростью 3000 об/с, надосадочную жидкость сливают в мерную колбу объемом 50 мл и водой доводят объем до метки. Из мерной колбы берут 20 мл раствора, добавляют 5 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревают при 100 С на водяной бане с обратным холодильником в течение 10 минут, после раствор охлаждают и нейтрализуют 40% раствором щелочи до значения рН 4,0-5,0, измерение проводят на лабораторном иономере. Далее раствор сливают в мерную колбу объемом 100 мл и доводят объем водой до метки (раствор А). В две конические колбы объемом 50 мл добавляют по 2,5 мл 1% раствора кислоты пикриновой, 7,5 мл 20% раствора натрия карбоната, в первую добавляют 1 мл раствора А, во вторую 1 мл воды, ставят на кипящую водяную баню на 10 минут, затем растворы охлаждают и помещают их в мерные колбы объемом 25 мл, доводят объем водой до метки и измеряют оптическую плотность через 70 минут на СФ-46 при длине волны 470 нм. Содержание суммы полисахаридов (X) в процентах в пересчете на глюкозу вычисляют по формуле
Относительная ошибка единичного определения суммы полисахаридов в жидком экстракте «Тантон» не превышает 4,2%.
Для проверки, отсутствия систематической ошибки проведены эксперименты с добавкой РСО глюкозы в пробу исследуемого образца экстракта. Результаты представлены в таблице 6.2.45.
Данные таблицы свидетельствуют, что относительная ошибка методики находится в пределах случайной ошибки разработанного метода, и подтверждают отсутствие систематической ошибки.
