Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время прямыми методами расшифровки структуры ферментов являются рентгеноструктурный анализ (РСА) и ЯМР. Оба метода исключительно трудоемки и позволяют получить данные о структуре лишь нескольких вариантов фермента и их комплексов с субстратами или эффекторами. Расшифровка структуры фермента является необходимым, но недостаточным условием понимания деталей каталитического механизма. Во многих случаях требуются серьезные исследования по кинетике действия многочисленных мутантных форм фермента. При отсутствии данных по кристаллической структуре каждого из мутантов сравнение их каталитических свойств и делаемые на этой основе выводы о роли отдельных аминокислотных остатков в катализе предполагают принципиальную неизменность сворачивания белковой глобулы вне зависимости от введенных мутаций. Однако такое предположение не всегда правомерно, особенно если речь идет об аминокислотных остатках, выполняющих структурную роль, таких, как, например, пролин и триптофан. Поэтому разработка достаточно простых и быстрых методов, позволяющих разграничить и оценить структурные и каталитические изменения, вызванные мутациями, является принципиальной для установления механизмов ферментативного катализа. Одна из существующих проблем при исследовании ферментов и белков состоит в том, что кристаллическая структура в большинстве случаев получена для их рекомбинантных форм. Рекомбинантные белки не являются точным повторением нативных белков, поскольку их синтез, а в ряде случаев и фолдинг, происходят в условиях, далеких от природных. При получении активных белков в чужеродных организмах в большинстве случаев изменяется пост-трансляционная модификация, а при проведении рефолдинга белков из телец включения (т.е. искусственного фолдинга) принципиально возможно появление конформаций, отличающихся от нативной. Разработка и применение новых, более доступных, чем РСА и ЯМР, подходов, позволяющих сопоставлять структуру и свойства нативных и рекомбинантных форм одного и того же белка, а также выявлять структурно-функциональные различия, вносимые направленным мутагенезом, представляет и фундаментальный, и практический интерес. Цели и задачи исследования. Настоящая работа посвящена разработке методов структурно-каталитической характеристики ферментов на основе использования ионизирующей радиации, в частности для получения взаимозависимости структура-функция для нативной пероксидазы хрена и ее рекомбинантных форм. Пероксидаза хрена традиционно применяется в качестве метки в иммуноферментном анализе (ИФА). На основе метода ИФА разрабатываются и внедряются в медицинскую практику тест-
системы для определения различных веществ, таких как гормоны, онкомаркеры, аутоантитела, иммуноглобулины, лекарственные соединения и т. д. Иммуноферменгные наборы используются для целей лабораторной диагностики инфекционных, аллергических и других видов заболеваний, для осуществления лекарственного мониторинга. Так, например, для оценки функционального состояния щитовидной железы в медицине широко применяются ИФА-наборы для количественного определения тиреотропного гормона, тироксина (общего и свободного), трийодтиронина, тиреоглобулина и антител к нему.
Целью данной работы является характеристика структурно-каталитических свойств нативной и рекомбинантных форм пероксидазы хрена и исследование их конформационных различий с помощью методов радиационной инактивации и термической активации трития.
Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:
-
получение высокоочищенной активной рекомбинантной пероксидазы, сравнительное изучение каталитических и структурных свойств рекомбинантного и нативного ферментов методами радиационной инактивации и термической активации трития;
-
получение мутантных форм фермента с заменой основных каталитических и структурных аминокислотных остатков и изучение их методами химической кинетики и радиационной инактивации;
-
изучение влияния ионного микроокружения (ионы кальция и магния) на радиационную инактивацию ряда нативных пероксидаз растений (пероксидаза арахиса - ПА, пероксидаза сои - ПС, пероксидаза табака - ПТ и пероксидаза хрена - ПХ).
Научная новизна Впервые с помощью метода радиационной инактивации показано влияние способа очистки рекомбинантного фермента на его конформацию. Впервые продемонстрирована активация пероксидаз под действием радиации.
Метод термической активации трития был применен для сравнительной характеристики нативного и рекомбинантного фермента. Сравнение данных по включению трития в нативный и рекомбинантный ферменты наглядно демонстрирует различия в их доступной поверхности и, следовательно, конформации. Важным является различие, которое проявляется в доступности остатков гистидина, формирующих активный центр фермента и недоступных растворителю по расчетным данным кристаллической структуры, и остатков аргинина. Доступность гистидина в обоих случаях оказалась выше, чем расчетная.
Показано, что олигосахаридные остатки, связанные с нативным ферментом, защищают фермент от инактивации радикальными частицами продуктов радиолиза воды. Продемонстрирована схожесть механизмов
инактивации фермента в ходе реакции (пероксидом водорода и радикалами окисленного субстрата) и в процессе радиолгоа. Впервые показано специфическое влияние ионов магния на радиационную стабильность, а следовательно, и структуру различных пероксидаз.
Практическая значимость работы. Показана возможность использования метода радиационной инактивации для сравнительной характеристики нативных и рекомбинаитных форм ферментов. Продемонстрирована эффективность метода термической активации трития для сравнительной структурной характеристики разных форм фермента. Особенно важно, что данный метод может быть использован для установления идентичности структур рекомбинаитных и нативных препаратов белков, используемых в медицинских целях. Принципиальным для медицины является также возможность применения данного метода для характеристики полипептидных гормонов, физиологическое действие которых основано на распознавании их конформации гормональными рецепторами. Также показано, что сравнительно малые дозы радиации (in vitro) могут как инактивировать, так и активировать ферменты.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на заседании кафедры химической энзимологии Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова, научного семинара кафедры радиохимии Химического факультета МГУ, на международных конференциях «Биокатализ-1995» (Суздаль), «Биокатализ-1998» (Пущино), на IV международном симпозиуме «Plant Peroxidases: Biochemistry and Physiology» (Вена, Австрия, 1996) и на V международном симпозиуме «Peroxidase'99» (Колумбус, Огайо, США, 1999).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 3 тезисов докладов, а также 1 статья принята в печать,
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 127 страницах, содержит 11 таблиц и 30 рисунков. Список литературы включает 170 ссылок.
